Summary
L'assorbimento del glucosio è aumentato nei motoneuroni Drosophila affetti da proteinopatia TDP-43 (TAR DNA binding protein), come indicato da un sensore di glucosio geneticamente codificato basato su FRET.
Abstract
La sclerosi laterale amiotrofica è una malattia neurodegenerativa che causa progressiva debolezza muscolare e morte entro 2-5 anni dalla diagnosi. Le manifestazioni cliniche includono perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo; tuttavia, non è chiaro come questi si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Utilizzando un modello di Drosophila della proteinopatia TDP-43 che ricapitola diverse caratteristiche della SLA tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e durata della vita ridotta, abbiamo recentemente identificato deficit metabolici ad ampio raggio. Tra questi, la glicolisi è risultata sovraregolata e gli esperimenti di interazione genetica hanno fornito prove di un meccanismo neuroprotettivo compensatorio. Infatti, nonostante l'upregulation della fosfofruttochinasi, l'enzima limitante la velocità nella glicolisi, un aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha dimostrato di mitigare la disfunzione locomotoria e aumentare la durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43. Per studiare ulteriormente l'effetto sulla proteinopatia TDP-43 sul flusso glicolitico nei motoneuroni, è stato utilizzato un sensore basato su FRET geneticamente codificato precedentemente riportato, FLII12Pglu-700μδ6. Questo sensore è composto da un dominio batterico di rilevamento del glucosio e da proteine fluorescenti ciano e gialle come coppia FRET. Dopo il legame con il glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che consente il FRET. Utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, l'assorbimento di glucosio è risultato significativamente aumentato nei motoneuroni che esprimono TDP-43G298S,una variante che causa la SLA. Qui, mostriamo come misurare l'assorbimento di glucosio, ex vivo, in preparati del cordone nervoso ventrale larvale che esprimono il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 nel contesto della proteinopatia TDP-43. Questo approccio può essere utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio e valutare il flusso glicolitico in diversi tipi di cellule o nel contesto di varie mutazioni che causano la SLA e le relative malattie neurodegenerative.
Introduction
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva attualmente incurabile. La SLA colpisce i motoneuroni superiori e inferiori portando alla perdita della coordinazione motoria, alla paralisi irreversibile, all'insufficienza respiratoria e all'eventuale morte entro 2-5 anni dalla diagnosi1. La SLA è associata a difetti metabolici come perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo (esaminato in2); tuttavia, non è chiaro come queste alterazioni del metabolismo si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Un denominatore comune nella SLA e nelle malattie neurodegenerative correlate è il TDP-43, una proteina legante l'acido nucleico coinvolta in diverse fasi dell'elaborazione dell'RNA3,4,5. Sebbene le mutazioni in TDP-43 colpiscano solo il 3%-5% dei pazienti, la proteina TDP-43 wild-type si trova all'interno di aggregati citoplasmatici in >97% dei casi di SLA (esaminata in6). Questa patologia è stata modellata in Drosophila sovraespressione di wildtype umano o mutante TDP-43 (G298S) nei motoneuroni, che ricapitola molteplici aspetti della SLA, tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e ridotta durata della vita7,8. Utilizzando questi modelli, è stato recentemente riportato che la proteinopatia TDP-43 provoca un aumento significativo dei livelli di piruvato e dell'mRNA della fosfofruttochinasi (PFK), l'enzima limitante la velocità della glicolisi9. Aumenti simili nei trascritti PFK sono stati trovati nei motoneuroni derivati dal paziente e nel midollo spinale, suggerendo che la glicolisi è sovraregolata nel contesto della proteinopatia TDP-43. È interessante notare che l'ulteriore aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha mitigato diversi fenotipi della SLA come la disfunzione locomotoria e l'aumento della durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43, coerente con un meccanismo compensatorio e neuroprotettivo nei motoneuroni degenerati.
Per sondare ulteriormente i cambiamenti nella glicolisi e misurare l'assorbimento del glucosio nei modelli Drosophila della proteinopatia TDP-43, un sensore basato su FRET geneticamente codificato FLII12Pglu-700μδ610 precedentemente riportato è stato espresso nei motoneuroni utilizzando specificamente il sistema di espressione UAS-GAL4. Il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 utilizza il trasferimento di energia di risonanza tra due varianti di proteina fluorescente verde, proteine fluorescenti ciano e gialle (CFP e YFP) per rilevare il glucosio a livello cellulare. Consiste in un dominio di legame batterico del glucosio dal gene E. coli MglB fuso a CFP e YFP alle estremità opposte della molecola. Quando è legato a una molecola di glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che avvicina CFP e YFP e consente il FRET, che può quindi essere utilizzato per quantificare i livelli di glucosio intracellulare10,11,12 (Figura 1). Qui, mostriamo come il sensore FLII12Pglu-700μδ6 può essere utilizzato per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio causati dalla proteinopatia TDP-43 nei motoneuroni. Gli esperimenti qui descritti mostrano che la sovraespressione di un mutante associato alla SLA, TDP-43G298S, nei motoneuroni provoca un aumento significativo dell'assorbimento del glucosio rispetto ai controlli. Questo approccio può essere utilizzato in altri tipi di SLA (ad esempio, SOD1, C9orf72, ecc.) e / o altri tipi di cellule (ad esempio, glia, muscoli) per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio associati alla neurodegenerazione.
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Protocol
Le mosche transgeniche UAS FLII12Pglu-700μδ6 sono state riportate in Volkenhoff et al.10 e gentilmente fornite dal Dr. S. Schirmeier. Le linee transgeniche UAS TDP-43G298S sono state gentilmente fornite dal Dr. T. Iwatsubo13. Le linee di Drosophila ricombinanti che ospitano entrambi i transgeni UAS FLII12Pglu-700μδ6 e UAS TDP-43 sono state generate nel laboratorio di Zarnescu utilizzando approcci genetici standard e riportate in Manzo et al.9. D42 GAL4 è stato utilizzato per guidare l'espressione del sensore di glucosio da solo o insieme a TDP-43G298S nei motoneuroni. Tutte le linee di mosca sono mantenute su terreni di farina di mais melassa, a 25 °C in 12 ore di ciclo buio-luce.
1. Drosophila Ventral Nerve Cord (VNC) dissezioni
- Realizzare piatti di dissezione in elastomero siliconico.
- Versare i componenti in elastomero siliconico in un tubo da 50 ml come indicato nel protocollo del produttore e mescolare bene.
- Riempire piatti di coltura tissutale da 35 mm con circa 2 ml di miscela di elastomero. Utilizzare una siringa per rimuovere eventuali bolle. Coprire i piatti e metterli su una superficie piana in un forno a 60 °C durante la notte per indurire.
- Sezionare le larve di Drosophila per esporre il VNC mantenendo la vitalità dei tessuti.
- Raccogliere una terza larva instar errante, risciacquare con ddH2O, quindi metterla in una goccia di tampone HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM saccarosio, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES; pH 7,1) su un piatto rivestito in elastomero.
- Usando un paio di pinze (# 5 o 55 pinze) sotto un microscopio sezionante, appuntare le estremità anteriore e posteriore della larva lato dorsale verso l'alto, allungando attentamente la larva longitudinalmente con spilli per insetti (Minutein Pins).
- Fai un'incisione appena sopra il perno posteriore usando un paio di forbici angolate dell'iride. Fai un taglio verticale partendo dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva.
- Aggiungere alcune gocce di buffer HL-3, se necessario. Rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il SNC. Blocca i lembi che allungano la parete del corpo per esporre il SNC mantenendo intatto il sistema neuromuscolare (VVNC, assoni e giunzioni neuromuscolari).
2. Acquisizione di immagini
- Ottimizzare i parametri di imaging.
- Accendere il microscopio e i laser prima di iniziare le dissezioni. Le immagini devono essere acquisite utilizzando un microscopio confocale verticale con una lente ad immersione in acqua 40x. Utilizzare un laser a 405 nm per eccitare la CFP e acquisire le immagini in entrambi i canali di rilevamento CFP (465-499 nm) e FRET (535-695 nm).
- Ottimizza i parametri di acquisizione come velocità di scansione (6), media (2), obiettivo (40x), zoom (1x), dimensione stenopeica (1 AU) e risoluzione spaziale (512 x 512). Regolare il guadagno in modo tale che il segnale sia nella gamma dinamica ottimale. Gli stessi parametri devono essere utilizzati per tutti i genotipi.
- Immagine dei motoneuroni all'interno del VNC.
- Posizionare il piatto in silicone con il campione sezionato sotto la lente. Abbassare la lente in modo che entri in contatto con il tampone HL3 di trealosio-saccarosio (vedere 1.2.1). È fondamentale assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer. Aggiungere più buffer, se necessario.
- Utilizzare i canali CFP e FRET per selezionare manualmente una sezione ottica composta da almeno 6 motoneuroni a fuoco, situati lungo la linea mediana VNC. I motoneuroni vengono identificati in base all'espressione del sensore di glucosio e alla posizione lungo l'asse anteriore-posteriore.
- Acquisisci immagini ogni 10 s per 10 min. Queste immagini rappresentano la linea di base.
- Stimolare con glucosio integrato HL-3.
- Rimuovere il tampone di trealosio-saccarosio contenente HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e sostituirlo con 5 mM di glucosio integrato HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM di saccarosio, 5 mM di glucosio, 5 mM HEPES, pH 7,1). Questo passaggio deve essere eseguito con grande cura, per evitare il movimento del VNC il più possibile.
- Acquisisci immagini ogni 10 s per altri 10 minuti. Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione.
- Salva le immagini come file .czi o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome di file che includa data, background genetico, condizione sperimentale (linea di base o stimolazione) e canali utilizzati.
- Riutilizzare i parametri per l'immagine di tutti i genotipi (Figura 2A).
3. Elaborazione delle immagini e selezione del ROI
- Apri i file czi in Fiji / ImageJ e imposta la modalità colore: Scala di grigi, scegli Visualizza stack con: Hyperstacke seleziona Dividi canali in finestre separate.
- Elabora le immagini utilizzando i plugin di correzione della deriva: turboreg e stackreg. Ogni canale viene corretto separatamente selezionando Stackreg in Plugine quindi scegliendo Trasformazione: Traduzione.
- Selezionare manualmente le regioni di interesse (ROI) per estrarre il valore di grigio medio di ciascun canale.
- Scegli il ROI tracciando tutti i motoneuroni che rimangono a fuoco per l'intera serie temporale. Usa il ROI manager per salvare ogni contorno di motoneurone.
- Utilizzare la funzione Multi-misura per misurare il valore di grigio medio in ogni ROI in ogni punto temporale. Copia i ROI tracciati dal primo canale al secondo canale per l'immagine di pre-stimolazione.
- Ripeti questo processo per le immagini post-stimolazione in ciascun canale utilizzando le stesse cellule / ROI selezionate per l'immagine di pre-stimolazione.
4. Analisi dei dati
- Calcolate il rapporto FRET/CFP utilizzando i valori di grigio medi per i canali FRET e CFP. Le variazioni nei rapporti FRET/CFP riflettono alterazioni della concentrazione intracellulare di glucosio.
- Traccia i rapporti FRET/CFP per ogni ROI e time point rispetto al tempo. All'interno di ogni VNC alcuni dei ROI mostreranno un calo dei rapporti FRET / CFP dopo la stimolazione.
NOTA: Questo è interpretato come un'incapacità di alcuni neuroni di assorbire il glucosio, probabilmente a causa dello stress causato da dissezioni e sono quindi eliminati dall'analisi. I restanti rapporti FRET/CFP per ogni ROI e punto temporale sono mediati per generare un singolo rapporto FRET/CFP per punto temporale per genotipo (sensore di glucosio da solo e sensore di glucosio con TDP-43G298S). Questi singoli rapporti FRET/CFP vengono utilizzati per tutte le successive normalizzazioni. Sono stati analizzati 31 ROI per i controlli del sensore di glucosio e 24 ROI per TDP-43G298S.
- Traccia i rapporti FRET/CFP per ogni ROI e time point rispetto al tempo. All'interno di ogni VNC alcuni dei ROI mostreranno un calo dei rapporti FRET / CFP dopo la stimolazione.
- Normalizzazione al basale: calcolare la media dei rapporti FRET/CFP per i primi 10 minuti (baseline), quindi normalizzare i singoli rapporti FRET/CFP per ogni punto temporale dell'intero esperimento alla media basale di 10 min (vedere Figura 2B).
- Normalizzazione del punto temporale: normalizzare i rapporti TDP-43G298S FRET/CFP con i rapporti FRET/CFP dal solo sensore di glucosio in ogni punto temporale (vedere Figura 3A).
- Grafici a barre: per confronti tra basale e stimolazione sotto forma di grafici a barre, utilizzare i rapporti FRET/CFP da 5-10 minuti (basale) e 15-20 minuti (stimolazione) per ciascun genotipo. Normalizzare il rapporto di stimolazione rispetto al rapporto basale (vedere Figura 3B).
5. Analisi statistiche
- Valutare i set di dati normalizzati utilizzando la correzione di Mann-Whitney (per le normalizzazioni di base e timepoint) o il test di Kruskall-Walis (per la rappresentazione a barre della stimolazione rispetto ai rapporti FRET/CFP al basale).
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Representative Results
Acquisizione dell'immagine del sensore di glucosio nel cordone nervoso ventrale (VNC), ex vivo
Per determinare le differenze nell'assorbimento del glucosio in un modello di Drosophila di SLA basato su TDP-43, è stato utilizzato un sensore di glucosio a base di FRET geneticamente codificato. Il sensore comprendeva CFP e YFP fusi al dominio di legame del glucosio dal gene E. coli MglB. Il legame del glucosio provoca un cambiamento conformazionale, che può essere rilevato dal trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) tra la CFP e YFP 10,11,12. Quando il glucosio non è legato al sensore, l'eccitazione CFP causa solo l'emissione di CFP e quando il glucosio si lega, il segnale YFP può essere rilevato a causa del FRET che si verifica tra CFP e YFP (Figura 1A). Il driver D42 GAL4 è stato utilizzato per esprimere il sensore da solo o insieme al mutante TDP-43G298S associato alla SLA nei motoneuroni tramite il sistema di espressione bipartito UAS-GAL414. Le larve di terza stella sono state sezionate nel tampone HL3 senza glucosio e bloccate per esporre il sistema neuromuscolare, incluso il VNC ancora collegato alle giunzioni neuromuscolari tramite assoni del motoneurone. Il VNC è stato ripreso utilizzando una lente ad immersione in acqua 40x con una risoluzione spaziale di 512 x 512 pixel (vedere Protocollo e Figura 1B). I segnali CFP e FRET sono stati acquisiti rispettivamente nei modelli 465-499 nm e 535-695 nm, in seguito all'eccitazione CFP con il laser a 405 nm. La fetta da fotografare è stata scelta in base al piano in cui il VNC era visibile con un minimo di sei motoneuroni a fuoco lungo la linea mediana. Il piano selezionato è stato ripreso per 10 minuti, catturando un'immagine ogni 10 s per determinare la fluorescenza di base. I file czi sono stati salvati come: genotype_sample#_baseline. Dopo che il corso di tempo di 10 minuti è stato completato per le condizioni di base, il tampone è stato sostituito con HL3 integrato con glucosio. L'immagine è stata rimessa a fuoco per trovare lo stesso piano che è stato ripreso in condizioni di base. Le stesse impostazioni dell'immagine sono state utilizzate per tutti i campioni. Il VNC è stato quindi ripreso per 10 minuti acquisendo una nuova immagine ogni 10 s e salvato come: genotype_sample# _post stimolazione per ulteriori analisi.
Analisi delle immagini
Una sfida significativa con gli esperimenti di imaging dal vivo è la deriva che i VNC subiscono durante l'intervallo di imaging di 20 minuti. Per risolvere questo problema, un plug-in di correzione della deriva, Stackreg è stato utilizzato in FIJI prima dell'analisi delle immagini e della selezione del ROI (vedere Protocollo e Figura 2A). 6-8 singole celle/ROI sono state selezionate da ciascun VNC e delineate utilizzando il canale FRET/YFP. Le selezioni sono state copiate nel canale CFP e i valori di grigio medi sono stati misurati utilizzando la funzione multi-misura. Le quantificazioni sono state eseguite prima facendo la media dei rapporti FRET/CFP per punto temporale e quindi calcolando la media per l'intero 10 min per genotipo. Queste medie sono state poi utilizzate per normalizzare i rapporti FRET/CFP in ogni punto temporale e tracciate nel tempo per generare una prima valutazione dei dati (Figura 2B). Utilizzando questo approccio di normalizzazione, è stato scoperto che dopo la stimolazione, i motoneuroni di controllo che esprimono il solo sensore di glucosio, mostrano un piccolo ma significativo aumento dell'assorbimento del glucosio (3,9%,valore P < 0,0001) mentre i motoneuroni che esprimono TDP-43G298S mostrano un assorbimento di glucosio significativamente più elevato (16,76%,valore P < 0,0001). Questi dati sono coerenti con la proteinopatia TDP-43 che causa un aumento dell'assorbimento di glucosio nei motoneuroni, come precedentemente mostrato nel riferimento9.
Analisi dei dati - misurazione dell'assorbimento di glucosio nei motoneuroni nella Drosophila VNC
Per ottenere ulteriori informazioni sulle differenze tra i controlli e i motoneuroni mutanti TDP-43G298S, ogni rapporto FRET/CFP è stato normalizzato al controllo in ogni punto temporale (Figura 3A). Ciò consente un confronto nell'assorbimento del glucosio tra i motoneuroni della SLA che esprimono TDP-43G298S e i motoneuroni di controllo che esprimono il sensore di glucosio da solo in tempo reale. In condizioni basali, non c'era differenza tra i genotipi. Tuttavia, dopo la stimolazione con glucosio, è stato osservato un rapido (7,31% dopo 1 minuto di applicazione di glucosio) e un aumento significativo (12,76% dopo 10 minuti,valore P < 0,0001) nell'assorbimento di glucosio in TDP-43G298S rispetto al controllo.
I grafici a barre offrono un approccio alternativo per illustrare le differenze tra i genotipi (TDP-43G298S rispetto ai controlli) prima e dopo la stimolazione del glucosio (Figura 3B). Ciò è stato fatto normalizzando il rapporto FRET/ CFP per entrambe le condizioni rispetto alla linea di base dei rispettivi genotipi e tracciando il rapporto medio per gli ultimi 5 minuti di imaging di base e di stimolazione, rispettivamente. Al momento della stimolazione, i neuroni che esprimono il solo sensore di glucosio mostrano un piccolo ma significativo aumento del rapporto FRET/CFP (3,83% ± 0,08%,valore P < 0,0001) rispetto al basale. Mentre i neuroni che esprimono TDP-43G298S hanno mostrato un aumento significativo del rapporto FRET/CFP al momento della stimolazione (14,73% ± 0,08%,il valore P < 0,0001) rispetto al basale. La differenza netta nei rapporti FRET/CFP tra i motoneuroni che esprimono TDP-43G298S e il solo sensore di glucosio è del 10,9%(valore P = 0,005). Questa analisi mostra anche che i rapporti si stabilizzano intorno agli ultimi 5 minuti di ogni imaging del percorso temporale, quindi questo intervallo di tempo è stato scelto per il grafico. Questa analisi fornisce una panoramica di alto livello dei risultati, comprese le differenze statisticamente significative tra genotipi e trattamenti in un grafico.
Figura 1: Sensore FRET e acquisizione di immagini. (A) Diagramma del sensore di glucosio basato su FRET utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio nei motoneuroni. Il legame del glucosio causa il verificarsi di FRET. (B) Diagramma della dissezione della giunzione neuromuscolare (NMJ) che mostra l'area ripresa nel VNC. Immagini a sinistra che mostrano TDP-43G298S prima e dopo la stimolazione del glucosio in entrambi i canali FRET (YFP) e CFP. Barre di scala: 20 μm. Ingrandimento: 40x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi dell'immagine del sensore di glucosio nel contesto del mutante TDP-43. (A) Immagini rappresentative dei segnali FRET e CFP nei controlli dei sensori di glucosio e nei campioni TDP-43G298S in condizioni di base e di stimolazione. Un motoneurone rappresentativo è delineato in ogni immagine come esempio di ROI. Barre di scala: 20 μm. Ingrandimento: 40x. (B) I rapporti medi di FRET / CFP nel sensore di glucosio e nei motoneuroni mutanti TDP-43 su 20 minuti di imaging. I rapporti sono stati normalizzati al rapporto basale medio per ciascun genotipo (vedere normalizzazione al basale nel protocollo). I valori mostrati sono la media di 25-30 motoneuroni (ROI) da 5 VVC per genotipo. Mann-Whitney è stato utilizzato per valutare la significatività statistica. =Valore P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dei dati del sensore di glucosio nel contesto di TDP-43G298S. (A) I rapporti FRET/CFP di TDP-43G298S sono normalizzati al controllo del sensore di glucosio in ogni punto temporale. Mann-Whitney è stato utilizzato per valutare la significatività statistica. =Valore P < 0,0001. (B) La rappresentazione del grafico a barre dell'assorbimento di glucosio nel controllo del sensore di glucosio e TDP-43G298S mostra un aumento significativo dell'assorbimento del glucosio nei motoneuroni di controllo dopo stimolazione e nel contesto di TDP-43G298S rispetto ai controlli. Kruskall-Walis è stato utilizzato per valutare la significatività statistica. ** =Valore P < 0,01, **** =Valore P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La tecnica qui descritta in dettaglio può essere applicata per misurare l'assorbimento di glucosio in uno specifico tipo di cellula di interesse nella Drosophila viva utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, un sensore basato su FRET in grado di rilevare cambiamenti nei livelli di glucosio in un intervallo millimolare10,11,12. Questo sensore è stato precedentemente utilizzato in combinazione con il sistema UAS-GAL4 per indirizzare la sua espressione a specifici tipi di cellule, compresi i neuroni9,10. In questo studio, D42 GAL4 è stato utilizzato per esprimere FLII12Pglu-700μδ6 da solo o insieme a TDP-43G298S associato alla malattia per dimostrare come questo approccio possa essere utilizzato per valutare l'assorbimento del glucosio nei motoneuroni della SLA. Inoltre, questo metodo può essere applicato ampiamente per l'immagine di una moltitudine di sensori fluorescenti nel VNC larvale.
I passaggi critici del protocollo includono la massimizzazione del rapporto segnale-rumore. A tal fine, i parametri di acquisizione delle immagini sono stati impostati in modo tale che la fluorescenza non sia sovrasatura e l'intera gamma di intensità del segnale possa essere quantificata. I parametri di imaging come guadagno, velocità di scansione, dimensione del foro stenopeico e zoom sono rimasti invariati durante lo studio. Gli esperimenti sono stati eseguiti per diversi giorni; tuttavia, in ogni esperimento entrambi i genotipi, cioè i controlli e TDP-43G298S sono stati ripresi insieme per tenere conto della variabilità. L'imaging del SNC larvale di Drosophila utilizzando una lente ad immersione in acqua potrebbe dare origine a cambiamenti del piano ottico nel tempo. Bisogna fare attenzione ad evitare cambiamenti drastici nel piano ottico utilizzando un buffer sufficiente. I campioni con cambiamenti di messa a fuoco sono stati scartati.
Sebbene le condizioni e i parametri siano mantenuti invariati durante gli esperimenti, questa tecnica richiede un cambiamento nel buffer durante l'imaging. Dopo 10 minuti di imaging, il tampone privo di glucosio deve essere sostituito con un tampone HL-3 integrato con glucosio, che potrebbe modificare il piano focale ottico. La lente deve essere rimessa a fuoco sullo stesso piano focale in modo che lo stesso insieme di cellule venga ripreso prima e dopo l'integrazione di glucosio. Un sottogruppo di motoneuroni ha mostrato un calo dei rapporti FRET/CFP dopo la stimolazione. Ciò indica che alcuni neuroni non assorbono glucosio, probabilmente a causa dello stress causato dalla dissezione e sono stati eliminati dall'analisi.
La selezione del ROI, l'elaborazione e la quantificazione delle immagini sono state eseguite utilizzando Fiji/ImageJ. Mentre il ROI viene selezionato manualmente nella prima immagine della serie, è fondamentale correggere la deriva minore nell'imaging time lapse per mantenere il ROI invariabile in tutta la serie di imaging. Un plug-in di correzione della deriva open source, Stackreg, è stato utilizzato per spiegare questo problema.
La disponibilità del giusto laser di eccitazione è una delle principali limitazioni di questa tecnica. Sebbene il laser di eccitazione a 436 nm sia l'ideale per questo sensore di glucosio, abbiamo dimostrato che il sensore può essere utilizzato con il laser di eccitazione a 405 nm, che è più ampiamente disponibile. Un'altra limitazione a questa tecnica è che può essere utilizzata per misurare la dinamica del glucosio ma non le concentrazioni assolute di glucosio. Una potenziale strategia alternativa per misurare i livelli assoluti di glucosio è iGlucoSnFR-TS, un sensore di glucosio a vita, che può essere calibrato per misurare le concentrazioni assolute di glucosio15.
Il glucosio è una delle principali fonti di energia nel cervello ed è necessario per le funzioni fisiologiche. I difetti nel metabolismo del glucosio sono stati associati a diverse condizioni patologiche (esaminate in16). Drosophila è un potente modello genetico utilizzato per studiare i disturbi neurodegenerativi17. Tuttavia, ci sono tecniche limitate disponibili per misurare direttamente i livelli di glucosio in Drosophila. Questo sensore di glucosio basato su FRET fornisce una misura diretta dei cambiamenti intracellulari nei livelli di glucosio. Nonostante alcune sfide e limitazioni sperimentali, questo sensore può essere utilizzato con successo per studiare la dinamica del glucosio in specifici tipi di cellule (ad esempio, motoneuroni, glia, muscoli) in vari modelli di malattia, tra cui più tipi di SLA e disturbi neurodegenerativi correlati.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Stefanie Schirmeier e Takeshi Iwatsubo per aver fornito ceppi di Drosophila. Ringraziamo anche Patricia Jansma per l'assistenza con l'imaging nel Marley Imaging Core presso l'Università dell'Arizona. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (a DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (a EM) e il Undergraduate Biology Research Program (a HB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
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