Summary
Glukosupptaget ökar i Drosophila motoriska nervceller som påverkas av TAR DNA-bindande protein (TDP-43) proteinopati, vilket indikeras av en FRET-baserad, genetiskt kodad glukossensor.
Abstract
Amyotrofisk lateral skleros är en neurodegenerativ sjukdom som orsakar progressiva muskel svaghet och död inom 2-5 år efter diagnos. Kliniska manifestationer inkluderar viktminskning, dyslipidemi och hypermetabolism; det är dock fortfarande oklart hur dessa relaterar till motor neuron degeneration. Med hjälp av en Drosophila modell av TDP-43 proteinopati som rekapitulerar flera funktioner i ALS inklusive cytoplasmic införanden, locomotor dysfunktion och minskad livslängd, identifierade vi nyligen omfattande metaboliska underskott. Bland dessa konstaterades glykolys vara uppreglerad och genetiska interaktion experiment gav bevis för en kompensatorisk neuroprotektiv mekanism. Trots uppreglering av phosphofructokinase, den hastighetsbegränsande enzym i glykolys, en ökning av glykolys med hjälp av kost och genetiska manipuleringar visade sig mildra locomotor dysfunktion och ökad livslängd i flug modeller av TDP-43 proteinopati. För att ytterligare undersöka effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytiskt flöde i motoriska nervceller, användes en tidigare rapporterad genetiskt kodad, FRET-baserad sensor, FLII12Pglu-700μδ6. Denna sensor består av en bakteriell glukosavkännande domän och cyan och gula fluorescerande proteiner som FRET-paret. Vid glukosbindning genomgår sensorn en konformationsförändring som gör att FRET kan uppstå. Med hjälp av FLII12Pglu-700μδ6 konstaterades glukosupptag ökas avsevärt i motoriska nervceller som uttrycker TDP-43G298S, en ALS orsakar variant. Här visar vi hur man mäter glukosupptag, ex vivo, i larv ventrala nervkabelpreparat som uttrycker glukossensorn FLII12Pglu-700μδ6 i samband med TDP-43-proteinopati. Detta tillvägagångssätt kan användas för att mäta glukosupptag och bedöma glykolytiskt flöde i olika celltyper eller i samband med olika mutationer som orsakar ALS och relaterade neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som för närvarande är obotlig. ALS påverkar övre och nedre motoriska nervceller som leder till förlust av motorisk samordning, irreversibel förlamning, andningssvikt och eventuell död inom 2-5 år efter diagnos1. ALS är associerad med metaboliska defekter som viktminskning, dyslipidemi och hypermetabolism (ses över i2); det är dock fortfarande oklart hur dessa förändringar i ämnesomsättningen relaterar till motor neuron degeneration. En gemensam nämnare i ALS och relaterade neurodegenerativa sjukdomar är TDP-43, ett nukleinsyrabindande protein som är involverat i flera steg av RNA-bearbetning3,4,5. Även om mutationer i TDP-43 endast påverkar 3%-5% av patienterna, finns wild-typ TDP-43 protein inom cytoplasmiska aggregat i >97% av ALS fall (ses i6). Denna patologi modellerades i Drosophila genom överuttryck av mänsklig vildtyp eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriska nervceller, som rekapitulerar flera aspekter av ALS, inklusive cytoplasmiska inneslutningar, lokomotorisk dysfunktion och minskad livslängd7,8. Med hjälp av dessa modeller rapporterades nyligen att TDP-43 proteinopati orsakar en betydande ökning av pyruvatnivåer och phosphofructokinase (PFK) mRNA, det hastighetsbegränsande enzymet av glykolys9. Liknande ökningar i PFK transkript hittades i patientens-härledda motor nervceller och ryggmärg, vilket tyder på att glykolys är uppreglerad i samband med TDP-43 proteinopati. Intressant nog mildrade ytterligare ökning av glykolys med hjälp av kost och genetiska manipuleringar flera ALS-fenotyper såsom lokomotorisk dysfunktion och ökad livslängd i flugmodeller av TDP-43 proteinopati, i överensstämmelse med en kompensatorisk, neuroprotektiv mekanism i degenererande motoriska nervceller.
För att ytterligare undersöka förändringar i glykolys och mäta glukosupptag i Drosophila modeller av TDP-43 proteinopati, uttrycktes en tidigare rapporterad genetiskt kodad FRET-baserade sensor FLII12Pglu-700μδ610 i motor nervceller specifikt med hjälp av UAS-GAL4 uttryckssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukossensor använder resonansenergiöverföring mellan två varianter av grönt fluorescerande protein, cyan och gula fluorescerande proteiner (CFP och YFP) för att detektera glukos på cellnivå. Den består av en bakteriell glukosbindningsdomän från E. coli MglB-genen smält till CFP och YFP i motsatta ändar av molekylen. När den är bunden till en glukosmolekyl genomgår sensorn en konformationell förändring som för CFP och YFP närmare varandra och tillåter FRET att uppstå, som sedan kan användas för att kvantifiera intracellulära glukosnivåer10,11,12 ( figur1). Här visar vi hur FLII12Pglu-700μδ6-sensorn kan användas för att bestämma förändringar i glukosupptaget som orsakas av TDP-43-proteinopati i motoriska nervceller. Experimenten som beskrivs här visar att överuttryck av en ALS-associerad mutant, TDP-43G298S, i motoriska nervceller orsakar en betydande ökning av glukosupptag jämfört med kontroller. Detta tillvägagångssätt kan användas i andra typer av ALS (t.ex. SOD1, C9orf72, etc.) och/eller andra celltyper (t.ex. glia, muskler) för att bestämma förändringar i glukosupptag i samband med neurodegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgena flugor rapporterades i Volkenhoff et al.10 och vänligen tillhandahålls av Dr. S. Schirmeier. UAS TDP-43G298S transgena linjer tillhandahölls vänligt av Dr. T. Iwatsubo13. Rekombinanta Drosophila linjer som hyser både UAS FLII12Pglu-700μδ6 och UAS TDP-43 transgener genererades i Zarnescu laboratoriet med hjälp av standard genetiska metoder och rapporterades i Manzo et al.9. D42 GAL4 användes för att driva uttrycket av glukossensorn ensam eller tillsammans med TDP-43G298S i motoriska nervceller. Alla fluglinjer hålls på melass majsmjölsmedium, vid 25 °C i 12 h mörk: ljuscykel.
1. Drosophila Ventral Nervkabel (VNC) dissektioner
- Gör silikon elastomer dissekeringsrätter.
- Häll silikonelastomerkomponenter i ett 50 ml-rör enligt tillverkarens protokoll och rör om väl.
- Fyll 35 mm vävnadsodlingsfat med cirka 2 ml elastomerblandningen. Använd en spruta för att ta bort eventuella bubblor. Täck disken och placera dem på en plan yta i en ugn på 60 °C över natten för att härda.
- Dissekera Drosophila larver för att exponera VNC samtidigt upprätthålla vävnad livskraft.
- Samla en vandrande tredje instar larva, skölj med ddH2O och placera den sedan i en droppe HL3-buffert (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3,115 mM sackaros, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) på en elastomerfodrad maträtt.
- Använd ett par tångar (# 5 eller 55 tång) under ett dissekerande mikroskop, fäst larvens främre och bakre ändar på larvens dorsala sida uppåt och sträcker försiktigt larven på längden med insektsstift (Minutein Pins).
- Gör ett snitt precis ovanför den bakre stiftet med ett par vinklade iris saxar. Gör ett vertikalt snitt som börjar från snittet mot larvens främre ände.
- Tillsätt några droppar HL-3 buffert om det behövs. Ta bort luftstrupen och resten av de flytande organen utan att störa CNS. Fäst klaffarna som sträcker sig över kroppsväggen för att exponera CNS samtidigt som det neuromuskulära systemet (VNC, axoner och neuromuskulära korsningar) hålls intakta.
2. Bildförvärv
- Optimera bildparametrarna.
- Slå på mikroskopet och lasrarna innan dissekeringar påbörjas. Bilder måste förvärvas med hjälp av ett upprätt konfokalt mikroskop med en 40x vattensänkningslins. Använd en 405 nm laser för att excitera CFP och förvärva bilderna i både CFP (465-499 nm) och FRET (535-695 nm) detekteringskanaler.
- Optimera anskaffningsparametrar som skanningshastighet (6), medelvärde (2), mål (40x), zoom (1x), pinhole size (1 AU) och rumslig upplösning (512 x 512). Justera förstärkningen så att signalen är i det optimala dynamiska området. Samma parametrar måste användas för alla genotyper.
- Bildmotoriska nervceller inom VNC.
- Placera silikonfatet med det dissekerade provet under objektivet. Sänk linsen så att den kommer i kontakt med trehalose-sackaros HL3-bufferten (se 1.2.1). Det är viktigt att se till att objektivet är helt nedsänkt i bufferten. Lägg till mer buffert om det behövs.
- Använd CFP- och FRET-kanalerna för att manuellt välja en optisk sektion som består av minst 6 motoriska nervceller i fokus, som ligger längs VNC-mittlinjen. De motoriska nervcellerna identifieras baserat på uttrycket av glukossensorn och positionen längs den främre bakre axeln.
- Skaffa bilder var 10: e s i 10 min. Dessa bilder representerar baslinjen.
- Stimulera med glukos kompletterad HL-3.
- Ta bort trehalose-sackaros som innehåller HL3-buffert med en Pasteur pipette och ersätt den med 5 mM glukos kompletterad HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM sackaros, 5 mM glukos, 5 mM HEPES, pH 7.1). Detta steg måste utföras med stor omsorg, för att undvika rörelsen av VNC så mycket som möjligt.
- Skaffa bilder var 10: e s i ytterligare 10 min. Dessa bilder representerar stimuleringsfasen.
- Spara bilderna som .czi-filer eller någon filtyp som stöds av bildbehandlingsprogramvaran med ett filnamn inklusive datum, genetisk bakgrund, experimentellt tillstånd (baslinje eller stimulering) och kanaler som används.
- Återanvänd parametrarna för att avbilda alla genotyper (bild 2A).
3. Bildbehandling och ROI-val
- Öppna czi-filerna i Fiji/ImageJ och ange Färgläge: Gråskala, välj Visa stack med: Hyperstackoch välj Dela kanaler i Separata Fönster.
- Bearbeta bilder med hjälp av plugins för driftkorrigering: turboreg och stackreg. Varje kanal korrigeras separat genom att välja Stackreg under Pluginsoch välj sedan Transformation: Translation.
- Välj manuellt de regioner av intresse (ROIs) för att extrahera medelvärdet grå värde för varje kanal.
- Välj ROI genom att spåra alla motoriska nervceller som förblir i fokus under hela tidsserien. Använd ROI-hanteraren för att spara varje motorisk neuronkontur.
- Använd funktionen Multi-measure för att mäta medelvärdet för grått värde i varje ROI vid varje tidpunkt. Kopiera rom-rou-bilderna som spåras från den första kanalen till den andra kanalen för bilden före stimulering.
- Upprepa den här processen för bilderna efter stimuleringen i varje kanal med samma celler/ROI som valts för bilden före stimulering.
4. Dataanalys
- Beräkna förhållandet FRET/CFP med hjälp av medelvärdet grå värden för FRET- och CFP-kanalerna. Förändringar i FRET/CFP-kvoterna återspeglar förändringar i den intracellulära glukoskoncentrationen.
- Plot FRET/CFP-förhållanden för varje ROI och tidspunkt kontra tid. Inom varje VNC kommer några av ROIs att uppvisa en minskning av FRET / CFP-förhållanden efter stimulering.
OBS: Detta tolkas som en oförmåga hos vissa nervceller att ta upp glukos, möjligen på grund av stress orsakad av dissekeringar och elimineras därför från analysen. De återstående FRET/CFP-kvoterna för varje ROI och tidspunkt är genomsnittliga för att generera ett enda FRET/ CFP-förhållande per tidspunkt per genotyp (glukossensor ensam och glukossensor med TDP-43G298S). Dessa enskilda FRET/CFP-förhållanden används för alla efterföljande normaliseringar. 31 ROIs analyserades för glukossensorkontroller och 24 ROIs analyserades för TDP-43G298S.
- Plot FRET/CFP-förhållanden för varje ROI och tidspunkt kontra tid. Inom varje VNC kommer några av ROIs att uppvisa en minskning av FRET / CFP-förhållanden efter stimulering.
- Normalisering vid baslinjen: Beräkna medelvärdet av FRET/CFP-förhållanden för de första 10 minuterna (baslinjen) och normalisera sedan enskilda FRET/CFP-förhållanden för varje tidpunkt för hela experimentet till 10 minuters baslinjegenomsnitt (se figur 2B).
- Tidspunktsnormalisering: Normalisera TDP-43G298S FRET/CFP-förhållanden till FRET/CFP-förhållanden enbart från glukossensorn ensam vid varje tidpunkt (se figur 3A).
- Stapeldiagram: För jämförelser mellan baslinjen och stimulering i form av stapeldiagram, använd FRET/CFP-förhållanden från 5-10 min (baslinje) och 15-20 min (stimulering) för varje genotyp. Normalisera stimuleringsförhållandet till utgångsvärdet (se figur 3B).
5. Statistiska analyser
- Utvärdera de normaliserade datamängderna med Hjälp av Mann-Whitney-korrigering (för normaliseringar vid baslinje och tidspunkt) eller Kruskall-Walis-test (för stapeldiagramrepresentation av stimulering jämfört med FRET/CFP-förhållanden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildförvärv av glukossensorn i ventralnerven (VNC), ex vivo
För att bestämma skillnader i glukosupptag i en Drosophila-modell av ALS baserat på TDP-43 användes en genetiskt kodad FRET-baserad glukossensor. Sensorn bestod av CFP och YFP smälte till glukosbindningsområdet från genen E. coli MglB. Glukosbindning framkallar en konformationell förändring, som kan detekteras genom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP 10,11,12. När glukos inte är bundet till sensorn orsakar CFP-excitation endast CFP-utsläpp, och när glukos binder kan YFP-signalen detekteras på grund av att FRET förekommer mellan CFP och YFP(figur 1A). D42 GAL4-drivrutinen användes för att uttrycka sensorn ensam eller tillsammans med DEN ALS-associerade mutanten TDP-43G298S i motoriska nervceller via bipartit UAS-GAL4 uttryckssystem14. Tredje instar larver dissekerades i HL3 buffert utan glukos och fäst att exponera neuromuskulära systemet, inklusive VNC fortfarande ansluten till neuromuskulära korsningar via motor neuron axons. VNC avbildades med hjälp av en 40x vatten nedsänkningslins med en rumslig upplösning på 512 x 512 pixlar (se protokoll och figur 1B). CFP och FRET signaler förvärvades i 465-499 nm respektive 535-695 nm, efter CFP excitation med 405 nm laser. Den skiva som ska avbildas valdes baserat på planet där VNC var synlig med minst sex motoriska nervceller i fokus längs mittlinjen. Det valda planet avbildades i 10 minuter och tog en bild var 10: e s för att bestämma baslinjen fluorescens. Czi-filerna sparades som: genotype_sample#_baseline. Efter 10 min tid kursen avslutades för baslinje villkor, bufferten ersattes med glukos kompletterad HL3. Bilden fokuserades om för att hitta samma plan som avbildades under baslinjeförhållanden. Samma bildinställningar användes för alla exempel. VNC avbildades sedan igen i 10 minuter förvärva en ny bild var 10: e s och sparas som: genotype_sample # _post stimulering för ytterligare analyser.
Bildanalys
En betydande utmaning med live imaging experiment är den drift som VNC genomgår under 20 minuters bildbehandlingsintervall. För att lösa det här problemet, ett plugin för driftkorrigering, användes Stackreg i FIJI före bildanalys och ROI-val (se Protokoll och figur 2A). 6-8 enskilda celler/ROIs valdes från varje VNC och beskrivs med hjälp av FRET/YFP-kanalen. Markeringarna kopierades till den gemensamma fiskeripolitikens kanal och medelvärdet grå värden mättes med hjälp av multimåttsfunktionen. Kvantifieringar utfördes genom att först beräkna FRET/CFP-kvoterna per tidspunkt och sedan beräkna genomsnittet för hela 10 min per genotyp. Dessa medelvärden användes sedan för att normalisera fret/cfp-kvoterna vid varje tidpunkt och ritades över tiden för att generera en första utvärdering av uppgifterna (figur 2B). Med hjälp av denna normaliseringsmetod konstaterades det att vid stimulering, kontrollera motoriska nervceller uttrycker glukossensor ensam, uppvisar en liten men betydande ökning av glukosupptag (3,9%,P-värde < 0,0001) medan motoriska nervceller uttrycker TDP-43G298S visar ett betydligt högre glukosupptag (16,76%,P-värde < 0,0001). Dessa data överensstämmer med TDP-43 proteinopati orsakar ökat glukosupptag i motoriska nervceller, som tidigare visats i referens9.
Dataanalyser - mätning av glukosupptag i motoriska nervceller i Drosophila VNC
För att få ytterligare insikter om skillnader mellan kontroller och TDP-43G298S mutanta motoriska nervceller normaliserades varje FRET/CFP-förhållande till kontrollen vid varje tidpunkt (figur 3A). Detta möjliggör en jämförelse av glukosupptag mellan ALS motoriska nervceller som uttrycker TDP-43G298S och styr motoriska nervceller som uttrycker glukossensorn ensam i realtid. Under utgångsvärdet fanns det ingen skillnad mellan genotyperna. Vid stimulering med glukos observerades dock en snabb (7,31% efter 1 min glukosapplikation) och signifikant ökning (12, 76% efter 10 min,P-värde < 0, 0001) i glukosupptag i TDP-43G298S jämfört med kontrollen.
Stapeldiagram erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt för att illustrera skillnader mellan genotyper (TDP-43G298S jämfört med kontroller) före och efter glukosstimulering (figur 3B). Detta gjordes genom att normalisera FRET/CFP förhållandet för båda villkoren till baslinjen för respektive genotyper och plotta medelvärdet för de sista 5 minuterna av baslinjen och stimulering imaging, respektive. Vid stimulering visar nervceller som uttrycker glukossensorn ensam en liten men betydande ökning av FRET/ CFP-förhållandet (3,83% ± 0,08%,P-värde < 0,0001) jämfört med baslinjen. Medan nervceller som uttrycker TDP-43G298S visade en betydande ökning av FRET/CFP-förhållandet vid stimulering (14,73% ± 0,08%,P-värde < 0,0001) jämfört med baslinjen. Nettoskillnaden i FRET/CFP-förhållanden mellan motoriska nervceller som uttrycker TDP-43G298S och glukossensorn ensam är 10,9%(P-värde = 0,005). Denna analys visar också att förhållandet stabiliseras runt de sista 5 minuterna av varje tidskursavbildning, så den här tidsramen valdes för diagrammet. Denna analys ger en översikt på hög nivå över resultaten, inklusive statistiskt signifikanta skillnader mellan genotyper och behandlingar i ett diagram.
Bild 1:FRET-sensor och bildförvärv. (A) FRET-baserat glukossensordiagram som används för att mäta glukosupptag i motoriska nervceller. Glukosbindning orsakar FRET. (B) Diagram över neuromuskulär korsning (NMJ) dissekering som visar område avbildat i VNC. Bilder till vänster som visar TDP-43G298S före och efter glukosstimulering i både FRET (YFP) och CFP-kanaler. Skalstänger: 20 μm. Förstoring: 40x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Bildanalys av glukossensor i samband med TDP-43 mutant. (A) Representativa bilder av FRET- och CFP-signaler i glukossensorkontroller och TDP-43G298S-prover under utgångs- och stimuleringsförhållanden. En representativ motorisk neuron beskrivs i varje bild som ett exempel på en ROI. Skalstänger: 20 μm. Förstoring: 40x. (B) De genomsnittliga förhållandet mellan FRET/CFP i glukossensor och TDP-43 mutantmotoriska nervceller över 20 min avbildning. Kvoterna normaliserades till det genomsnittliga baslinjeförhållandet för varje genotyp (se normalisering vid baslinjen i protokollet). Värden som visas är genomsnittet av 25-30 motoriska nervceller (ROI) från 5 VNCs per genotyp. Mann-Whitney användes för att utvärdera statistisk signifikans. =P-värde < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Dataanalys av glukossensor i samband med TDP-43G298S. (A) FRET/CFP-förhållanden på TDP-43G298S normaliseras till glukossensorkontroll vid varje tidpunkt. Mann-Whitney användes för att utvärdera statistisk signifikans. =P-värde < 0,0001. (B) Bargraf representation av glukosupptag i glukossensorkontroll och TDP-43G298S visar en betydande ökning av glukosupptaget i kontrollmotoriska nervceller vid stimulering och i samband med TDP-43G298S jämfört med kontroller. Kruskall-Walis användes för att utvärdera statistisk signifikans. ** =P-värde < 0,01, **** =P-värde < 0,0001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniken som beskrivs i detalj här kan tillämpas för att mäta glukosupptag i en specifik celltyp av intresse för levande Drosophila med FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-baserad sensor som kan upptäcka förändringar i glukosnivåer till ett millimolarområde10,11,12. Denna sensor har tidigare använts tillsammans med UAS-GAL4-systemet för att rikta dess uttryck till specifika celltyper, inklusive nervceller9,10. I denna studie användes D42 GAL4 för att uttrycka FLII12Pglu-700μδ6 på egen hand eller tillsammans med sjukdomsassocierad TDP-43G298S för att visa hur detta tillvägagångssätt kan användas för att utvärdera glukosupptag i ALS motoriska nervceller. Dessutom kan denna metod tillämpas brett för att avbilda en mängd fluorescerande sensorer i larven VNC.
Kritiska steg i protokollet inkluderar att maximera signal-till-brus-förhållandet. För detta ändamål fastställdes parametrar för bildförvärv så att fluorescensen inte övermättas och hela skalan av signalintensitet kan kvantifieras. Bildparametrar som förstärkning, skanningshastighet, pinhole size och zoom förblev oförändrade under hela studien. Experimenten utfördes under flera dagar; I varje experiment avbildades dock både genotyperna, dvs. kontrollerna och TDP-43G298S tillsammans för att ta hänsyn till variabilitet. Imaging Drosophila larval CNS med hjälp av en vatten nedsänkning lins kan ge upphov till optiska plan förändringar över tid. Försiktighet bör iakttas för att undvika drastiska förändringar i optiskt plan genom att använda tillräcklig buffert. Prover med fokusändringar kasserades.
Även om villkoren och parametrarna upprätthålls oförändrade under hela experimenten, kräver denna teknik en förändring i buffert under avbildning. Efter 10 minuters avbildning måste den glukosfria bufferten ersättas med glukos kompletterad HL-3 buffert, vilket kan ändra det optiska fokalplanet. Linsen måste fokuseras på samma fokalplan så att samma uppsättning celler avbildas före och efter glukostillskott. En delmängd av motor nervceller uppvisade en minskning av FRET/CFP förhållanden efter stimulering. Detta indikerar att vissa nervceller inte tar glukos, möjligen på grund av stress orsakad av dissekering och eliminerades från analysen.
ROI-urval, bildbehandling och kvantifiering utfördes med Fiji/ImageJ. Även om ROI väljs manuellt i den första bilden av serien, är det viktigt att korrigera mindre drift i tidsfördröjningsavbildning för att hålla ROI oföränderlig under hela bildserien. En öppen källkod drift korrigering plugin, Stackreg, användes för att redogöra för det här problemet.
Tillgängligheten av rätt excitationslaser är en stor begränsning av denna teknik. Även om 436 nm excitationslaser är idealisk för denna glukossensor, har vi visat att sensorn kan användas med 405 nm excitationslaser, som är mer allmänt tillgänglig. En annan begränsning till denna teknik är att den kan användas för att mäta glukosdynamik men inte absoluta glukoskoncentrationer. En potentiell alternativ strategi för att mäta absoluta glukosnivåer är iGlucoSnFR-TS, en livstids glukossensor, som kan kalibreras för att mäta absoluta glukoskoncentrationer15.
Glukos är en viktig energikälla i hjärnan och krävs för fysiologiska funktioner. Defekter i glukosmetabolismen har associerats med flera patologiska tillstånd (ses över i16). Drosophila är en kraftfull genetisk modell som används för att studera neurodegenerativa sjukdomar17. Det finns dock begränsade tekniker tillgängliga för att direkt mäta glukosnivåer i Drosophila. Denna FRET-baserade glukossensor ger ett direkt mått på intracellulära förändringar i glukosnivåerna. Trots vissa experimentella utmaningar och begränsningar kan denna sensor framgångsrikt användas för att studera glukosdynamik i specifika celltyper (t.ex. motoriska nervceller, glia, muskler) i olika sjukdomsmodeller, inklusive flera typer av ALS och relaterade neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Stefanie Schirmeier och Takeshi Iwatsubo för att de tillhandahåller Drosophila-stammar. Vi tackar också Patricia Jansma för att hon hjälpte till med avbildning i Marley Imaging Core vid University of Arizona. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (till DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (till EM) och Grundutbildningsbiologiforskningsprogrammet (till HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H.
