Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, 2Vollum Institute, Oregon Health and Science University, 3Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson
* These authors contributed equally

Summary

TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.

Abstract

Amyotrofik lateral skleroz, tanıyı takip eden 2-5 yıl içinde ilerleyici kas güçsüzlüğüne ve ölüme neden olan nörodejeneratif bir bozukluktur. Klinik bulgular arasında kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm sayılabilir; bununla birlikte, bunların motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. Sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış yaşam süresi dahil olmak üzere ALS'nin çeşitli özelliklerini yeniden sağlayan bir Drosophila TDP-43 proteinopati modeli kullanarak, yakın zamanda geniş kapsamlı metabolik eksiklikler tespit ettik. Bunlar arasında glikolizin güncel olduğu tespit edildi ve genetik etkileşim deneyleri telafi edici bir nöroprotektif mekanizma için kanıt sağladı. Nitekim, glikolizde enzim oranını sınırlayan fosfolreküsyona rağmen, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanılarak glikolizde bir artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde lokomotor disfonksiyonunu ve yaşam süresini artırdığı gösterilmiştir. Motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin glikolitik akı üzerindeki etkisini daha fazla araştırmak için, daha önce genetik olarak kodlanmış, FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanıldı. Bu sensör, bakteriyel glikoz algılama etki alanı ve FRET çifti olarak siyan ve sarı floresan proteinlerden oluşur. Glikoz bağlanması üzerine sensör, FRET'in gerçekleşmesine izin vererek konformasyonsal bir değişikliğe uğrar. FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak, glikoz alımının ALS'ye neden olan bir varyant olan TDP-43G298S'yiifade eden motor nöronlarda önemli ölçüde arttığı bulunmuştur. Burada, TDP-43 proteinopatisi bağlamında Glikoz sensörü FLII12Pglu-700μδ6'yı ifade eden larva ventral sinir kordonu preparatlarında glikoz alımının nasıl ölçüldüğünü gösteriyoruz. Bu yaklaşım, glikoz alımını ölçmek ve farklı hücre tiplerinde glikolitik akıyı değerlendirmek veya ALS ve ilgili nörodejeneratif bozukluklara neden olan çeşitli mutasyonlar bağlamında kullanılabilir.

Introduction

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) şu anda tedavi edilemeyen ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur. ALS, tanıdan sonraki 2-5 yıl içinde motor koordinasyon kaybına, geri dönüşü olmayan felce, solunum yetmezliğine ve nihai ölüme yol açan üst ve alt motor nöronları etkiler1. ALS kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm gibi metabolik defektlerle ilişkilidir(2'degözden geçirilmiştir); bununla birlikte, metabolizmadaki bu değişikliklerin motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. ALS ve ilgili nörodejeneratif hastalıklarda ortak bir payda, RNA işleme 3,4 , 5'in çeşitli adımlarında yer alan nükleik asit bağlayıcı bir protein olan TDP-43'tür. TDP-43'teki mutasyonlar hastaların sadece %3-5'ini etkilese de, ALS vakalarının %97'> sinde sitoplazmik agregalarda vahşi tip TDP-43 proteini bulunur(6'dagözden geçirilmiştir). Bu patoloji Drosophila'da, sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış ömür dahil olmak üzere ALS'nin birçok yönünü yeniden oluşturan motor nöronlarda insan wildtype veya mutant TDP-43'ün (G298S) aşırı ifade edilmesiyle modellenmiştir7,8. Bu modeller kullanılarak, son zamanlarda TDP-43 proteinopatisinin piruvat seviyelerinde ve glikoliz9'unhız sınırlayıcı enzimi olan fosfolroktokinaz (PFK) mRNA'da önemli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir. PFK transkriptlerinde benzer artışlar hasta kaynaklı motor nöronlarda ve omuriliklerde de bulundu ve glikolizin TDP-43 proteinopatisi bağlamında güncellendiğini düşündürmektedir. İlginçtir ki, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanarak glikolizdeki daha fazla artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde, dejenere motor nöronlarda telafi edici, nöroprotektif bir mekanizma ile tutarlı olarak, lokomotor disfonksiyonu ve artan yaşam süresi gibi birkaç ALS fenotipini hafifletti.

Glikolizdeki değişiklikleri daha fazla araştırmak ve TDP-43 proteinopatisinin Drosophila modellerinde glikoz alımını ölçmek için, daha önce bildirilen genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör FLII12Pglu-700μδ610, özellikle UAS-GAL4 ekspresyon sistemi kullanılarak motor nöronlarda ifade edildi. FLII12Pglu-700μδ6 glikoz sensörü, glikozu hücresel düzeyde tespit etmek için yeşil floresan protein, siyan ve sarı floresan proteinlerin (CFP ve YFP) iki çeşidi arasında rezonans enerjisi transferi kullanır. Molekülün zıt uçlarında CFP ve YFP'ye kaynaşmış E. coli MglB geninden bakteriyel glikoz bağlayıcı etki alanından oluşur. Bir glikoz molekülüne bağlandığında, sensör CFP ve YFP'yi birbirine yaklaştıran ve FRET'in oluşmasına izin veren, daha sonra hücre içi glikoz seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek konformasyonel bir değişikliğe uğrar10,11,12 ( Şekil1). Burada, FLII12Pglu-700μδ6 sensörünün motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin neden olduğu glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Burada açıklanan deneyler, ALS ile ilişkili bir mutant olan TDP-43G298S'nin motor nöronlarda aşırı ifade alınmasının, kontrollere kıyasla glikoz alımında önemli bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım, nörodejenerasyonla ilişkili glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için diğer ALS türlerinde (örneğin, SOD1, C9orf72, vb.) ve/veya diğer hücre tiplerinde (örneğin, glia, kaslar) kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenik sinekler Volkenhoff ve ark.10'da bildirilmiştir ve Dr. S. Schirmeier tarafından nazikça sağlanmıştır. UAS TDP-43G298S transgenik hatları Dr. T. Iwatsubo13tarafından sağlanmıştır. Zarnescu laboratuvarında standart genetik yaklaşımlar kullanılarak hem UAS FLII12Pglu-700μδ6 hem de UAS TDP-43 transgenes barındıran rekombinant Drosophila hatları üretildi ve Manzo veark. D42 GAL4, glikoz sensörünün tek başına veya motor nöronlarda TDP-43G298S ile birlikte ekspresyonunun yönlendirilmesinde kullanıldı. Tüm sinek hatları pekmez mısır unu ortamlarında, 12 saat karanlıkta 25 °C'de tutulur: ışık döngüsü.

1. Drosophila Ventral Sinir Kordonu (VNC) diseksiyonları

  1. Silikon elastomer diseksiyon yemekleri yapın.
    1. Silikon elastomer bileşenlerini üreticinin protokolünde belirtildiği gibi 50 mL'lik bir tüpe dökün ve iyice karıştırın.
    2. 35 mm doku kültürü yemeklerini elastomer karışımından yaklaşık 2 mL ile doldurun. Kabarcıkları çıkarmak için bir şırınna kullanın. Bulaşıkları örtün ve tedavi etmek için gece boyunca 60 °C fırında düz bir yüzeye yerleştirin.
  2. Doku canlılığını korurken VNC'yi ortaya çıkarmak için Drosophila larvalarını parçalara ayrıştırın.
    1. Gezgin bir üçüncü başlangıç larvası toplayın, ddH2O ile durulayın ve ardından elastomer kaplı bir çanak üzerine bir damla HL3 tamponuna (70 mM NaCl, 5 mM KCl,20mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO3, 115 mM sakkaroz, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES; pH 7.1) yerleştirin.
    2. Bir diseksiyon mikroskobu altında bir çift toka (#5 veya 55 tospi) kullanarak, larva dorsal tarafının ön ve arka uçlarını yukarı sabitleyin, larvayı böcek pimleriyle (Minutein Pinleri) uzunlamasına dikkatlice uzatın.
    3. Bir çift açılı iris makası kullanarak arka pimin hemen üstünde bir kesi yapın. Kesiden başlayarak larvaların ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın.
    4. Gerekirse birkaç damla HL-3 arabelleği ekleyin. CNS'yi bozmadan nefes borusu ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Nöromüsküler sistemi (VNC'ler, aksonlar ve nöromüsküler kavşaklar) sağlam tutarken CNS'yi ortaya çıkarmak için vücut duvarını geren kapakları sabitle.

2. Görüntü alımı

  1. Görüntüleme parametrelerini en iyi duruma getirme.
    1. Diseksiyonlara başlamadan önce mikroskobu ve lazerleri açın. Görüntüler, 40x su daldırma lensli dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmelidir. CFP'yi heyecanlandırmak ve hem CFP (465-499 nm) hem de FRET (535-695 nm) algılama kanallarındaki görüntüleri elde etmek için 405 nm lazer kullanın.
    2. Tarama hızı (6), ortalama (2), hedef (40x), yakınlaştırma (1x), iğne deliği boyutu (1 AU) ve uzamsal çözünürlük (512 x 512) gibi alım parametrelerini optimize edin. Kazancı, sinyalin en uygun dinamik aralıkta olacak şekilde ayarlayın. Tüm genotipler için aynı parametreler kullanılmalıdır.
  2. VNC içindeki görüntü motoru nöronları.
    1. Silikon kabı, parçalanmış numune ile merceğin altına yerleştirin. Lensi trehalose-sakkaroz HL3 tamponu ile temasa geçecek şekilde dirileyin (bkz. 1.2.1). Lensin tampona tamamen batırılmasını sağlamak önemlidir. Gerekirse daha fazla arabellek ekleyin.
    2. VNC orta hattı boyunca bulunan, odaktaki en az 6 motor nörondan oluşan bir optik bölümü manuel olarak seçmek için CFP ve FRET kanallarını kullanın. Motor nöronlar, glikoz sensörünün ifadesine ve ön-arka eksen boyunca konuma göre tanımlanır.
    3. 10 dakika boyunca her 10 dakikada bir görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.
  3. HL-3 takviyeli glikoz ile uyarın.
    1. Pasteur pipet kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz-sakkarozu çıkarın ve 5 mM glikoz takviyeli HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sakkaroz, 5 mM glikoz, 5 mM HEPES, pH 7.1) ile değiştirin. VNC'nin hareketini mümkün olduğunca önlemek için bu adımın büyük bir dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir.
    2. Her 10 dakikada bir 10 dakika daha görüntü alın. Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder.
  4. Görüntüleri .czi dosyaları veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türü olarak tarih, genetik arka plan, deneysel durum (taban çizgisi veya stimülasyon) ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin.
  5. Tüm genotipleri görüntüleyen parametreleri yeniden kullanın (Şekil 2A).

3. Görüntü işleme ve yatırım getirisi seçimi

  1. Czi dosyalarını Fiji/ImageJ'de açın ve Renk Modu: Gri Tonlama'yı ayarlayın, Yığını Şu şekilde Görüntüle: Hyperstack'i seçin ve Kanalları Ayrı Pencerelere Böl 'üseçin.
  2. Drift düzeltme eklentilerini kullanarak görüntüleri işleyin: turboreg ve stackreg. Eklentileraltında Stackreg seçilerek ve ardından Dönüştürme: Çeviri'yi seçerek her kanal ayrı ayrı düzeltilir.
  3. Her kanalın ortalama gri değerini ayıklamak için İlgi Alanlarını (ROI) el ile seçin.
    1. Tüm zaman serisi boyunca odakta kalan tüm motor nöronları izleyerek ROI'leri seçin. Her motor nöron anahattını kaydetmek için yatırım getirisi yöneticisini kullanın.
    2. Her zaman noktasındaki her yatırım getirislerindeki ortalama gri değeri ölçmek için Çok ölçüm işlevini kullanın. İlk kanaldan izlenen ROI'leri, uyarım öncesi görüntü için ikinci kanala kopyalayın.
    3. Her kanaldaki uyarım sonrası görüntüler için bu işlemi, uyarılma öncesi görüntü için seçilen hücreleri/ROI'leri kullanarak tekrarlayın.

4. Veri analizi

  1. FRET ve CFP kanalları için ortalama gri değerleri kullanarak FRET/CFP oranını hesaplayın. FRET/CFP oranlarındaki değişiklikler hücre içi glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri yansıtır.
    1. Her yatırım getirisi ve zaman noktası için zamana karşı FRET/CFP oranlarını çizin. Her VNC'de ROI'lerin bazıları stimülasyonu takiben FRET/CFP oranlarında bir düşüş gösterecektir.
      NOT: Bu, bazı nöronların muhtemelen diseksiyonların neden olduğu stres nedeniyle glikoz alamamaları ve bu nedenle analizden dışlanmaları olarak yorumlanır. Her yatırım getirisi ve zaman noktası için kalan FRET/CFP oranları, genotip başına zaman noktası başına tek bir FRET/CFP oranı oluşturmak için ortalamadır (sadece glikoz sensörü ve TDP-43G298S'liglikoz sensörü). Bu tek FRET/CFP oranları sonraki tüm normalleştirmeler için kullanılır. Glikoz Sensörü kontrolleri için 31 ROI ve TDP-43G298S için 24ROI analiz edildi.
  2. Temel normalleştirme: İlk 10 dakika (taban çizgisi) için FRET/CFP oranlarının ortalamasını hesaplayın ve ardından tüm denemenin her zaman noktası için ayrı FRET/CFP oranlarını 10 dakikalık taban çizgisi ortalamasına normalleştirin (bkz. Şekil 2B).
  3. Zaman noktası normalleştirmesi: TDP-43G298S FRET/CFP oranlarını her zaman noktasında tek başına glikoz sensöründen FRET/CFP oranlarına normalleştirin (bkz. Şekil 3A).
  4. Çubuk grafikler: Çubuk grafikler şeklinde taban çizgisi ile stimülasyon karşılaştırmaları için, her genotip için 5-10 dk (taban çizgisi) ve 15-20 dk (stimülasyon) arasında FRET/CFP oranları kullanın. Stimülasyon oranını taban çizgisi oranına normalleştirin (bkz. Şekil 3B).

5. İstatistiksel analizler

  1. Mann-Whitney düzeltmesi (temel ve zaman noktası normalleştirmeleri için) veya Kruskall-Walis testi (stimülasyonun taban çizgisi FRET/CFP oranlarına karşı çubuk grafik gösterimi için) kullanarak normalleştirilmiş veri kümelerini değerlendirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ventral sinir kordonu (VNC), ex vivo glikoz sensörünün görüntü alımı
TDP-43'e dayalı bir DROSOPHILA ALS modelinde glikoz alımındaki farklılıkları belirlemek için genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı bir glikoz sensörü kullanılmıştır. Sensör, CFP ve YFP'den oluşuyor ve E. coli MglB geninden glikoz bağlama alanına kaynaştı. Glikoz bağlama, CFP ve YFP 10 , 11,12arasında floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile tespit edilebilen konformasyonsal bir değişiklikortayaçıkarır. Glikoz sensöre bağlı olmadığında, CFP ekssitasyonu yalnızca CFP emisyonuna neden olur ve glikoz bağlandığında, CFP ve YFP arasında meydana gelen FRET nedeniyle YFP sinyali tespit edilebilir (Şekil 1A). D42 GAL4 sürücüsü, sensörü tek başına veya als ile ilişkili mutant TDP-43G298S ile birlikte motor nöronlarda iki partili UAS-GAL4 ekspresyon sistemi14aracılığıyla ifade etmek için kullanılmıştır. Üçüncü instar larvalar glikoz olmadan HL3 tamponunda parçalandı ve VNC hala motor nöron aksonları aracılığıyla nöromüsküler kavşaklara bağlı olan VNC de dahil olmak üzere nöromüsküler sistemi ortaya çıkarmak için sabitlendi. VNC, 512 x 512 piksel uzamsal çözünürlüğe sahip 40x su daldırma lensi kullanılarak görüntülenmiştir (bkz. Protokol ve Şekil 1B). CFP ve FRET sinyalleri, 405 nm lazer ile CFP ekscitasyonunun ardından sırasıyla 465-499 nm ve 535-695 nm'de alındı. Görüntülenecek dilim, VNC'nin orta hat boyunca en az altı motor nöronla görülebildiği düzleme göre seçildi. Seçilen düzlem 10 dakika boyunca görüntülendi ve temel floresantı belirlemek için her 10 saniyede bir görüntü yakaladı. Czi dosyaları şu şekilde kaydedildi: genotype_sample#_baseline. Temel koşullar için 10 dakikalık zaman kursu tamamlandıktan sonra tampon glikoz takviyeli HL3 ile değiştirildi. Görüntü, temel koşullar altında görüntülenen düzlemi bulmak için yeniden odaklandı. Tüm örnekler için aynı görüntü ayarları kullanıldı. VNC daha sonra her 10 dakikada bir yeni bir görüntü elde ederek 10 dakika boyunca tekrar görüntülendi ve şu şekilde kaydedildi: genotype_sample#_post daha fazla analiz için stimülasyon.

Görüntü analizi
Canlı görüntüleme deneylerinde önemli bir zorluk, VNC'lerin 20 dakikalık görüntüleme aralığında maruz kaldıkları sürüklenmedir. Bu sorunu gidermek için, görüntü analizi ve yatırım getirisi seçiminden önce FIJI'de bir sürüklenme düzeltme eklentisi olan Stackreg kullanılmıştır (bkz. Protokol ve Şekil 2A). Her VNC'den 6-8 ayrı hücre/ROI seçildi ve FRET/YFP kanalı kullanılarak özetlendi. Seçimler CFP kanalına kopyalandı ve ortalama gri değerler çok ölçümlü işlev kullanılarak ölçüldü. Nicelemeler, önce zaman noktası başına FRET/CFP oranlarının ortalaması ve daha sonra genotip başına 10 dakikanın tamamı için ortalama hesaplanarak gerçekleştirildi. Bu ortalamalar daha sonra her zaman noktasında FRET/CFP oranlarını normalleştirmek için kullanıldı ve verilerin ilk değerlendirmesini oluşturmak için zaman içinde çizildi (Şekil 2B). Bu normalleşme yaklaşımını kullanarak, stimülasyon üzerine, sadece glikoz sensörini ifade eden motor nöronları kontrol etmenin, glikoz alımında küçük ama önemli bir artış gösterdiği (%3,9, Pdeğeri < 0,0001), TDP-43G298S'yi ifade eden motor nöronların ise önemli ölçüde daha yüksek glikoz alımı gösterdiği bulunmuştur (%16,76, Pdeğeri 0,0001 <). Bu veriler, daha önce referans9'dagösterildiği gibi motor nöronlarda glikoz alımının artmasına neden olan TDP-43 proteinopatisi ile tutarlıdır.

Veri analizleri - Drosophila VNC'deki motor nöronlarda glikoz alımının ölçümü
Kontroller ve TDP-43G298S mutant motor nöronlar arasındaki farklar hakkında daha fazla bilgi edinmek için, her FRET / CFP oranı her zaman noktasında kontrole normalleştirildi (Şekil 3A). Bu, TDP-43G298S'yi ifade eden ALS motor nöronları arasındaki glikoz alımında bir karşılaştırmaya ve glikoz sensörini tek başına gerçek zamanlı olarak ifade eden kontrol motoru nöronlarına izin verir. Temel koşullar altında, genotipler arasında bir fark yoktu. Bununla birlikte, glikoz ile uyarılma üzerine, kontrole kıyasla TDP-43G298S'de glikoz alımında hızlı (1 dk glikoz uygulamasından sonra% 7.31) ve glikoz alımında önemli bir artış (10 dk sonra% 12.76, Pdeğeri < 0.0001) gözlenmiştir.

Çubuk grafikler, glikoz stimülasyonundan önce ve sonra genotipler (TDP-43G298S ve kontroller) arasındaki farklılıkları göstermek için alternatif bir yaklaşım sunar (Şekil 3B). Bu, her iki koşul için FRET/CFP oranının ilgili genotiplerin taban çizgisine normalleştirilmesi ve sırasıyla son 5 dakikalık taban çizgisi ve stimülasyon görüntüleme için ortalama oranın çizilerek yapıldı. Stimülasyon üzerine, sadece glikoz sensörini ifade eden nöronlar, temele kıyasla FRET/CFP oranında (%3,83 ± %0,08, Pdeğeri < 0,0001) küçük ama önemli bir artış göstermektedir. TDP-43G298S'yi ifade eden nöronlar stimülasyon üzerine FRET/CFP oranında (%14.73 ± %0.08, Pdeğeri < 0.0001) taban çizgisine kıyasla önemli bir artış göstermiştir. Sadece TDP-43G298S'yi ifade eden motor nöronlar ile glikoz sensörü arasındaki FRET/CFP oranlarındaki net fark %10,9'dur (Pdeğeri = 0,005). Bu analiz ayrıca oranların her zaman kursu görüntülemesinin son 5 dakikası civarında dengelendiğini göstermektedir, bu nedenle grafik için bu zaman dilimi seçilmiştir. Bu analiz, genotipler ve tedaviler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklar da dahil olmak üzere sonuçlara üst düzey bir genel bakış sağlar.

Figure 1
Şekil 1: FRET sensörü ve görüntü alımı. (A) Motor nöronlarda glikoz alımını ölçmek için kullanılan FRET tabanlı Glikoz sensörü diyagramı. Glikoz bağlama FRET'in oluşmasına neden olur. (B) VNC'de görüntülenmiş alanı gösteren nöromüsküler kavşak (NMJ) diseksiyon şeması. Soldaki görüntüler, hem FRET (YFP) hem de CFP kanallarında glikoz stimülasyonundan önce ve sonra TDP-43G298S'yi gösterir. Ölçek çubukları: 20 μm. Büyütme: 40x. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: TDP-43 mutant bağlamında glikoz sensörünün görüntü analizi. (A)Glikoz sensörü kontrollerinde ve TDP-43G298S örneklerinde temel ve stimülasyon koşullarında FRET ve CFP sinyallerinin temsili görüntüleri. Her görüntüde bir yatırım getirisi örneği olarak temsili bir motor nöron özetlenmiştir. Ölçek çubukları: 20 μm. Büyütme: 40x. (B) Glikoz sensöründe ve TDP-43 mutant motor nöronlarda ortalama FRET/CFP oranları 20 dakikalık görüntülemenin üzerindedir. Oranlar her genotip için ortalama taban çizgisi oranına normalleştirildi (bkz. protokoldeki temel normalleştirme). Gösterilen değerler genotip başına 5 VNC'den 25-30 motor nöron (ROI) ortalamasıdır. Mann-Whitney istatistiksel önemi değerlendirmek için kullanıldı. = Pdeğeri 0.001 <. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Glikoz sensörünün TDP-43G298Sbağlamında veri analizi. (A) TDP-43G298S'nin FRET/CFP oranları her zaman noktasında Glikoz Sensörü kontrolüne normalleştirilir. Mann-Whitney istatistiksel önemi değerlendirmek için kullanıldı. = Pdeğeri 0.0001 <. (B) Glikoz Sensörü kontrolünde ve TDP-43G298S'de glikoz alımının çubuk grafik gösterimi, stimülasyon üzerine kontrol motor nöronlarında ve TDP-43G298S bağlamında glikoz alımında kontrollere kıyasla önemli bir artış göstermektedir. Kruskall-Walis istatistiksel önemi değerlendirmek için kullanıldı. ** = Pdeğeri < 0.01, **** = Pdeğeri < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada ayrıntılı olarak açıklanan teknik, glikoz seviyelerindeki değişiklikleri milimolerbiraralık 10 , 11,12'ye kadar algılayabilen FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak canlı Drosophila'ya belirli bir hücre türünde glikoz alımını ölçmek içinuygulanabilir. Bu sensör daha önce UAS-GAL4 sistemi ile birlikte, ifadesini nöronlar9,10da dahil olmak üzere belirli hücre türlerine hedeflemek için kullanılmıştır. Bu çalışmada D42 GAL4, FLII12Pglu-700μδ6'yı kendi başına veya TDP-43G298S ilişkili hastalıkla birlikte ifade etmek için, bu yaklaşımın ALS motor nöronlarında glikoz alımını değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu yöntem larva VNC'de çok sayıda floresan sensörü görüntülemek için yaygın olarak uygulanabilir.

Protokoldeki kritik adımlar arasında sinyal-gürültü oranının en üst düzeye çıkarılması yer alıyor. Bu amaçla, görüntü alma parametreleri floresan aşırı doymamış olacak şekilde ayarlandı ve sinyal yoğunluğunun tam aralığı ölçülebilir. Kazanç, tarama hızı, iğne deliği boyutu ve yakınlaştırma gibi görüntüleme parametreleri çalışma boyunca değişmeden kaldı. Deneyler birkaç gün boyunca gerçekleştirildi; bununla birlikte, her deneyde hem genotipler, yani kontroller hem de TDP-43G298S değişkenliği hesaba katmak için birlikte görüntülenmiştir. Drosophila larva CNS'yi su daldırma lensi kullanarak görüntülemek zaman içinde optik düzlem değişikliklerine yol açabilir. Yeterli tampon kullanılarak optik düzlemde köklü değişikliklerden kaçınılmasına özen verilmelidir. Odakta değişiklikler olan örnekler atıldı.

Deneyler boyunca koşullar ve parametreler değişmeden korunsa da, bu teknik görüntüleme sırasında arabellekte bir değişiklik gerektirir. 10 dakikalık görüntülemeden sonra glikozsuz tampon, optik odak düzlemini değiştirebilecek glikoz takviyeli HL-3 tamponu ile değiştirilmelidir. Lens aynı odak düzlemine yeniden odaklanmalıdır, böylece aynı hücre kümesi glikoz takviyesinden önce ve sonra görüntülenir. Motor nöronların bir alt kümesi, stimülasyonu takiben FRET/CFP oranlarında bir düşüş gösterdi. Bu, bazı nöronların muhtemelen diseksiyonun neden olduğu stres nedeniyle glikoz almadığını ve analizden elimine edildiğini gösterir.

Yatırım getirisi seçimi, görüntü işleme ve niceleme Fiji/ImageJ kullanılarak gerçekleştirildi. Serinin ilk görüntüsünde yatırım getirisi manuel olarak seçilirken, görüntüleme serisi boyunca yatırım getirisini değişmez tutmak için zaman atlamalı görüntülemede küçük kaymanın düzeltilmesi kritik öneme sahiptir. Bu sorunu hesaba katmak için stackreg, açık kaynaklı bir sürüklenme düzeltme eklentisi kullanıldı.

Doğru heyecan lazerinin kullanılabilirliği bu teknik için önemli bir sınırlamadır. 436 nm heyecan lazeri bu glikoz sensörü için ideal olmasına rağmen, sensörün daha yaygın olarak bulunan 405 nm heyecan lazeri ile kullanılabileceğini gösterdik. Bu tekniğin bir başka sınırlaması, glikoz dinamiklerini ölçmek için kullanılabilmesidir, ancak mutlak glikoz konsantrasyonlarını ölçemez. Mutlak glikoz seviyelerini ölçmek için potansiyel bir alternatif strateji, mutlak glikoz konsantrasyonlarını ölçmek için kalibre edilebilen ömür boyu glikoz sensörü iGlucoSnFR-TS'dir15.

Glikoz beyinde önemli bir enerji kaynağıdır ve fizyolojik fonksiyonlar için gereklidir. Glikoz metabolizmasındaki kusurlar çeşitli patolojik durumlarla ilişkilendirilmiştir(16'dagözden geçirilmiştir). Drosophila nörodejeneratif bozuklukları incelemek için kullanılan güçlü bir genetik modeldir17. Bununla birlikte, Drosophila'daglikoz seviyelerini doğrudan ölçmek için sınırlı teknikler vardır. Bu FRET tabanlı glikoz sensörü, glikoz seviyelerinde hücre içi değişikliklerin doğrudan bir ölçüsünü sağlar. Bazı deneysel zorluklara ve sınırlamalara rağmen, bu sensör, birden fazla ALS türü ve ilgili nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalık modellerinde belirli hücre tiplerindeki (örneğin, motor nöronlar, glia, kaslar) glikoz dinamiklerini incelemek için başarıyla kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Stefanie Schirmeier ve Takeshi Iwatsubo'ya Drosophila suşları sağladıkları için teşekkür ederiz. Patricia Jansma'ya Arizona Üniversitesi'ndeki Marley Görüntüleme Çekirdeği'nde görüntülemeye yardımcı olduğu için de teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH NS091299, NS115514 (DCZ'ye), HHMI Gilliam Bursu (EM'ye) ve Lisans Biyolojisi Araştırma Programı (HB'ye) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm tissue culture dishes Sigma Aldrich CLS430165
40X water immersion lens Zeiss 440090 dippable, N.A. 0.8
dissection scissors Roboz RS-5618
Dumont #5 forceps VWR 100189-236
Dumont #55 forceps VWR 100189-244
Minutien pins Fine Science tools 26002-10 used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dow 1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
  2. Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
  3. Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
  4. Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
  5. Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
  6. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  7. Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
  8. Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
  9. Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
  10. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
  11. Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
  12. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  13. Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
  16. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  17. Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).

Tags

Nörobilim Sayı 174 glikoz sensörü ALS Drosophila TDP-43 proteinopati
TDP-43 Proteinopatisinin <em>Drosophila</em> Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo,… More

Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy. J. Vis. Exp. (174), e62936, doi:10.3791/62936 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter