TDP-43蛋白症の ショウジョウバエ モデルにおけるグルコース取り込みの測定

Summary

グルコース取り込みは、FRETベースの遺伝的にコードされたグルコースセンサーによって示されるように、TAR DNA結合タンパク質(TDP-43)タンパク質障害の影響を受ける ショウジョウバエ 運動ニューロンにおいて増加する。

Abstract

筋萎縮性側索硬化症は、診断後2〜5年以内に進行性筋力低下および死亡を引き起こす神経変性疾患である。臨床症状は、体重減少を含みます, 脂質異常症, および高代謝;しかし,これらは運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。細胞質含包、運動機能障害、寿命の減少を含むALSのいくつかの特徴を再現するTDP-43タンパク質障害の ショウジョウバエ モデルを用いて、最近、幅広い代謝欠陥を同定した。これらの中で、解糖はアップレギュレートされ、遺伝的相互作用実験が補償神経保護機構の証拠を提供することが判明した。実際、ホスホフルクトキナーゼのアップレギュレーションにもかかわらず、解糖症における率制限酵素は、食事および遺伝子操作を用いた解糖の増加が、TDP-43タンパク質症のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加を緩和することが示された。さらに、運動ニューロンにおける解糖性フラックスに対するTDP-43タンパク質症に対する影響を調べるには、以前に報告された遺伝的にコードされたFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ6が使用された。このセンサーは、FRETペアとして細菌性グルコースセンシングドメインとシアンおよび黄色の蛍光タンパク質で構成されています。グルコース結合の際、センサはコンフォメーション変化を起こしてFRETが発生する。FLII12Pglu-700μδ6を用いて、グルコース取り込みは、変異体を引き起こすALSであるTDP-43^G298Sを発現する運動ニューロンにおいて有意に増加することが判明した。ここでは、TDP-43タンパク質症のコンテキストでグルコースセンサFLII12Pglu-700μδ6を発現する幼虫腹側神経コード製剤におけるグルコース取り込み 、ex vivo、を測定する方法を示す。このアプローチは、グルコース取り込み量を測定し、異なる細胞タイプまたはALSおよび関連する神経変性疾患を引き起こす様々な突然変異の文脈での解糖束を評価するために使用することができる。

Introduction

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は現在不治の進行性神経変性疾患です。ALSは、運動協調の喪失、不可逆的な麻痺、呼吸不全、および診断2〜5年以内の最終的な死につながる上下運動ニューロンに影響を与^える1。ALSは、体重減少、脂質異常症、および高代謝⁽²でレビュー)などの代謝欠陥に関連付けられている。しかし、代謝におけるこれらの変化が運動ニューロン変性とどのように関連しているのかは不明である。ALSおよび関連する神経変性疾患における共通の分母は、TDP-43、RNA処理^3、4、5のいくつかのステップに関与する核酸結合タンパク質^である。TDP-43の変異は患者の3%〜5%にしか影響しないが、野生型TDP-43タンパク質は、ALS症例の>97%の細胞質凝集体内に見られる⁽⁶でレビュー)。この病理は、細胞質介在物、ロコモ運動機能不全および寿命^の減少を含むALSの複数の側面を再現する運動ニューロンにおけるヒト野生型または変異体TDP-43(G298S)の過剰発現によってショウジョウバエでモデル化^された。これらのモデルを用いて、TDP-43タンパク質症がピルビン酸レベルおよびホスホフルクキナーゼ(PFK)mRNAの有意な増加を引き起こすことが最近報告された、解糖酵素⁹の速度制限酵素。PFK転写物の同様の増加は、患者由来の運動ニューロンおよび脊髄において認められ、解糖症がTDP-43タンパク質症の文脈においてアップレギュレートされることを示唆した。興味深いことに、食事および遺伝子操作を用いた解糖のさらなる増加は、運動神経細胞を変性する代償的な神経保護機構と一致する、TDP-43タンパク質障害のフライモデルにおける運動機能障害および寿命の増加などのいくつかのALS表現型を緩和した。

さらに、TDP-43タンパク質症のショウジョウバエモデルにおける糖分解の変化をプローブし、グルコース取り込み量を測定するために、以前に報告された遺伝子組み換えFRETベースのセンサFLII12Pglu-700μδ6¹⁰は、UAS-GAL4発現系を用いて運動ニューロンで発現した。FLII12Pglu-700μδ6グルコースセンサーは、細胞レベルでグルコースを検出するために、緑色蛍光タンパク質(シアンおよび黄色蛍光タンパク質)の2つの変異体間の共鳴エネルギー移動を使用します。これは、分子の反対側の端にあるCFPとYFPに融合した大腸菌MglB遺伝子からの細菌グルコース結合ドメインからなる。グルコース分子に結合すると、センサーはCFPとYFPを近づけてFRETを発生させ、細胞内グルコースレベル^10、11、12を定量するために使用できる立体構造変化を受ける(図1)。ここでは、FLII12Pglu-700μδ6センサーを使用して、運動ニューロンにおけるTDP-43タンパク質症によるグルコース取り込みの変化を決定する方法を示す。ここで説明する実験は、ALS関連変異体TDP-43^G298Sの過剰発現が、コントロールと比較してグルコース取り込みの有意な増加を引き起こすことを示している。このアプローチは、他のタイプのALS(例えば、SOD1、C9orf72など)および/または他の細胞タイプ(例えば、グリア、筋肉)で、神経変性に関連するグルコース取り込みの変化を決定するために使用することができる。

Protocol

UAS FLII12Pglu-700μδ6トランスジェニックハエは、Volkenhoffら¹⁰ で報告され、S.シルマイヤー博士によって親切に提供された。UAS TDP-43^G298S トランスジェニックラインは、T.岩subo¹³によって親切に提供されました。UAS FLII12Pglu-700μδ6とUAS TDP-43の両方を有する組換えショ ウジョウバエ 線は、ザルネスクの実験室で標準的な遺伝的アプローチを用いて生成され、マンゾら9で報告^された。D42 GAL4は、運動ニューロンにおいてグルコースセンサ単独またはTDP-43^G298S の発現を駆動するために使用された。すべてのフライラインは、12時間暗:光サイクルで25°Cで、糖蜜コーンミール培地上に維持されています。

1. ショウジョウバエ 腹側神経コード(VNC)の切開

1. シリコンエラストマー解剖皿を作ります。
   1. メーカーのプロトコルに示されているように、50 mLチューブにシリコーンエラストマー成分を注ぎ、よくかき混ぜます。
   2. エラストマー混合物の約2 mLで35ミリメートルの組織培養皿を充填します。すべての気泡を削除するには、注射器を使用します。皿を覆い、一晩60°Cのオーブンでレベルの表面に置いて治します。
2. ショ ウジョウバエ の幼虫を解剖し、組織の生存率を維持しながらVNCを暴露する。
   1. 放浪第三のインスター幼虫を収集し、ddH₂Oで洗い、HL3バッファ(70 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM MgCl_2、10mM NaHCO 3、115 mMスクロース、5 mMトレハロース、5 mM HEPES;pH 7.1)のドロップに置きます。
   2. 一対の鉗子(#5または55鉗子)を解剖顕微鏡で使用し、幼虫の後側の前端と後端をピンで留め、昆虫ピン(Minutein pin)で幼虫を慎重に縦に伸ばします。
   3. 斜めのアイリスはさみを使用して、後部ピンのすぐ上に切開を行います。幼虫の前端に向かって切開から垂直カットを行います.
   4. 必要に応じて、HL-3 バッファーを数滴追加します。気管と浮遊器官の残りの部分をCNSを邪魔することなく取り除きます。神経筋システム(VNC、軸索、および神経筋接合部)をそのまま維持しながら、体壁を伸ばすフラップをピンで留めてCNSを露出させます。

2. 画像取得

1. イメージング パラメータを最適化します。
   1. 切り出しを開始する前に、顕微鏡とレーザーをオンにします。画像は、40倍の水浸漬レンズを備えた直立共焦点顕微鏡を使用して取得する必要があります。405 nmレーザーを使用してCFPを励起し、CFP(465-499 nm)およびFRET(535-695 nm)検出チャネルの両方の画像を取得します。
   2. スキャン速度(6)、平均(2)、目標(40倍)、ズーム(1x)、ピンホールサイズ(1 AU)、空間分解能(512 x 512)などの取得パラメータを最適化します。信号が最適なダイナミックレンジになるようにゲインを調整します。すべての遺伝子型に同じパラメータを使用する必要があります。
2. VNC内の運動ニューロンをイメージします。
   1. 解剖したサンプルをレンズの下に置きます。トレハロースクロースHL3バッファーに接触するようにレンズを下げます(1.2.1参照)。レンズがバッファーに完全に沈み込まないようにすることが重要です。必要に応じて、さらにバッファを追加します。
   2. CFP および FRET チャネルを使用して、VNC 正線に沿って、少なくとも 6 つの運動ニューロンがフォーカスされている光学セクションを手動で選択します。運動ニューロンは、グルコースセンサーの発現と前後軸に沿った位置に基づいて同定される。
   3. 10分ごとに画像を取得します。これらのイメージはベースラインを表します。
3. HL-3を補うグルコースで刺激します。
   1. パスツールピペットを使用してHL3-バッファーを含むトレハロースクロースを取り出し、5 mMグルコース補充HL-3(70 mM NaCl、5 mM KCl、20mM MgCl 2、10 mM NaHCO 3、115 mM SUCROSE、5 mMグルコース、5 mM HEPES、pH 7.1)に置き換えます。このステップは、VNCの動きを可能な限り避けるために、細心の注意を払って実行する必要があります。
   2. さらに10分間、10sごとに画像を取得します。これらの画像は、刺激フェーズを表します。
4. 画像を.cziファイルまたは画像作成ソフトウェアでサポートされているファイルタイプとして保存し、日付、遺伝的背景、実験条件(ベースラインまたは刺激)、使用するチャンネルなどのファイル名を付けます。
5. すべての遺伝子型をイメージ化するためにパラメータを再利用します(図2A)。

3. 画像処理とROIの選択

1. フィジー/ImageJ で czi ファイルを開き、[ カラー モード: グレースケール] を設定し、[ ビュー スタック: ハイパースタック] を選択し、[ チャンネルを別々の Windows に分割する] を選択します。
2. ドリフト補正プラグインを使用して画像を処理する:ターボレッグとスタックレグ。各チャネルは、[プラグイン] の下の [Stackreg]を選択して個別に修正され、[変換: 変換] を選択します。
3. 各チャンネルの平均グレー値を抽出するには、対象地域(ROI)を手動で選択します。
   1. 時系列全体にわたってフォーカスを維持しているすべての運動ニューロンをトレースすることで、ROIを選択します。ROI マネージャを使用して、各運動ニューロンのアウトラインを保存します。
   2. 各時点で各 ROI の平均グレー値を測定するには 、マルチメジャー 関数を使用します。最初のチャンネルから、刺激前イメージの 2 番目のチャンネルにトレースされた ROI をコピーします。
   3. プレ刺激画像に選択された同じセル/ROIを使用して、各チャンネルのポスト刺激画像に対してこのプロセスを繰り返します。

4. データ分析

1. FRET/CFP チャンネルの平均グレー値を使用して、FRET/CFP 比を計算します。FRET/CFP比の変化は、細胞内グルコース濃度の変化を反映しています。
   1. ROI とタイム ポイント対時間ごとの FRET/CFP 比をプロットします。すべてのVNC内で、ROIの一部は刺激後のFRET/CFP比の低下を示します。
      注:これは、おそらく解剖によって引き起こされるストレスのために、グルコースを取り込むためにいくつかのニューロンの不能として解釈され、したがって、分析から排除されます。ROIおよび各時点の残りのFRET/CFP比は、平均化され、遺伝子型あたりのポイント当たりの単一のFRET/CFP比を生成する(グルコースセンサ単独およびTDP-43^G298Sを有するグルコースセンサ)。これらの単一のFRET/CFP比は、後続のすべての正規化に使用されます。31 ROIをグルコースセンサコントロールについて分析し、TDP-43^G298Sについて24のROIを分析しました。
2. ベースライン正規化: 最初の 10 分 (ベースライン) の FRET/CFP 比の平均を計算し、実験全体の各時間ポイントに対する個々の FRET/CFP 比を 10 分ベースライン平均に正規化します ( 図 2Bを参照)。
3. タイムポイントの正規化: TDP-43^G298S FRET/CFP 比を各時点でグルコースセンサー単独から FRET/CFP 比に正規化します ( 図 3Aを参照)。
4. 棒グラフ: 棒グラフの形式でのベースライン対刺激比較の場合、各遺伝子型に対して 5~10 分 (ベースライン) と 15~20 分 (刺激) の FRET/CFP 比を使用します。ベースライン比に対する刺激比を正規化する( 図3Bを参照)。

5. 統計分析

1. マン・ホイットニー補正(ベースラインおよびタイムポイント正規化の場合)またはクルスコル・ワリス検定(刺激とベースラインFRET/CFP比の棒グラフ表現)を使用して正規化されたデータセットを評価します。

Representative Results

腹側神経コード(VNC)のグルコースセンサーの画像取得
TDP-43に基づくALSのショウジョウバエモデルにおけるグルコース取り込みの違いを判定するために、遺伝的にコード化されたFRETベースのグルコースセンサーを用いた。このセンサーは、大腸菌MglB遺伝子からグルコース結合ドメインに融合したCFPおよびYFPを構成する。グルコース結合は、CFPと^{YFP10、11、12}との間の蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)によって検出することができる立体構造変化^を引き起こす。グルコースがセンサに結合していないと、CFP励起はCFP発光のみを引き起こし、グルコースが結合すると、CFPとYFPの間で発生するFRETによるYFP信号を検出することができる(図1A)。D42 GAL4ドライバは、2partite UAS-GAL4発現システム¹⁴を介して運動ニューロンにおけるALS関連変異TDP-43^{G298Sと単独でまたはALS関連変異体TDP-43 G298S}と一緒にセンサーを発現させるために使用された。第3のインスター幼虫は、グルコースなしでHL3緩衝液で解剖され、運動ニューロン軸索を介して神経筋接合部に依然として接続されているVNCを含む神経筋系を暴露するために固定された。VNC は、空間分解能が 512 x 512 ピクセルの 40x 水浸漬レンズを使用して画像化されました (プロトコルおよび図 1Bを参照)。CFPおよびFRET信号は、405 nmレーザーでのCFP励起に続いて、それぞれ465-499 nmおよび535-695 nmで取得された。画像化されるスライスは、VNCが正線に沿って焦点を合わせて少なくとも6つの運動ニューロンで見える平面に基づいて選択されました。選択した平面を10分間撮影し、10s毎に画像を撮影し、ベースライン蛍光を決定した。czi ファイルは、genotype_sample#_baselineとして保存されました。ベースライン条件に対して10分の時間経過が完了した後、バッファーをグルコース補充HL3に置換した。ベースライン条件下でイメージされたのと同じ平面を見つけるために、イメージの焦点が再び合わせられました。すべてのサンプルに同じイメージ設定が使用されました。その後、VNCは10sごとに新しい画像を取得して10分間再びイメージングされ、さらなる分析のためのgenotype_sample#_post刺激として保存されました。

画像解析
ライブイメージング実験の重要な課題は、VNCが20分イメージング間隔中に受けるドリフトです。この問題に対処するために、ドリフト補正プラグイン、スタックレグは、画像分析とROI選択の前にフィジーで使用されました(プロトコルと 図2Aを参照してください)。各VNCから6~8個のセル/ROIを選択し、FRET/YFPチャンネルを使用して概要を作成しました。選択はCFPチャンネルにコピーされ、平均グレー値はマルチメジャー関数を使用して測定された。定量化は、まず、1つの時点当たりのFRET/CFP比を平均化し、次に1遺伝子型当たり10分間の平均値を計算することによって行った。これらの平均値を使用して各時点で FRET/CFP 比を正規化し、時間をかけてプロットしてデータの最初の評価を生成します (図 2B)。この正規化アプローチを用いて、刺激を受けて、グルコースセンサーを単独で発現する制御運動ニューロンは、グルコース取り込み(3.9%、P_値 <0.0001)の小さいながらも有意な増加を示し、TDP-43^G298S を発現する運動ニューロンは有意に高いグルコース取り込み率(16.76%、p_値 <0.0001)を示すことがわかった。これらのデータは、前に参照⁹に示したように、運動ニューロンにおけるグルコース取り込みの増加を引き起こすTDP-43タンパク質症と一致している。

データ解析 - ショウジョウバエVNCにおける運動ニューロンにおけるグルコース取り込みの測定
コントロールとTDP-43^G298S 変異運動ニューロンの違いについてさらに洞察を得るために、各FRET/CFP比を各時点でコントロールに正規化した(図3A)。これにより、TDP-43^G298S を発現するALS運動ニューロンと、グルコースセンサ単体をリアルタイムで発現する制御運動ニューロンとの間でグルコース取り込みの比較が可能になります。ベースライン条件下では、遺伝子型間に差はなかった。しかし、グルコースによる刺激を受けて、迅速(グルコース塗布の1分後に7.31%)と有意な増加(10分後に12.76%)、グルコース取り込みにおけるP_値 <0.0001)を、コントロールと比較した場合にTDP-43^G298S で観察された。

棒グラフは、グルコース刺激の前後に遺伝子型(TDP-43^G298S 対コントロール)の違いを示す代替アプローチを提供する(図3B)。これは、それぞれの遺伝子型のベースラインに対する両方の条件に対するFRET/CFP比を正規化し、ベースラインおよび刺激イメージングの最後の5分間の平均比をそれぞれプロットすることによって行われた。刺激の際、グルコースセンサを発現するニューロンは、ベースラインと比較してFRET/CFP比(0.08%±3.83%、P_値 <0.0001)の小さいながらも有意な増加を示す。一方、TDP-43^G298S を発現するニューロンは、ベースラインと比較した場合、刺激時のFRET/CFP比が有意に増加した(0.08%±14.73%、P_値 <0.0001)であった。TDP-43^G298S とグルコースセンサを発現する運動ニューロン間のFRET/CFP比の純差は10.9%(P_値 =0.005)です。この分析は、各タイムコースイメージングの最後の5分の周りに比率が安定することを示しているので、この時間枠はグラフのために選択されました。この分析は、1つのグラフでの遺伝子型と治療の間の統計的に有意な差を含む、結果の概要を提供します。

図1:FRETセンサーと画像取得(A)運動ニューロンのグルコース取り込み測定に用いられるFRETベースのグルコースセンサ図。グルコース結合はFRETを起こす原因となる。(B)VNCで画像化された領域を示す神経筋接合(NMJ)解剖の図。左の画像は、FRET(YFP)およびCFPチャネルの両方でグルコース刺激の前後にTDP-43^G298Sを示しています。スケールバー:20 μm倍率:40倍。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TDP-43変異体のコンテキストにおけるグルコースセンサの画像解析 (A) グルコースセンサ制御におけるFRETおよびCFP信号の代表的な画像と、ベースラインおよび刺激条件下でのTDP-43^G298S サンプル。ROIの例として、各画像に代表的な運動ニューロンが概説されています。スケールバー:20μm倍率:40倍(B)グルコースセンサーにおけるFRET/CFPおよびTDP-43変異運動ニューロンの平均比が20分以上のイメージング。比率は、各遺伝子型の平均ベースライン比に正規化されました(プロトコルのベースライン正規化を参照)。示された値は、遺伝子型あたり5 VNCからの25〜30の運動ニューロン(ROI)の平均です。マン・ホイットニーは統計的有意性を評価するために使用された。= P_値 は 0.001 <。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: TDP-43^G298Sのコンテキストにおけるグルコースセンサのデータ解析(A)TDP-43^G298SのFRET/CFP比は、各時点でグルコースセンサ制御に正規化されます。マン・ホイットニーは統計的有意性を評価するために使用された。= P_値< 0.0001 です。(B)グルコースセンサ制御およびTDP-43^G298Sにおけるグルコース取り込みの棒グラフ表現は、刺激時およびTDP-43^G298Sのコンテキストにおけるコントロール運動ニューロンにおけるグルコース取り込みの有意な増加を示す。クルスクルス=ワリスは、統計的有意性を評価するために使用されました。** = P_値< 0.01、**** = P_値< 0.0001 です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここで詳細に説明する技術は、FLII12Pglu-700μδ6を用いた生きたショウジョウバエにおける特定の細胞型のグルコース取り込み量を測定するために適用することができる、10、11、12の範囲にグルコースレベルの変化を検出することができるFRETベースのセンサである。このセンサーは、以前は、ニューロン^9,10を含む特定の細胞タイプに対する発現を標的にするために UAS-GAL4 システム^と組み合わせて使用されています。本研究では、D42 GAL4を用いて、FLII12Pglu-700μδ6を単独で、または疾患関連TDP-43^G298Sと共に発現し、このアプローチをALS運動ニューロンのグルコース取り込み評価にどのように使用できるかを実証した。さらに、この方法は、幼虫VNC内の多数の蛍光センサを画像化するために広く適用することができる。

プロトコルの重要なステップには、信号対雑音比の最大化が含まれます。このため、画像取得パラメータは、蛍光が過飽和しないように設定し、シグナル強度の全範囲を定量化することができる。ゲイン、スキャン速度、ピンホールサイズ、ズームなどのイメージングパラメータは、研究全体を通じて変わりません。実験は数日間にわたって行われました。しかし、各実験では、遺伝子型、すなわちコントロールとTDP-43^G298S の両方を、変動性を考慮して一緒に画像化した。水浸漬レンズを使用してショ ウジョウバエ 幼虫CNSをイメージングすると、時間の経過とともに光学面の変化が生じる可能性があります。十分なバッファーを使用して、光プレーンの急激な変化を避けるために注意する必要があります。フォーカスが変更されたサンプルは破棄されました。

条件とパラメータは実験を通して変更されずに維持されますが、この技術はイメージング中にバッファの変更を必要とします。10分のイメージング後、グルコースフリーバッファーは、グルコース補充HL-3バッファーに置き換えられなければならないため、光学的焦点面が変化する可能性があります。同じセットの細胞がグルコース補充の前後に画像化されるように、レンズを同じ焦点面に再集着する必要があります。運動ニューロンのサブセットは、刺激後のFRET/CFP比の低下を示した。これは、いくつかのニューロンがグルコースを取り込まないことを示しています, おそらく解剖によって引き起こされるストレスのために、分析から排除されました.

ROIの選択、画像処理および定量化は、フィジー/ImageJを使用して行われました。ROI はシリーズの最初の画像で手動で選択されますが、撮像シリーズ全体で ROI を不変に保つためには、時間経過イメージングでマイナードリフトを修正することが重要です。オープンソースのドリフト補正プラグインStackregは、この問題を説明するために使用されました。

右励起レーザーの利用可能性は、この技術の大きな制限です。436 nm励起レーザーはこのグルコースセンサーにとって理想的ですが、我々はセンサーがより広く利用できる405 nmの励起レーザーと使用することができることを示した。この技術のもう一つの制限は、グルコースのダイナミクスを測定するために使用することができるが、絶対的なグルコース濃度を測定しないことである。絶対グルコースレベルを測定する潜在的な代替戦略は、iGlucoSnFR-TS、生涯グルコースセンサーであり、絶対的なグルコース濃度¹⁵を測定するために較正することができる。

グルコースは、脳内のエネルギーの主要な源であり、生理機能のために必要とされます。グルコース代謝の欠陥は、いくつかの病理学的状態と関連付けられている⁽¹⁶でレビュー)。ショウジョウバエ は、神経変性疾患¹⁷を研究するために使用される強力な遺伝モデルです。しかし、 ショウジョウバエのグルコースレベルを直接測定するために利用可能な限られた技術があります。このFRETベースのグルコースセンサーは、グルコースレベルの細胞内変化の直接的な尺度を提供します。いくつかの実験的な課題と制限にもかかわらず、このセンサーは、ALSおよび関連する神経変性疾患の複数のタイプを含む様々な疾患モデルにおける特定の細胞タイプ(例えば、運動ニューロン、グリア、筋肉)におけるグルコースダイナミクスの研究に成功するために使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A