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Neuroscience

Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

A absorção de glicose é aumentada em neurônios motores Drosophila afetados pela proteína de ligação de DNA TAR (TDP-43), como indicado por um sensor de glicose à base de FRET, geneticamente codificado.

Abstract

A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa que causa fraqueza muscular progressiva e morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico. As manifestações clínicas incluem perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; no entanto, ainda não está claro como estes se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Usando um modelo de Drosophila de proteinopatia TDP-43 que recapitula várias características da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotor e redução da vida útil, recentemente identificamos amplos déficits metabólicos. Entre elas, verificou-se que a glicólise era regulada e os experimentos de interação genética forneceram evidências para um mecanismo neuroprotetor compensatório. De fato, apesar da regulação da fosfofructokinase, a taxa que limita a enzima na glicólise, um aumento da glicólise usando manipulações dietéticas e genéticas foi mostrado para mitigar a disfunção locomotor e o aumento da vida útil em modelos de moscas da proteinopatia TDP-43. Para investigar melhor o efeito sobre a proteinopatia TDP-43 no fluxo glicóglitico em neurônios motores, foi utilizado um sensor geneticamente codificado geneticamente, baseado em FRET, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor é composto por um domínio bacteriano de sensoriamento de glicose e proteínas fluorescentes ciano e amarela como o par FRET. Após a ligação de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional permitindo que o FRET ocorra. Utilizando FLII12Pglu-700μδ6, a absorção de glicose foi significativamente aumentada em neurônios motores expressando TDP-43G298S, uma variante causadora de ELA. Aqui, mostramos como medir a absorção de glicose, ex vivo,nas preparações do cabo do nervo ventral larval expressando o sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 no contexto da proteinopatia TDP-43. Essa abordagem pode ser usada para medir a absorção de glicose e avaliar o fluxo glicóltico em diferentes tipos de células ou no contexto de várias mutações que causam ELA e distúrbios neurodegenerativos relacionados.

Introduction

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva que atualmente é incurável. A ELA afeta neurônios motores superiores e inferiores levando à perda da coordenação motora, paralisia irreversível, insuficiência respiratória e eventual morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico1. A ELA está associada a defeitos metabólicos como perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado em2); no entanto, ainda não está claro como essas alterações no metabolismo se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Um denominador comum em ELA e doenças neurodegenerativas relacionadas é o TDP-43, uma proteína de ligação nucleica de ácido envolvida em várias etapas do processamento de RNA3,4,5. Embora as mutações no TDP-43 afetem apenas 3%-5% dos pacientes, a proteína TDP-43 de tipo selvagem é encontrada dentro de agregados citoplasmicos em >97% dos casos de ELA (revisados em6). Esta patologia foi modelada em Drosophila por superexpressão do tipo selvagem humano ou mutante TDP-43 (G298S) em neurônios motores, que recapitula múltiplos aspectos da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotora e redução da vida útil7,8. Usando esses modelos, foi recentemente relatado que a proteinopatia TDP-43 causa um aumento significativo nos níveis de piruvato e mRNA de fosfofructokinase (PFK), a enzima que limita a taxa da glicólise9. Aumentos semelhantes nas transcrições de PFK foram encontrados em neurônios motores derivados do paciente e medulas espinhais, sugerindo que a glicólise é regulada no contexto da proteinopatia TDP-43. Curiosamente, o aumento da glicolise usando manipulações dietéticas e genéticas mitigau vários fenótipos da ALS, como disfunção locomotor e aumento da vida útil em modelos de moscas de proteinopatia TDP-43, consistente com um mecanismo compensatório e neuroprotetor na degeneração de neurônios motores.

Para sondar ainda mais mudanças na glicólise e medir a absorção de glicose em modelos de Drosophila de proteinopatia TDP-43, um sensor baseado em FRET geneticamente codificado anteriormente FLII12Pglu-700μδ610 foi expresso em neurônios motores especificamente usando o sistema de expressão UAS-GAL4. O sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 utiliza a transferência de energia de ressonância entre duas variantes de proteína fluorescente verde, ciano e proteínas fluorescentes amarelas (CFP e YFP) para detectar glicose no nível celular. Consiste em um domínio de ligação de glicose bacteriana do gene E. coli MglB fundido a CFP e YFP em extremidades opostas da molécula. Quando ligado a uma molécula de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional aproximando o PCP e o YFP e permitindo que o FRET ocorra, que pode ser usado para quantificar os níveis de glicose intracelulares10,11,12 (Figura 1). Aqui, mostramos como o sensor FLII12Pglu-700μδ6 pode ser usado para determinar alterações na absorção de glicose causadas pela proteinopatia TDP-43 em neurônios motores. Os experimentos descritos aqui mostram que a superexpressão de um mutante associado à ALS, TDP-43G298S,em neurônios motores causa um aumento significativo na absorção de glicose em comparação com os controles. Essa abordagem pode ser usada em outros tipos de ELA (por exemplo, SOD1, C9orf72, etc.) e/ou outros tipos de células (por exemplo, glia, músculos) para determinar alterações na absorção de glicose associadas à neurodegeneração.

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Protocol

As moscas transgênicas UAS FLII12Pglu-700μδ6 foram relatadas em Volkenhoff et al.10 e gentilmente fornecidas pelo Dr. S. Schirmeier. As linhas transgênicas UAS TDP-43G298S foram gentilmente fornecidas pelo Dr. T. Iwatsubo13. As linhas recombinantes de Drosophila que abrigam tanto os transgênicos UAS FLII12Pglu-700μδ6 quanto uas TDP-43 foram gerados no laboratório Zarnescu utilizando abordagens genéticas padrão e relatados em Manzo et al.9. D42 GAL4 foi usado para conduzir a expressão do sensor de glicose sozinho ou junto com TDP-43G298S em neurônios motores. Todas as linhas de mosca são mantidas em mídia de farinha de milho de melaço, a 25 °C em ciclo escuro de 12 h: luz.

1. Dissecções do cabo nervoso ventral drosophila (VNC)

  1. Faça pratos de dissecção de elastômero de silicone.
    1. Despeje componentes de elastômero de silicone em um tubo de 50 mL, conforme indicado no protocolo do fabricante e mexa bem.
    2. Encha pratos de cultura de tecido de 35 mm com aproximadamente 2 mL da mistura de elastômero. Use uma seringa para remover quaisquer bolhas. Cubra os pratos e coloque-os em uma superfície nivelada em um forno de 60 °C durante a noite para curar.
  2. Disseque larvas de Drosophila para expor o VNC, mantendo a viabilidade tecidual.
    1. Colete uma terceira larva instar errante, enxágue com ddH2O, e depois coloque-o em uma gota de HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM de sacarose, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) em um prato forrado de elatômero.
    2. Usando um par de fórceps (#5 ou 55 fórceps) sob um microscópio dissecando, fixar as extremidades anterior e posterior do lado dorsal da larva para cima, esticando cuidadosamente a larva longitudinalmente com pinos de inseto (Pinos minutein).
    3. Faça uma incisão logo acima do pino posterior usando um par de tesouras de íris angulares. Faça um corte vertical a partir da incisão para a extremidade anterior da larva.
    4. Adicione algumas gotas de buffer HL-3, se necessário. Remova a traqueia e o resto dos órgãos flutuantes sem perturbar o CNS. Fixar os retalhos que esticam a parede do corpo para expor o CNS, mantendo intacto o sistema neuromuscular (VNCs, axônios e junções neuromusculares).

2. Aquisição de imagens

  1. Otimize os parâmetros de imagem.
    1. Ligue o microscópio e os lasers antes de iniciar as dissecções. As imagens devem ser adquiridas usando um microscópio confocal vertical com uma lente de imersão de água de 40x. Use um laser de 405 nm para excitar o CFP e adquirir as imagens tanto nos canais de detecção CFP (465-499 nm) quanto nos canais de detecção FRET (535-695 nm).
    2. Otimizar parâmetros de aquisição como velocidade de varredura (6), média (2), objetivo (40x), zoom (1x), tamanho do pinhole (1 UA) e resolução espacial (512 x 512). Ajuste o ganho de tal forma que o sinal esteja no intervalo dinâmico ideal. Os mesmos parâmetros devem ser utilizados para todos os genótipos.
  2. Neurônios motores de imagem dentro do VNC.
    1. Coloque o prato de silicone com a amostra dissecada sob a lente. Baixe a lente para que ela entre em contato com o tampão HL3 trehalose-sucrose (ver 1.2.1). É fundamental garantir que a lente esteja completamente submersa no buffer. Adicione mais buffer, se necessário.
    2. Use os canais CFP e FRET para selecionar manualmente uma seção óptica que consiste em pelo menos 6 neurônios motores em foco, localizados ao longo da linha média VNC. Os neurônios motores são identificados com base na expressão do sensor de glicose e posição ao longo do eixo anterior-posterior.
    3. Adquira imagens a cada 10 s por 10 minutos. Essas imagens representam a linha de base.
  3. Estimular com glicose suplementada HL-3.
    1. Remova a trehalose-sacarose contendo HL3-tampão usando uma pipeta Pasteur e substitua-a por 5 mM de glicose suplementada HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM de sacarose, 5 mM de glicose, 5 mM HEPES, pH 7.1). Essa etapa precisa ser realizada com muito cuidado, para evitar o movimento do VNC o máximo possível.
    2. Adquira imagens a cada 10 s por mais 10 minutos. Essas imagens representam a fase de estimulação.
  4. Salve as imagens como arquivos .czi ou qualquer tipo de arquivo suportado pelo software de imagem com um nome de arquivo, incluindo data, fundo genético, condição experimental (linha de base ou estimulação) e canais utilizados.
  5. Reutilizar os parâmetros para imagem de todos os genótipos(Figura 2A).

3. Processamento de imagens e seleção de ROI

  1. Abra os arquivos czi em Fiji/ImageJ e defina Modo de Cor: Escala de cinza,escolha Exibir pilha com: Hyperstacke selecione Canais divididos em Windows separado.
  2. Processe imagens usando os plugins de correção de deriva: turboreg e stackreg. Cada canal é corrigido separadamente selecionando Stackreg em Pluginse, em seguida, escolha Transformação: Tradução.
  3. Selecione manualmente as Regiões de Interesse (ROIs) para extrair o valor cinza médio de cada canal.
    1. Escolha os ROIs rastreando todos os neurônios motores que permanecem em foco durante toda a série temporal. Use o gerenciador de ROI para salvar cada contorno do neurônio motor.
    2. Use a função Multi-medida para medir o valor cinza médio em cada ROI em cada ponto de tempo. Copie os ROIs rastreados do primeiro canal para o segundo canal para a imagem de pré-estimulação.
    3. Repita este processo para as imagens pós-estimulação em cada canal usando as mesmas células/ROIs selecionadas para a imagem pré-estimulação.

4. Análise de dados

  1. Calcule a razão FRET/CFP, utilizando os valores cinza médios para os canais FRET e CFP. Alterações nas relações FRET/CFP refletem alterações na concentração de glicose intracelular.
    1. Plote as relações FRET/CFP para cada ROI e ponto de tempo versus tempo. Dentro de cada VNC, alguns dos ROIs apresentarão uma queda nas relações FRET/CFP após a estimulação.
      NOTA: Isso é interpretado como uma incapacidade de alguns neurônios de captar glicose, possivelmente devido ao estresse causado por dissecções e, portanto, são eliminados da análise. As demais razões FRET/CFP para cada ROI e ponto de tempo são mediadas para gerar uma única razão FRET/CFP por ponto de tempo por genótipo (sensor de glicose sozinho e sensor de glicose com TDP-43G298S). Estas únicas relações FRET/CFP são usadas para todas as normalizações subsequentes. Foram analisados 31 ROIs para controles de sensores de glicose e 24 ROIs para TDP-43G298S.
  2. Normalização da linha de base: Calcule a média das relações FRET/CFP para os primeiros 10 minutos (linha de base) e, em seguida, normalize as relações individuais de FRET/CFP para cada ponto de tempo de todo o experimento até a média da linha de base de 10 minutos (ver Figura 2B).
  3. Normalização do ponto de tempo: Normalizar as relações TDP-43G298S FRET/CFP para as relações FRET/CFP apenas a partir do sensor de glicose em cada ponto de tempo (ver Figura 3A).
  4. Gráficos de barras: Para comparações de linha de base versus estimulação na forma de gráficos de barras, use razões FRET/CFP de 5-10 min (linha de base) e 15-20 min (estimulação) para cada genótipo. Normalizar a razão de estimulação para a razão da linha de base (ver Figura 3B).

5. Análises estatísticas

  1. Avalie os conjuntos de dados normalizados usando correção Mann-Whitney (para normalização da linha de base e ponto de tempo) ou teste kruskall-Walis (para representação de gráfico de barras de estimulação versus taxas de FRET/CFP de linha de base).

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Representative Results

Aquisição de imagem do sensor de glicose no fio do nervo ventral (VNC), ex vivo
Para determinar diferenças na absorção de glicose em um modelo de Drosophila de ALS baseado no TDP-43, foi utilizado um sensor de glicose à base de FRET geneticamente codificado. O sensor era composto por CFP e YFP fundidos ao domínio de ligação de glicose do gene E. coli MglB. A ligação de glicose provoca uma alteração conformacional, que pode ser detectada por transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) entre o CFP e o YFP 10,11,12. Quando a glicose não está ligada ao sensor, a excitação cfp causa apenas emissão de CFP, e quando a glicose se liga, o sinal YFP pode ser detectado devido ao TRAS que ocorre entre CFP e YFP(Figura 1A). O driver D42 GAL4 foi usado para expressar o sensor sozinho ou junto com o mutante TDP-43G298S associado à ALS em neurônios motores através do sistema de expressão UAS-GAL4 bipartido14. Terceiras larvas instar foram dissecadas no tampão HL3 sem glicose e fixadas para expor o sistema neuromuscular, incluindo o VNC ainda conectado às junções neuromusculares através de axônios neurônios motores. O VNC foi imageado usando uma lente de imersão de água de 40x com uma resolução espacial de 512 x 512 pixels (ver Protocolo e Figura 1B). Os sinais CFP e FRET foram adquiridos nos sinais 465-499 nm e 535-695 nm, respectivamente, após excitação cfp com o laser de 405 nm. A fatia a ser imageda foi escolhida com base no plano onde o VNC era visível com um mínimo de seis neurônios motores em foco ao longo da linha média. O plano selecionado foi imageado por 10 minutos, capturando uma imagem a cada 10 s para determinar a fluorescência da linha de base. Os arquivos czi foram salvos como: genotype_sample#_baseline. Após a conclusão do curso de 10 minutos para condições de linha de base, o tampão foi substituído por HL3 suplementado com glicose. A imagem foi refocada para encontrar o mesmo avião que foi imageado sob condições básicas. As mesmas configurações de imagem foram utilizadas para todas as amostras. O VNC foi então imageado novamente por 10 minutos adquirindo uma nova imagem a cada 10 s e salvo como: genotype_sample#_post estímulo para novas análises.

Análise de imagem
Um desafio significativo com experimentos de imagem ao vivo é a deriva que os VNCs sofrem durante o intervalo de 20 minutos de imagem. Para resolver esse problema, um plugin de correção à deriva, stackreg foi usado em FIJI antes da análise de imagem e seleção de ROI (ver Protocolo e Figura 2A). 6-8 células/ROIs individuais foram selecionadas a partir de cada VNC e delineadas utilizando o canal FRET/YFP. As seleções foram copiadas para o canal CFP, e os valores cinzentos médios foram medidos utilizando-se a função multi-medida. As quantificações foram realizadas primeiro pela primeira média das relações FRET/CFP por ponto de tempo e, em seguida, calculando a média para todo o genótipo de 10 min por genótipo. Essas médias foram então utilizadas para normalizar as relações FRET/CFP em cada ponto de tempo e plotadas ao longo do tempo para gerar uma primeira avaliação dos dados (Figura 2B). Utilizando essa abordagem de normalização, verificou-se que, após a estimulação, controlar os neurônios motores que expressam apenas o sensor de glicose, apresentam um pequeno, mas significativo aumento na absorção de glicose (3,9%,valor P < 0,0001) enquanto os neurônios motores que expressam TDP-43G298S apresentam uma absorção de glicose significativamente maior (16,76%,valor P < 0,0001). Esses dados são consistentes com a proteinopatia TDP-43, causando aumento da absorção de glicose nos neurônios motores, como mostrado anteriormente na referência9.

Análises de dados - medição da captação de glicose em neurônios motores no VNC Drosophila
Para obter mais informações sobre as diferenças entre os controles e os neurônios motores mutantes TDP-43G298S, cada relação FRET/CFP foi normalizada para o controle em cada ponto de tempo(Figura 3A). Isso permite uma comparação na absorção de glicose entre neurônios motores ALS expressando TDP-43G298S e controlar neurônios motores expressando o sensor de glicose sozinho em tempo real. Sob condições básicas, não houve diferença entre os genótipos. No entanto, após a estimulação com glicose, observou-se um rápido (7,31% após 1 min de aplicação de glicose) e aumento significativo (12,76% após 10 min, ovalor P < 0,0001) na captação de glicose foi observado no TDP-43G298S quando comparado ao controle.

Os gráficos de barras oferecem uma abordagem alternativa para ilustrar diferenças entre genótipos (TDP-43G298S versus controles) antes e depois da estimulação da glicose(Figura 3B). Isso foi feito pela normalização da razão FRET/CFP para ambas as condições para a linha de base dos respectivos genótipos e traçando a razão média para os últimos 5 minutos de imagem de linha de base e estimulação, respectivamente. Após a estimulação, os neurônios que expressam apenas o sensor de glicose mostram um pequeno, mas significativo aumento na razão FRET/CFP (3,83% ± 0,08%,valor P < 0,0001) em comparação com a linha de base. Considerando que os neurônios que expressam TDP-43G298S apresentaram aumento significativo na relação FRET/CFP mediante estimulação (14,73% ± 0,08%,valor P < 0,0001) quando comparado com a linha de base. A diferença líquida nas relações FRET/CFP entre neurônios motores expressando TDP-43G298S e sensor de glicose sozinho é de 10,9%(valor P = 0,005). Esta análise também mostra que as proporções estabilizam em torno dos últimos 5 minutos de cada imagem de curso-tempo, de modo que este período de tempo foi escolhido para o gráfico. Esta análise fornece uma visão geral de alto nível dos resultados, incluindo diferenças estatisticamente significativas entre genótipos e tratamentos em um gráfico.

Figure 1
Figura 1: Sensor FRET e aquisição de imagem. (A) Diagrama de sensor de glicose à base de FRET usado para medir a absorção de glicose em neurônios motores. A ligação de glicose faz com que o TRASE ocorra. (B) Diagrama da dissecção de junção neuromuscular (NMJ) mostrando área imagem no VNC. Imagens à esquerda mostrando TDP-43G298S antes e depois da estimulação de glicose nos canais FRET (YFP) e CFP. Barras de escala: 20 μm. Ampliação: 40x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise de imagem do sensor de glicose no contexto do mutante TDP-43. (A) Imagens representativas de sinais FRET e CFP nos controles de sensores de glicose e amostras de TDP-43G298S sob condições de linha de base e estimulação. Um neurônio motor representativo é descrito em cada imagem como um exemplo de um ROI. Barras de escala: 20 μm. Ampliação: 40x. (B) As razões médias de FRET/CFP no sensor de glicose e neurônios motores mutantes TDP-43 acima de 20 minutos de imagem. As razões foram normalizadas para a razão média da linha de base para cada genótipo (ver normalização da linha de base no Protocolo). Os valores mostrados são a média de 25-30 neurônios motores (ROI) de 5 VNCs por genótipo. Mann-Whitney foi usado para avaliar a significância estatística. =Valor P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise de dados do sensor de glicose no contexto do TDP-43G298S. ( A )Asrazões FRET/CFP do TDP-43G298S são normalizadas para o controle do sensor de glicose em cada ponto de partida. Mann-Whitney foi usado para avaliar a significância estatística. =Valor P < 0,0001. (B) A representação do gráfico de barras da absorção de glicose no controle do sensor de glicose e do TDP-43G298S mostra um aumento significativo na absorção de glicose nos neurônios motores de controle na estimulação e no contexto do TDP-43G298S em comparação com os controles. Kruskall-Walis foi utilizado para avaliar a significância estatística. ** =Valor P < 0,01, **** =Valor P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A técnica descrita em detalhes aqui pode ser aplicada para medir a absorção de glicose em um tipo específico de interesse celular em Drosophila viva usando FLII12Pglu-700μδ6, um sensor baseado em FRET que pode detectar alterações nos níveis de glicose para uma faixa mililitro10,11,12. Este sensor foi usado anteriormente em conjunto com o sistema UAS-GAL4 para direcionar sua expressão para tipos celulares específicos, incluindo neurônios9,10. Neste estudo, d42 GAL4 foi utilizado para expressar FLII12Pglu-700μδ6 por conta própria ou junto com a doença associada ao TDP-43G298S para demonstrar como essa abordagem pode ser usada para avaliar a absorção de glicose em neurônios motores de ELA. Além disso, este método pode ser aplicado amplamente à imagem de uma infinidade de sensores fluorescentes no VNC larval.

As etapas críticas do protocolo incluem maximizar a relação sinal-ruído. Para isso, foram definidos parâmetros de aquisição de imagens de tal forma que a fluorescência não esteja supersaturada, e toda a intensidade do sinal possa ser quantificada. Os parâmetros de imagem, como ganho, velocidade de varredura, tamanho do pinhole e zoom permaneceram inalterados durante todo o estudo. Os experimentos foram realizados ao longo de vários dias; no entanto, em cada experimento, ambos os genótipos, ou seja, controles e TDP-43G298S foram imagens em conjunto para explicar a variabilidade. A imagem Drosophila larval CNS usando uma lente de imersão de água pode dar origem a mudanças de plano óptico ao longo do tempo. Deve-se tomar cuidado para evitar mudanças drásticas no plano óptico usando tampão suficiente. Foram descartadas amostras com alterações de foco.

Embora as condições e parâmetros sejam mantidos inalterados ao longo dos experimentos, esta técnica requer uma mudança no buffer durante a imagem. Após 10 minutos de imagem, o tampão livre de glicose deve ser substituído por tampão HL-3 suplementado com glicose, o que pode alterar o plano focal óptico. A lente deve ser refo focada no mesmo plano focal para que o mesmo conjunto de células seja imageado antes e depois da suplementação de glicose. Um subconjunto de neurônios motores apresentou uma queda nas relações FRET/CFP após a estimulação. Isso indica que alguns neurônios não captam glicose, possivelmente devido ao estresse causado pela dissecção e foram eliminados da análise.

A seleção do ROI, o processamento de imagens e a quantificação foram realizados utilizando-se Fiji/ImageJ. Embora o ROI seja selecionado manualmente na primeira imagem da série, é fundamental corrigir uma pequena deriva em imagens de lapso de tempo para manter o ROI invariável ao longo da série de imagens. Um plugin de correção de deriva de código aberto, Stackreg, foi usado para explicar esse problema.

A disponibilidade do laser de excitação certo é uma grande limitação para esta técnica. Embora o laser de excitação de 436 nm seja ideal para este sensor de glicose, mostramos que o sensor pode ser usado com o laser de excitação de 405 nm, que está mais amplamente disponível. Outra limitação para esta técnica é que ela pode ser usada para medir a dinâmica da glicose, mas não concentrações absolutas de glicose. Uma estratégia alternativa potencial para medir os níveis absolutos de glicose é o iGlucoSnFR-TS, um sensor de glicose vitalício, que pode ser calibrado para medir as concentrações absolutas de glicose15.

A glicose é uma grande fonte de energia no cérebro e é necessária para funções fisiológicas. Defeitos no metabolismo da glicose têm sido associados a várias condições patológicas (revisadas em16). Drosophila é um poderoso modelo genético usado para estudar distúrbios neurodegenerativos17. No entanto, existem técnicas limitadas disponíveis para medir diretamente os níveis de glicose em Drosophila. Este sensor de glicose baseado em FRET fornece uma medida direta de alterações intracelulares nos níveis de glicose. Apesar de alguns desafios experimentais e limitações, este sensor pode ser usado com sucesso para estudar a dinâmica da glicose em tipos de células específicas (por exemplo, neurônios motores, glia, músculos) em vários modelos de doenças, incluindo múltiplos tipos de ELA e distúrbios neurodegenerativos relacionados.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos a Stefanie Schirmeier e Takeshi Iwatsubo por fornecerem cepas de Drosophila. Agradecemos também a Patricia Jansma por ajudar com a imagem no Marley Imaging Core na Universidade do Arizona. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIH NS091299, NS115514 (para DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (para EM) e o Programa de Pesquisa em Biologia de Graduação (para HB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociência Edição 174 sensor de glicose ELA Drosophila TDP-43 proteinopatia
Medição da captação de glicose em <em>modelos de Drosophila</em> de Proteinopatia TDP-43
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Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

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