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Neuroscience

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

포도당 섭취량은 FRET 기반의 유전자 인코딩 된 포도당 센서에 의해 표시된 바와 같이 TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 단백질 병증에 의해 영향을받는 Drosophila 운동 뉴런에서 증가합니다.

Abstract

근위축성 측삭 경화증은 진단 후 2-5 년 이내에 진보적 인 근육 약점과 죽음을 일으키는 신경 퇴행성 질환입니다. 임상 증상은 체중 감소를 포함, 이상 지질 혈 증, 그리고 과대사; 그러나, 이러한 모터 뉴런 변성에 어떻게 관련 되어 불분명 남아. 세포질 내재, 운동 장애 및 수명 감소를 포함한 ALS의 여러 특징을 재구성하는 TDP-43 단백질 요법의 Drosophila 모델을 사용하여, 우리는 최근에 광범위한 신진 대사 적자를 확인했습니다. 이들 중, 글리코리시스는 조절되고 유전적 상호작용 실험이 보상 신경보호 메커니즘에 대한 증거를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 인산화루크토키나아제의 강화 규제에도 불구하고, 글리코리시스의 효소를 제한하는 속도, 식이 및 유전 적 조작을 이용한 글리코리시스의 증가는 TDP-43 단백질 요법의 비행 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명을 완화하는 것으로 나타났다. 모터 뉴런의 글리코리틱 플럭스에 대한 TDP-43 단백질 요법에 대한 효과를 더욱 조사하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩, FRET 기반 센서, FLII12Pglu-700μδ6이 사용되었다. 이 센서는 FRET 쌍으로 세균성 포도당 감지 도메인및 시안 및 황형 광성 단백질로 구성됩니다. 포도당 결합시 센서는 FRET가 발생할 수 있도록 형성적 변화를 겪습니다. FLII12Pglu-700μδ6를 사용하여, 포도당 섭취량은 TDP-43G298S,ALS를 유발하는 변형을 발현하는 운동 뉴런에서 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 여기서, TDP-43 단백질요법의 맥락에서 포도당 센서 FLII12Pglu-700δ6을 발현하는 애벌레 복부 신경코드 제제에서 포도당 통풍구, ex vivo를측정하는 방법을 보여 준다. 이 접근법은 포도당 섭취량을 측정하고 다른 세포 유형또는 ALS 및 관련 신경 퇴행성 질환을 일으키는 다양한 돌연변이의 맥락에서 글리코리틱 플럭스를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 현재 불치의 진보적 인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS는 진단1의2-5 년 안에 운동 조정, 돌이킬 수 없는 마비, 호흡 부전 및 최종 죽음의 손실로 이끌어 내는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미칩니다. ALS는 체중 감소, 이상지질혈증 및 과대사와 같은 신진 대사 결함과 관련이 있습니다(2에서검토됨); 그러나, 그것은 어떻게 신진 대사에 이러한 변경 모터 뉴런 변성관련 불분명 남아. ALS 및 관련 신경퇴행성 질환에서 흔히 발생하는 분모는 TDP-43, RNA처리3,4,5의여러 단계에 관여하는 핵산 결합 단백질이다. TDP-43에 있는 돌연변이는 환자의 3%-5%에 영향을 미치지만, 야생 형 TDP-43 단백질은 ALS 케이스의 >97%에서 세포질 집계 에서 발견됩니다(6에서검토). 이 병리학은 세포질 포함, 운동 기능 장애 및 감소수명을포함하여 ALS의 여러 측면을 재구성하는 모터 뉴런에서 인간 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 (G298S)의 과발현에 의해 드로소필라에서 모델링되었다7,8. 이러한 모델을 이용하여, 최근에는 TDP-43 단백질요법이 피루바테 수준및 인포스포프락토키나아제(PFK) mRNA, 글리코리시스9의속도 제한 효소의 상당한 증가를 야기한다고 보고되었다. PFK 성적증명서의 유사한 증가는 환자 유래 운동 뉴런과 척수에서 발견되었으며, 이는 당해가 TDP-43 단백질 요법의 맥락에서 강화된다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 식이 및 유전 조작을 이용한 글리코리시스의 추가 증가는 운동 신경을 퇴행성화하는 보상, 신경 보호 메커니즘과 일치하여 TDP-43 단백질 요법의 플라이 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명과 같은 여러 ALS 표현형을 완화시켰습니다.

TDP-43 단백병증의 드로소필라 모델에서 글리코리시스의 변화를 더욱 조사하고 포도당 섭취를 측정하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩 된 FRET 계 센서 FLII12Pglu-700μδ610은 UAS-GAL4 발현 시스템을 사용하여 모터 뉴런으로 발현되었다. FLII12Pglu-700μδ6 포도당 센서는 녹색 형광 단백질, 시안 및 황형 단백질(CFP 및 YFP)의 두 가지 변이체 간의 공명 에너지 전달을 사용하여 세포 수준에서 포도당을 검출합니다. 분자의 반대쪽 끝에 CFP 및 YFP에 융합된 대장균 MglB 유전자로부터 세균성 포도당 결합 도메인으로 구성된다. 포도당 분자에 바인딩될 때, 센서는 CFP와 YFP를 더 가깝게 가져오고 FRET가 생기도록 허용하는 형성 변화를 겪으며, 이는 세포내 포도당 수준10,11,12(도 1)를정량화하는 데 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 FLII12Pglu-700μδ6 센서가 모터 뉴런에서 TDP-43 단백질 요법에 의한 포도당 섭취의 변화를 결정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여줍니다. 여기에 설명된 실험은 운동 뉴런에서 ALS 관련 돌연변이, TDP-43G298S의과발현이 대조군에 비해 포도당 섭취량이 현저하게 증가한다는 것을 보여준다. 이 접근법은 다른 유형의 ALS(예를 들어, SOD1, C9orf72 등) 및/또는 다른 세포 유형(예: 신경변성과 관련된 포도당 섭취의 변화를 결정하기 위해 사용될 수 있다).

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Protocol

UAS FLII12Pglu-700μδ6 형질식 파리는 볼켄호프 외10에서 보고되었으며 S. Schirmeier 박사가 친절하게 제공했습니다. UAS TDP-43G298S 형질전환라인은 T. 이왓츠보13박사가 친절하게 제공했습니다. UAS FLII12Pglu-700μmδ6 및 UAS TDP-43 전염을 모두 수용하는 재조합 드로소필라 라인은 표준 유전적 접근법을 사용하여 자르네스쿠 실험실에서 생성되어 만조 외9에서보고되었다. D42 GAL4는 운동 뉴런에서 TDP-43G298S와 함께 포도당 센서의 발현을 단독으로 또는 함께 구동하는 데 사용되었습니다. 모든 플라이 라인은 12h 다크:라이트 사이클에서 25°C에서 당밀 옥수수 밀 매체에 유지됩니다.

1. 드로소필라 복부 신경 코드 (VNC) 해부

  1. 실리콘 엘라스토머 해부 접시를 만듭니다.
    1. 실리콘 엘라스토머 부품을 제조업체의 프로토콜에 표시된 대로 50mL 튜브에 붓고 잘 저어줍니다.
    2. 35mm 조직 배양 접시에 약 2mL의 천골혼합물을 채웁니다. 주사기를 사용하여 거품을 제거합니다. 접시를 덮고 밤새 60°C 오븐에 수평 표면에 놓아 치료하십시오.
  2. 조직 생존가능성을 유지하면서 VNC를 노출하는 드로소필라 애벌레를 해부한다.
    1. 방황 하는 세 번째 인스타 애벌레를 수집, ddH2O와 린스, HL3 버퍼 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM trehalose, 5 mM pes HE; pH 7.1) 안 감선 에.
    2. 해부 현미경으로 한 쌍의 집게(#5 또는 55 포셉)를 사용하여 애벌레 등쪽의 전방 및 후방 끝을 위로 고정하고, 애벌레 핀(Minutein Pins)으로 길게 뻗어 조심스럽게 스트레칭합니다.
    3. 각진 홍채 가위를 사용하여 후방 핀 바로 위에 절개를 합니다. 절개에서 시작하여 애벌레의 전방 끝으로 수직 절단을 합니다.
    4. 필요한 경우 HL-3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. CNS를 방해하지 않고 기관및 부동 장기의 나머지 부분을 제거합니다. 신경 근육 시스템 (VcNC, 축축산 및 신경 근육 접합)을 그대로 유지하면서 CNS를 노출하기 위해 신체 벽을 스트레칭 플랩을 고정하십시오.

2. 이미지 수집

  1. 이미징 매개 변수를 최적화합니다.
    1. 해부를 시작하기 전에 현미경과 레이저를 켭니다. 이미지는 40배 의 물 침수 렌즈가 있는 수직 공초점 현미경을 사용하여 획득해야 합니다. 405nm 레이저를 사용하여 CFP(465-499 nm)와 FRET(535-695 nm) 검출 채널 모두에서 이미지를 획득한다.
    2. 스캔 속도(6), 평균(2), 목표(40배), 줌(1배), 핀홀 크기(1AU), 공간 해상도(512 x 512)와 같은 획득 매개 변수를 최적화합니다. 신호가 최적의 동적 범위에 있도록 게인을 조정합니다. 모든 유전자형에 동일한 매개 변수를 사용해야 합니다.
  2. VNC 내의 이미지 모터 뉴런.
    1. 렌즈 아래에 해부 된 샘플과 실리콘 접시를 놓습니다. 레할로오스-자크로스 HL3 버퍼와 접촉할 수 있도록 렌즈를 낮춥니다(1.2.1 참조). 렌즈가 버퍼에 완전히 침수되도록 하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 버퍼를 더 추가합니다.
    2. CFP 및 FRET 채널을 사용하여 VNC 미드라인을 따라 최소 6개의 모터 뉴런으로 구성된 광학 섹션을 수동으로 선택합니다. 모터 뉴런은 전방 후방 축을 따라 포도당 센서 및 위치의 발현에 기초하여 확인된다.
    3. 10초마다 10분마다 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지는 기준선을 나타냅니다.
  3. 포도당 보충 HL-3로 자극.
    1. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HL3 버퍼를 함유한 트레할로오스-자당을 제거하고 5mM 포도당 보충 HL-3(70mM NaCl, 5mM KCl, 20mM MgCl2,10mM NaHCO3,115m MM 포도당, 5mM) HE, pH 7.1)로 대체한다. 이 단계는 VNC의 움직임을 최대한 피하기 위해 세심한 주의를 기울여 수행해야합니다.
    2. 10초마다 10초마다 이미지를 획득하여 10분 간 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지는 자극 단계를 나타냅니다.
  4. 날짜, 유전 적 배경, 실험 상태 (기준선 또는 자극) 및 사용되는 채널을 포함한 파일 이름으로 이미징 소프트웨어에서 지원하는 .czi 파일 또는 파일 유형으로 이미지를 저장합니다.
  5. 모든 유전자형을 이미지화하기 위해 매개변수를 재사용(도2A).

3. 이미지 프로세싱 및 ROI 선택

  1. 피지 / ImageJ에서 czi 파일을 열고 색상 모드를설정 : 회색 scale, 와 함께 보기 스택을선택 : 하이퍼 스택, 별도의 윈도우로 분할 채널을선택합니다.
  2. 드리프트 보정 플러그인을 사용하여 이미지를 처리 : 터보 레그와 스택 레그. 각 채널은 플러그인에서 Stackreg를 선택하여 별도로 수정한 다음 변환: 번역을 선택합니다.
  3. 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하여 각 채널의 평균 회색 값을 추출합니다.
    1. 전체 타임 시리즈에 초점을 맞춘 모든 모터 뉴런을 추적하여 ROI를 선택합니다. ROI 관리자를 사용하여 각 모터 뉴런 윤곽선을 저장합니다.
    2. 다중 측정 함수를 사용하여 각 ROI의 평균 회색 값을 각 시점에서 측정합니다. 첫 번째 채널에서 두 번째 채널로 추적된 ROI를 복사하여 사전 자극 이미지를 볼 수 있습니다.
    3. 사전 자극 이미지에 대해 선택한 동일한 셀/ROI를 사용하여 각 채널의 후 자극 이미지에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

4. 데이터 분석

  1. FRET 및 CFP 채널의 평균 회색 값을 사용하여 FRET/CFP 비율을 계산합니다. FRET/CFP 비율의 변화는 세포내 포도당 농도의 변화를 반영합니다.
    1. 각 ROI 및 시간 대 시간에 대해 FRET/CFP 비율을 플롯합니다. 모든 VNC 내에서 일부 ROI는 자극 에 따라 FRET/CFP 비율의 하락을 나타낼 것입니다.
      참고: 이것은 포도당을 섭취하는 몇몇 뉴런의 무능력으로 해석됩니다, 아마도 해부로 기인한 긴장 때문에 분석에서 제거됩니다. 각 ROI 및 시간점에 대한 나머지 FRET/CFP 비율은 유전자형당 시간포인트당 단일 FRET/CFP 비율을 생성하기 위해 평균됩니다(포도당 센서만 및 TDP-43G298S를가진 포도당 센서). 이러한 단일 FRET/CFP 비율은 모든 후속 정규화에 사용됩니다. 포도당 센서 제어를 위해 31개의 ROI를 분석하였고 24개의 ROI는 TDP-43G298S에대해 분석되었다.
  2. 기준 정규화: 처음 10분(기준선)에 대한 FRET/CFP 비율의 평균을 계산한 다음 전체 실험의 각 시간 지점에 대해 개별 FRET/CFP 비율을 10분 기준평균으로 정규화합니다(그림 2B참조).
  3. 정시성 정규화: 각 시점에서 혼자 포도당 센서에서 PDP-43G298S FRET/CFP 비율을 정상화(그림 3A참조).
  4. 막대 그래프: 막대 그래프 형태의 기준선 대 자극 비교의 경우 각 유전자형에 대해 5-10분(기준선) 및 15-20분(자극)의 FRET/CFP 비율을 사용합니다. 자극 비율을 기준비율에 정규화합니다(그림 3B참조).

5. 통계 분석

  1. Mann-Whitney 보정(기준 및 시간점 정규화용) 또는 Kruskall-Walis 테스트(자극의 막대 그래프 표현 대 기준FRET/CFP 비율)를 사용하여 정규화된 데이터 세트를 평가합니다.

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Representative Results

복부 신경 코드 (VNC), 전 생체 에서 포도당 센서의 이미지 수집
TDP-43에 근거를 둔 ALS의 Drosophila 모형에 있는 포도당 섭취에 있는 다름을 결정하기 위하여, 유전으로 인코딩된 FRET 기지를 둔 포도당 센서를 이용했습니다. 센서는 대장균 MglB 유전자로부터 포도당 결합 도메인에 융합된 CFP 및 YFP를 구성했다. 포도당 결합은 CFP와 YFP 10,11,12사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 검출될 수 있는 형성 변화를 유도한다. 포도당이 센서에 결합되지 않을 때, CFP 여기는 CFP 방출만 을 일으키고, 포도당이 결합될 때, YFP 신호는 CFP와 YFP(도1A)사이에서 발생하는 FRET로 인해 검출될 수 있다. D42 GAL4 드라이버는 이중 Partite UAS-GAL4 발현시스템(14)을통해 모터 뉴런에서 ALS 관련 돌연변이 TDP-43G298S와 함께 센서를 단독으로 또는 함께 표현하는 데 사용되었다. 세 번째 인스타 애벌레는 포도당 없이 HL3 완충에서 해부되었고 운동 신경 축축을 통해 신경 근육 접합에 여전히 연결된 VNC를 포함하여 신경 근육 시스템을 노출하도록 고정되었습니다. VNC는 512 x 512 픽셀의 공간 해상도를 가진 40x 수분 침지 렌즈를 사용하여 이미지화되었습니다(프로토콜 및 그림 1B참조). CFP 및 FRET 신호는 405 nm 레이저와 CFP 여기에 따라 각각 465-499 nm 및 535-695 nm에서 획득되었다. 이미지할 슬라이스는 VNC가 미드라인을 따라 최소 6개의 모터 뉴런으로 보이는 평면을 기반으로 선택되었습니다. 선택한 평면은 10분 동안 이미지화되어 10초마다 이미지를 캡처하여 기준형 형광을 결정했습니다. czi 파일은 genotype_sample#_baseline 따라 저장되었습니다. 기준 조건에 대해 10분 시간 과정이 완료된 후, 완충액은 포도당 보충 HL3로 대체되었다. 이미지는 기준 조건하에서 이미지된 동일한 평면을 찾기 위해 다시 초점을 맞췄습니다. 모든 샘플에 동일한 이미지 설정이 사용되었습니다. 그런 다음 VNC는 10초마다 새로운 이미지를 획득하고 추가 분석을 위해 genotype_sample#_post 자극으로 저장되었습니다.

이미지 분석
라이브 이미징 실험의 중요한 과제는 VN이 20분 이미징 간격 동안 겪는 드리프트입니다. 이 문제를 해결하기 위해 드리프트 보정 플러그인, Stackreg이미지 분석 및 ROI 선택 전에 피지에서 사용되었다 (프로토콜 및 그림 2A참조). 6-8개의 개별 세포/ROI는 각 VNC에서 선택되고 FRET/YFP 채널을 사용하여 설명하였다. 선택은 CFP 채널에 복사되었으며, 평균 회색 값은 다중 측정 함수를 사용하여 측정되었습니다. 정량화는 먼저 시간당 FRET/CFP 비율을 평균화한 다음 유전자형당 전체 10분 평균을 계산하여 수행하였다. 그런 다음 이러한 평균은 각 시점에서 FRET/CFP 비율을 정규화하는 데 사용되었으며 시간이 지남에 따라 플롯하여 데이터의 첫 번째 평가를 생성합니다(그림2B). 이러한 정상화 접근법을 이용하여, 포도당 센서를 단독으로 표현하는 자극시, 제어 운동 뉴런이 포도당 섭취량(3.9%,P값 < 0.0001)의 작지만 현저한 증가를 나타내고 TDP-43G298S를 발현하는 모터 뉴런은 포도당 섭취량(16.76%,P값 < 0.001)을 현저히 높게 나타낸다는 것을 발견했습니다. 이러한 데이터는 TDP-43 단백질 요법과 일치하여 이전에 참조9에나타난 바와 같이 운동 뉴런에서 포도당 섭취가 증가합니다.

데이터 분석 - 드로소필라 VNC의 운동 뉴런에서 포도당 섭취 측정
컨트롤과 TDP-43G298S 돌연변이 모터 뉴런 간의 차이에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 각 FRET/CFP 비율은 각 시점에서 제어로 정규화되었다(그림3A). 이를 통해 TDP-43G298S를 발현하는 ALS 모터 뉴런과 포도당 센서를 실시간으로 표현하는 제어 모터 뉴런 간의 포도당 섭취를 비교할 수 있습니다. 기준 조건하에서, 유전자형 사이에는 차이가 없었다. 그러나, 포도당과의 자극시, 급속한(7.31% 후 포도당 적용) 및 현저한 증가(10분 후 12.76%,P값 < 0.0001)는 대조군과 비교했을 때 TDP-43G298S에서 관찰되었다.

바 그래프는 포도당 자극전후(도 3B)전후 유전자형(TDP-43G298S 대 대조군) 간의 차이를 설명하는 대체 접근법을 제공한다. 이는 각각 의 기준형의 기준선에 대한 두 조건에 대해 FRET/CFP 비율을 정상화하고 기준선 및 자극 이미징의 마지막 5분 동안의 평균 비율을 각각 플로팅하여 수행하였다. 자극시, 포도당 센서를 단독으로 표현하는 뉴런은 기준선에 비해 FRET/CFP 비율(3.83% ± 0.08%, P값 < 0.0001)의 작지만 유의한 증가를 나타낸다. TDP-43G298S를 발현하는 뉴런은 기준선과 비교했을 때 자극시 FRET/CFP 비율이 크게 증가한 반면(14.73% ± 0.08%,P값 < 0.0001). TDP-43G298S및 포도당 센서를 단독으로 표현하는 모터 뉴런 간의 FRET/CFP 비율의 순 차이는 10.9%(P값 = 0.005)입니다. 이 분석은 또한 비율이 각 시간 과정 화상 진찰의 마지막 5 분 의 주위에 안정한다는 것을 보여줍니다, 그래서 이 시간 프레임은 그래프를 위해 선택되었습니다. 이 분석은 한 그래프에서 유전자형과 치료 사이의 통계적으로 유의한 차이를 포함하여 결과의 높은 수준의 개요를 제공합니다.

Figure 1
그림 1: FRET 센서 및 이미지 수집. (A)운동 뉴런에서 포도당 섭취를 측정하는 데 사용되는 FRET 기반 포도당 센서 다이어그램. 포도당 결합은 FRET가 생기게 합니다. (B)VNC에서 이미지된 영역을 보여주는 신경근육 접합(NMJ) 해부다이어그램. 왼쪽에 있는 이미지는 FRET(YFP) 및 CFP 채널 모두에서 포도당 자극 전후의 TDP-43G298S를 보여주는 것이다. 스케일 바: 20 μm. 배율: 40배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: TDP-43 돌연변이의 맥락에서 포도당 센서의 이미지 분석. (A)기준선 및 자극 조건 하에서 포도당 센서 제어 및 TDP-43G298S 샘플에서 FRET 및 CFP 신호의 대표적인 이미지. 대표적인 운동 신경은 ROI의 예로 각 이미지에 설명되어 있습니다. 스케일 바: 20 μm. 배율: 40x.(B)포도당 센서및 TDP-43 돌연변이 운동 뉴런의 평균 비율20분 이상의 이미징. 비율은 각 유전자형에 대한 평균 기준비율로 정규화되었습니다(프로토콜의 기준 정규화 참조). 표시된 값은 유전자형당 5개의 VN에서 25-30모터 뉴런(ROI)의 평균이다. Mann-Whitney는 통계적 유의를 평가하는 데 사용되었습니다. = P값 < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: TDP-43G298S의맥락에서 포도당 센서의 데이터 분석. (A)TDP-43G298S의 FRET/CFP 비율은 매시에 포도당 센서 제어로 정규화된다. Mann-Whitney는 통계적 유의를 평가하는 데 사용되었습니다. = P값 < 0.0001. (B)포도당 센서 제어 및 TDP-43G298S에서 포도당 섭취량의 바 그래프 표현은 대조군에 비해 자극 시 및 TDP-43G298S의 맥락에서 제어 모터 뉴런의 포도당 섭취량이 현저한 증가를 나타낸다. 크루스칼 왈리스는 통계적 유의를 평가하는 데 사용되었습니다. ** = P값 < 0.01, **** = P값 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기서 상세히 기술된 기술은 FLII12Pglu-700δ6, 밀리몰라 범위10,11,12로포도당 수준의 변화를 검출할 수 있는 FRET 기반 센서를 사용하여 살아있는 드로소필라에 대한 특정 세포 유형의 포도당섭취를측정하도록 적용될 수 있다. 이 센서는 이전에 UAS-GAL4 시스템과 함께 뉴런9,10을포함한 특정 세포 유형에 대한 발현을 대상으로 사용되었습니다. 이 연구에서, D42 GAL4는 FLII12Pglu-700δ6을 자체적으로 또는 TDP-43G298S와 함께 발현하여 ALS 운동 뉴런에서 포도당 섭취를 평가하는 방법을 시연하는 데 사용되었습니다. 더욱이, 이 방법은 애벌레 VNC에서 형광 센서의 무리를 이미지하기 위해 광범위하게 적용 될 수있다.

프로토콜의 중요한 단계에는 신호 대 잡음 비율을 최대화하는 것이 포함됩니다. 이를 위해, 형광이 과포화되지 않도록 이미지 획득 파라미터가 설정되었고, 전체 범위의 신호 강도를 정량화할 수 있다. 게인, 스캐닝 속도, 핀홀 크기 및 줌과 같은 이미징 매개 변수는 연구 전반에 걸쳐 변경되지 않았습니다. 실험은 며칠 동안 수행되었다; 그러나, 각 실험에서 유전자형, 즉 제어 및 TDP-43G298S가 모두 가변성을 고려하여 함께 이미지화되었다. 물 침지 렌즈를 사용하여 Drosophila 애벌레 CNS를 이미징하면 시간이 지남에 따라 광학 비행기의 변화가 발생할 수 있습니다. 충분한 버퍼를 사용하여 광학 평면의 급격한 변화를 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 초점이 변경된 샘플은 폐기되었습니다.

조건과 매개 변수는 실험 전반에 걸쳐 변경되지 않고 유지되지만 이 기술은 이미징 중에 버퍼를 변경해야 합니다. 이미징의 10 분 후 포도당 무료 버퍼는 광학 초점 평면을 변경할 수있는 포도당 보충 HL-3 버퍼로 대체해야합니다. 렌즈는 포도당 보충 전후에 동일한 세포 세트가 심하도록 동일한 초점 평면에 다시 초점을 맞추어야합니다. 모터 뉴런의 하위 집합은 자극 다음 FRET/CFP 비율에 있는 하락을 전시했습니다. 이것은 몇몇 뉴런이 포도당을 장악하지 않는다는 것을 나타냅니다, 아마도 해부에 기인한 긴장 때문에 분석에서 제거되었습니다.

ROI 선택, 이미지 처리 및 정량화는 피지/ImageJ를 사용하여 수행되었습니다. ROI는 시리즈의 첫 번째 이미지에서 수동으로 선택되지만, 이미징 시리즈 전반에 걸쳐 ROI가 변하지 않도록 시간 경과 이미징에서 사소한 드리프트를 수정하는 것이 중요합니다. 오픈 소스 드리프트 보정 플러그인, Stackreg, 이 문제를 설명하는 데 사용되었다.

오른쪽 여기 레이저의 가용성은이 기술에 큰 제한이다. 436 nm 흥분 레이저는이 포도당 센서에 이상적이지만, 우리는 센서가 더 널리 사용할 수있는 405 nm 흥분 레이저와 함께 사용할 수 있음을 보여 주었다. 이 기술에 또 다른 제한은 포도 당 역학을 측정 하는 데 사용할 수 있지만 절대 포도 당 농도 사용할 수 있습니다. 절대 포도당 수준을 측정하기 위한 잠재적인 대체 전략은 iGlucoSnFR-TS, 절대 포도당 농도를 측정하기 위하여 보정될 수 있는 일생 포도당 센서입니다15.

포도 당은 두뇌에 있는 에너지의 중요한 근원이고 생리적인 기능에 필요합니다. 포도 당 물질 대사에 결함 여러 병 적인 조건과 관련 된 (에서 검토16). Drosophila는 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 강력한 유전모델이다 (17). 그러나 드로소필라에서포도당 수치를 직접 측정할 수 있는 제한된 기술이 있습니다. 이 FRET 기반 포도당 센서는 포도당 수치의 세포 내 변화의 직접적인 척도를 제공합니다. 몇 가지 실험 적인 도전 및 제한에도 불구 하 고이 센서는 성공적으로 특정 세포 유형에서 포도 당 역학을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 모터 뉴런, glia, 근육) 다양 한 질병 모델에서, ALS및 관련 신경 퇴행 장애의 여러 종류를 포함 하 여.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 드로소필라 균주를 제공 스테파니 쉬르마이어와 다케시 이왓스보 감사합니다. 우리는 또한 애리조나 대학의 말리 이미징 코어에서 이미징을 지원한 패트리샤 얀스마에게 감사드립니다. 이 작품은 건강 NIH NS091299의 국가 학회에 의해 투자되었다, NS115514 (DCZ에), HHMI 길리엄 펠로우십 (EM에) 및 학부 생물학 연구 프로그램 (HB에).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

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References

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신경 과학 문제 174 포도당 센서 ALS 드로소필라,TDP-43 단백질 요법
TDP-43 단백질 요법의 <em>드로소필라</em> 모델에서 포도당 섭취 측정
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Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

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