Neuroscience

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62936

Suvithanandhini Loganathan*¹, Hannah E. Ball*¹, Ernesto Manzo^1,2, Daniela C. Zarnescu^1,3

¹Department of Molecular and Cellular Biology, University of Arizona, Tucson, ²Vollum Institute, Oregon Health and Science University, ³Department of Neuroscience, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

Summary

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

Abstract

טרשת אמיוטרופית לרוחב היא הפרעה ניווניות הגורמת לחולשת שרירים מתקדמת ומוות בתוך 2-5 שנים לאחר האבחון. ביטויים קליניים כוללים ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם; עם זאת, עדיין לא ברור כיצד אלה מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. באמצעות מודל Drosophila של חלבון TDP-43 כי recapitulates מספר תכונות של ALS כולל תכלילים ציטופלסמיים, תפקוד לקוי locomotor, ותוחלת חיים מופחתת, לאחרונה זיהינו ליקויים מטבוליים רחבים. בין אלה, גליקוליזה נמצאה upregulated וניסויי אינטראקציה גנטית סיפקו ראיות למנגנון neuroprotective מפצה. ואכן, למרות upregulation של phosphofructokinase, קצב הגבלת האנזים בגליקוליזיס, עלייה בגליקוליזיס באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הוכח כדי להקל על תפקוד לקוי locomotor ותוחלת חיים מוגברת במודלים זבובים של חלבון TDP-43. כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה על חלבון TDP-43 על שטף גליקוליטי בתאי עצב מוטוריים, דווח בעבר מקודד גנטית, חיישן מבוסס FRET, FLII12Pglu-700μδ6, שימש. חיישן זה מורכב מתחום חישת גלוקוז חיידקי וחלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב כצמד FRET. לאחר כריכת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המאפשר FRET להתרחש. באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, ספיגת גלוקוז נמצאה עלייה משמעותית נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43^G298S, גרסה הגורמת ALS. כאן, אנו מראים כיצד למדוד ספיגת גלוקוז, ex vivo, בתכשירי כבל עצב גחון זחל מבטא את חיישן גלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 בהקשר של חלבון TDP-43. גישה זו יכולה לשמש כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז ולהעריך שטף גליקוליטי בסוגי תאים שונים או בהקשר של מוטציות שונות הגורמות ALS והפרעות ניווניות הקשורות.

Introduction

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת כי הוא כרגע חשוכת מרפא. ALS משפיע על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים המובילים לאובדן קואורדינציה מוטורית, שיתוק בלתי הפיך, כשל נשימתי, ומוות בסופו של דבר בתוך 2-5 שנים של^{אבחון 1}. ALS קשורה פגמים מטבוליים כגון ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם (נבדק ב²); עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים אלה בחילוף החומרים מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. מכנה נפוץ ב- ALS ומחלות ניווניות הקשורות הוא TDP-43, חלבון מחייב חומצת גרעין המעורב במספר שלבים של עיבוד RNA³^,⁴^,⁵. למרות מוטציות ב TDP-43 משפיעות רק על 3%-5% מהחולים, חלבון מסוג TDP-43 מסוג בר נמצא בתוך אגרגטים ציטופלסמיים >97% ממקרי ALS (נבדק ב^-6). פתולוגיה זו עוצבה בדרוסופילה על ידי ביטוי יתר של סוג בר אנושי או מוטציה TDP-43 (G298S) בתאי עצב מוטוריים, אשר משחזר היבטים מרובים של ALS, כולל הכללות ציטופלסמיות, תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מופחתת⁷^,⁸. באמצעות מודלים אלה, דווח לאחרונה כי חלבון TDP-43 גורם לעלייה משמעותית ברמות הפירובאט וה-phosphofructokinase (PFK) mRNA, האנזים המגביל את קצב הגליקוליזיס⁹. עליות דומות בתמלילים PFK נמצאו נוירונים מוטוריים שמקורם בחולה וחוט השדרה, דבר המצביע על כך גליקוליזה הוא upregulated בהקשר של חלבון TDP-43. מעניין, עלייה נוספת בגליקוליזה באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הקלה על מספר פנוטיפים של ALS כגון תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מוגברת במודלים של פרוטאינופתיה TDP-43, עולה בקנה אחד עם מנגנון מפצה, neuroprotective נוירונים מוטוריים מתנוונים.

כדי לחקור שינויים נוספים בגליקוליזיס ולמדוד את ספיגת הגלוקוז במודלים Drosophila של חלבון TDP-43, חיישן מבוסס FRET שדווח בעבר מקודד גנטית FLII12Pglu-700μδ6¹⁰ בא לידי ביטוי נוירונים מוטוריים במיוחד באמצעות מערכת הביטוי UAS-GAL4. חיישן הגלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 משתמש בהעברת אנרגיית תהודה בין שתי גרסאות של חלבון פלואורסצנטי ירוק, ציאני וחלבוני פלורסנט צהובים (CFP ו- YFP) כדי לזהות גלוקוז ברמה התאית. הוא מורכב מתחום מחייב גלוקוז חיידקי מהגן E. coli MglB התמזג CFP ו YFP בקצוות מנוגדים של המולקולה. כאשר הוא קשור למולקולת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המקרב את CFP ו- YFP זה לזה ומאפשר ל- FRET להתרחש, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לכמת את רמות הגלוקוז התאי^10,¹¹^,¹² ( איור1). כאן, אנו מראים כיצד חיישן FLII12Pglu-700μδ6 יכול לשמש כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הנגרמים על ידי חלבון TDP-43 בתאי עצב מוטוריים. הניסויים המתוארים כאן מראים כי ביטוי יתר של מוטציה הקשורה ALS, TDP-43^G298S, בתאי עצב מוטוריים גורם לעלייה משמעותית בספיגת הגלוקוז בהשוואה לבקרות. גישה זו יכולה לשמש בסוגים אחרים של ALS (למשל, SOD1, C9orf72 וכו ') ו/או סוגי תאים אחרים (למשל, גליה, שרירים) כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הקשורים ניוון עצבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הזבובים הטרנסגניים UAS FLII12Pglu-700μδ6 דווחו בוולקנהוף ואח'^{10 וסיפקו} בחביבות על ידי ד"ר ס. שירמאייר. הקווים הטרנסגניים של UAS TDP-43^G298S סופקו בחביבות על ידי ד"ר ט. איווצובו^13. קווים Drosophila רקומביננטי מחסה הן UAS FLII12Pglu-700μδ6 ו UAS TDP-43 טרנסגנים נוצרו במעבדת Zarnescu באמצעות גישות גנטיות סטנדרטיות ודווחו מנזו ואח^'9. D42 GAL4 שימש להנעת הביטוי של חיישן הגלוקוז לבד או יחד עם TDP-43^G298S בתאי עצב מוטוריים. כל קווי הזבוב נשמרים על מדיה קמח תירס מולסה, ב 25 °C (5 °F) ב 12 שעות כהה: מחזור אור.

1. ניתוחי חבל עצב גחון של דרוזופילה (VNC)

הפוך סיליקון אלסטומר מנות ניתוח.
1. יוצקים רכיבי אלסטומר סיליקון לתוך צינור 50 מ"ל כפי שצוין בפרוטוקול היצרן ומערבבים היטב.
2. מלאו מנות תרבית רקמות 35 מ"מ עם כ 2 מ"ל של תערובת אלסטומר. השתמש במזרק כדי להסיר בועות. מכסים את הכלים ומניחים אותם על משטח מפלס בתנור 60 מעלות צלזיוס לילה כדי לרפא.
לנתח זחלי Drosophila לחשוף את VNC תוך שמירה על כדאיות רקמות.
1. לאסוף זחל instar השלישי נודד, לשטוף עם ddH₂O, ולאחר מכן למקם אותו טיפה של HL3-buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM סוכרוז, 5 mM trehalose, 5 mM HEPES; pH 7.1) על צלחת מרופדת אלסטומר.
2. באמצעות זוג מלקחיים (#5 או 55 מלקחיים) תחת מיקרוסקופ ניתוח, הצמד את הקצוות הקדמיים והאחוריים של צד הזחלים למעלה, בזהירות למתוח את הזחל לאורך עם סיכות חרקים (סיכות Minutein).
3. לעשות קיסם ממש מעל הסיכה האחורית באמצעות זוג מספריים קשתית זוויתית. לעשות חתך אנכי החל מהחתך לכיוון הקצה החלקה, בקצהו של הזחל.
4. הוסף כמה טיפות של מאגר HL-3 במידת הצורך. הסר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע ל- CNS. הצמד את המדפים המותחים את דופן הגוף כדי לחשוף את מערכת החזותית תוך שמירה על המערכת הנוירו-שרירית (VNCs, אקסונים וצמתים עצביים-שריריים) ללא פגע.

2. רכישת תמונות

מטב את פרמטרי ההדמיה.
1. הפעל את המיקרוסקופ ואת הלייזר לפני תחילת ניתוחים. יש לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל זקוף עם עדשת טבילת מים פי 40. השתמש בלייזר 405 ננומטר כדי לרגש את CFP ולרכוש את התמונות הן בערוצי הזיהוי CFP (465-499 ננומטר) והן בערוצי הזיהוי FRET (535-695 ננומטר).
2. מטב פרמטרי רכישה כגון מהירות סריקה (6), ממוצע (2), מטרה (40x), זום (1x), גודל חור סיכה (1 AU) ורזולוציה מרחבית (512 x 512). התאם את הרווח כך שהאות נמצא בטווח הדינמי האופטימלי. יש להשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים.
תמונה נוירונים מוטוריים בתוך VNC.
1. מניחים את צלחת הסיליקון עם הדגימה המנותחת מתחת לעדשה. הנמיכו את העדשה כך שהיא תבוא במגע עם חוצץ טרהלוז-סוכרוז HL3 (ראו 1.2.1). זה קריטי כדי להבטיח כי העדשה שקועה לחלוטין במאגר. הוסף מאגר נוסף במידת הצורך.
2. השתמש בערוצי CFP ו- FRET כדי לבחור באופן ידני מקטע אופטי המורכב לפחות 6 נוירונים מוטוריים בפוקוס, הממוקם לאורך קו האמצע של VNC. הנוירונים המוטוריים מזוהים על סמך הביטוי של חיישן הגלוקוז והמיקום לאורך הציר הקדמי-אחורי.
3. לרכוש תמונות כל 10 s במשך 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.
לעורר עם גלוקוז בתוספת HL-3.
1. הסר trehalose-סוכרוז המכיל HL3-buffer באמצעות פיפטה פסטר ולהחליף אותו עם גלוקוז 5 mM בתוספת HL-3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM סוכרוז, גלוקוז 5 mM, 5 mM HEPES, pH 7.1). שלב זה צריך להתבצע בזהירות רבה, כדי למנוע את התנועה של VNC ככל האפשר.
2. לרכוש תמונות כל 10 s במשך 10 דקות נוספות. תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי.
שמור את התמונות כקבצי .czi או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסיוני (בסיסי או גירוי) וערוצים המשמשים.
שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים (איור 2A).

3. עיבוד תמונה ובחירת ROI

פתחו את קבצי ה- czi בפיג'י/ImageJ והגדירו את מצב צבע: גווני אפור, בחרו 'הצג מחסנית עם: הערימה של היפר-ערימה' ובחרו 'פצל ערוצים ל- Windows נפרד'.
עבדו תמונות באמצעות התוספים לתיקון הסחף: turboreg ו-stackreg. כל ערוץ מתוקן בנפרד על-ידי בחירת Stackreg תחת תוספיםולאחר מכן בחר המרה: תרגום.
בחר באופן ידני את אזורי העניין (ROIs) כדי לחלץ את הערך האפור הממוצע של כל ערוץ.
1. בחר את ROIs על ידי מעקב אחר כל הנוירונים המוטוריים שנותרו בפוקוס לאורך כל סדרת הזמן. השתמש במנהל ההבהבה כדי לשמור כל קו מתאר של נוירון מוטורי.
2. השתמש בפונקציה Multi-measure כדי למדוד את הערך האפור הממוצע בכל עלה על תנאי בכל נקודת זמן. העתק את ההבערה שאותרה מהערוץ הראשון לערוץ השני עבור תמונת קדם-גירוי.
3. חזור על תהליך זה עבור התמונות שלאחר הגירוי בכל ערוץ באמצעות אותם תאים/החזרי ROIs שנבחרו עבור התמונה שלפני הגירוי.

4. ניתוח נתונים

חשב את יחס FRET/CFP, באמצעות הערכים האפורים הממוצעים עבור ערוצי FRET ו- CFP. שינויים ביחס FRET/CFP משקפים שינויים בריכוז הגלוקוז התאי.
1. התווה יחסי FRET/CFP עבור כל נקודת ROI ונקודת זמן לעומת זמן. בתוך כל VNC חלק מההגות יציגו ירידה ביחסי FRET/CFP לאחר גירוי.
  הערה: זה מתפרש כחוית יכולת של נוירונים מסוימים ספיגת גלוקוז, אולי בגלל מתח שנגרם על ידי ניתוחים ולכן מסולקים מהניתוח. יחסי FRET/CFP הנותרים עבור כל ROI ונקודת זמן הם בממוצע כדי ליצור יחס FRET / CFP יחיד לכל נקודת זמן לכל גנוטיפ (חיישן גלוקוז לבד וחיישן גלוקוז עם TDP-43^G298S). יחסי FRET/CFP יחידים אלה משמשים עבור כל הנורמליזציה הבאה. 31 ROIs נותחו עבור פקדי חיישן גלוקוז ו 24 ROIs נותחו עבור TDP-43^G298S.
נורמליזציה בסיסית: חשב את הממוצע של יחסי FRET/CFP עבור 10 הדקות הראשונות (בסיסיות) ולאחר מכן נרמל יחסי FRET/CFP בודדים עבור כל נקודת זמן של הניסוי כולו לממוצע הבסיסי של 10 דקות (ראה איור 2B).
נורמליזציה של נקודות זמן: נרמל יחס TDP-43^G298S FRET/CFP ליחסי FRET/CFP מחיישן הגלוקוז בלבד בכל נקודת זמן (ראו איור 3A).
תרשימי עמודות: להשוואות בסיסיות לעומת גירויים בצורה של תרשימי עמודות, השתמש ביחסי FRET/CFP בין 5-10 דקות (בסיסי) ו-15-20 דקות (גירוי) עבור כל גנוטיפ. נרמל יחס גירוי ליחס הבסיס (ראו איור 3B).

5. ניתוחים סטטיסטיים

להעריך את ערכות הנתונים מנורמל באמצעות תיקון מאן-ויטני (עבור נורמליזציה בסיסית ונקודת זמן) או מבחן Kruskall-Walis (עבור ייצוג גרף עמודות של גירוי לעומת יחסי FRET / CFP בסיסי).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רכישת תמונה של חיישן הגלוקוז במתג העצב הגחון (VNC), ex vivo
כדי לקבוע הבדלים בספיגת הגלוקוז במודל Drosophila של ALS המבוסס על TDP-43, נעשה שימוש בחיישן גלוקוז מבוסס FRET מקודד גנטית. החיישן כלל CFP ו- YFP התמזגו לתחום כריכת הגלוקוז מהגן E. coli MglB. כריכת גלוקוז מעוררת שינוי קונפורמציה, אשר ניתן לזהות על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) בין CFP ו YFP ¹⁰^,¹¹^,¹². כאשר גלוקוז אינו מאוגד לחיישן, עירור CFP גורם לפליטת CFP בלבד, וכאשר גלוקוז נקשר, ניתן לזהות את אות ה- YFP עקב FRET המתרחש בין CFP ל- YFP (איור 1A). מנהל ההתקן D42 GAL4 שימש כדי לבטא את החיישן לבד או יחד עם מוטציה הקשורים ALS TDP-43^G298S בתאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת ביטוי UAS-GAL4 דו-מפלגתית¹⁴. זחלי instar השלישי נותחו במאגר HL3 ללא גלוקוז והוצמדו כדי לחשוף את המערכת הנוירו-שרירית, כולל ה- VNC שעדיין מחובר לצומת הנוירו-שרירי באמצעות אקסונים של נוירונים מוטוריים. ה-VNC צולם באמצעות עדשת טבילת מים פי 40 ברזולוציה מרחבית של 512 x 512 פיקסלים (ראו פרוטוקול ואיור 1B). אותות CFP ו- FRET נרכשו ב 465-499 nm ו 535-695 ננומטר, בהתאמה, לאחר עירור CFP עם לייזר 405 ננומטר. הפרוסה להדגמה נבחרה בהתבסס על המישור שבו ה- VNC היה גלוי עם מינימום של שישה נוירונים מוטוריים בפוקוס לאורך קו האמצע. המישור שנבחר צולם במשך 10 דקות, ולכד תמונה כל 10 s כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות הבסיסית. קבצי czi נשמרו כ: genotype_sample#_baseline. לאחר קורס הזמן של 10 דקות הושלם עבור תנאים בסיסיים, המאגר הוחלף גלוקוז בתוספת HL3. התמונה התמקדה מחדש כדי למצוא את אותו מישור שהתמונה הייתה בתנאים בסיסיים. אותן הגדרות תמונה שימשו עבור כל הדגימות. לאחר מכן ה- VNC צולם שוב במשך 10 דקות ברכישת תמונה חדשה כל 10 s ונשמר כמו: גירוי genotype_sample #_post עבור ניתוחים נוספים.

ניתוח תמונה
אתגר משמעותי עם ניסויי הדמיה חיה הוא הסחף כי VNCs לעבור במהלך מרווח ההדמיה של 20 דקות. כדי לטפל בבעיה זו, תוסף לתיקון סחיפה, נעשה שימוש ב- Stackreg ב- FIJI לפני ניתוח תמונה ובחירת ROI (ראה פרוטוקול ואיור 2A). 6-8 תאים בודדים/ROIs נבחרו מכל VNC וקווי מתאר באמצעות ערוץ FRET/YFP. הבחירות הועתקו לערוץ CFP, והערכים האפורים הממוצעים נמדדו באמצעות הפונקציה multi-measure. כימותים בוצעו על ידי חישוב ממוצע של יחסי FRET/CFP לנקודת זמן, ולאחר מכן חישוב הממוצע עבור כל 10 דקות לכל גנוטיפ. ממוצעים אלה שימשו אז לנרמול יחסי FRET/CFP בכל נקודת זמן והתוות לאורך זמן כדי ליצור הערכה ראשונה של הנתונים (איור 2B). באמצעות גישת נורמליזציה זו, נמצא כי עם גירוי, נוירונים מוטוריים שליטה המבטאים חיישן גלוקוז בלבד, מציגים עלייה קטנה אך משמעותית בספיגת הגלוקוז (3.9%,_ערך P < 0.0001) בעוד נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43^G298S מראים ספיגת גלוקוז גבוהה משמעותית (16.76%,_ערך P < 0.0001). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם חלבון TDP-43 הגורם לספיגת גלוקוז מוגברת בתאי עצב מוטוריים, כפי שהוצג בעבר בהתייחסות⁹.

ניתוחי נתונים - מדידת ספיגת גלוקוז בתאי עצב מוטוריים ב- VNC של Drosophila
כדי לקבל תובנות נוספות על ההבדלים בין פקדים לבין נוירונים מוטוריים מוטנטיים TDP-43^G298S, כל יחס FRET / CFP היה מנורמל לבקרה בכל נקודת זמן (איור 3A). זה מאפשר השוואה בספיגת גלוקוז בין נוירונים מוטוריים ALS המבטאים TDP-43^G298S ולשלוט נוירונים מוטוריים המבטאים את חיישן הגלוקוז לבד בזמן אמת. בתנאים בסיסיים, לא היה הבדל בין הגנוטיפים. עם זאת, עם גירוי עם גלוקוז, מהיר (7.31% לאחר 1 דקות של יישום גלוקוז) ועלייה משמעותית (12.76% לאחר 10 דקות,_ערך P < 0.0001) בספיגת גלוקוז נצפתה TDP-43^G298S בהשוואה לשליטה.

תרשימי עמודות מציעים גישה חלופית להמחשת ההבדלים בין גנוטיפים (TDP-43^G298S לעומת פקדים) לפני ואחרי גירוי גלוקוז (איור 3B). זה נעשה על ידי נרמול יחס FRET / CFP עבור שני התנאים לקו הבסיס של הגנוטיפים המתאימים והתוויית היחס הממוצע עבור 5 הדקות האחרונות של הדמיית בסיסית וגירוי, בהתאמה. עם גירוי, נוירונים המבטאים חיישן גלוקוז לבדם מראים עלייה קטנה אך משמעותית ביחס FRET/CFP (3.83% ± 0.08%,_ערך P < 0.0001) בהשוואה לקו הבסיס. בעוד נוירונים המביעים TDP-43^G298S הראו עלייה משמעותית ביחס FRET/CFP עם גירוי (14.73% ± 0.08%,_ערך P < 0.0001) בהשוואה לקו הבסיס. ההבדל נטו ביחסי FRET/CFP בין נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43^G298S וחיישן גלוקוז בלבד הוא 10.9%_(ערך P = 0.005). ניתוח זה גם מראה כי היחסים מתייצבים סביב 5 הדקות האחרונות של כל הדמיה של קורס זמן, כך שמסגרת הזמן הזו נבחרה לגרף. ניתוח זה מספק סקירה ברמה גבוהה של התוצאות, כולל הבדלים מובהקים סטטיסטית בין גנוטיפים וטיפולים בגרף אחד.

איור 1: חיישן FRET ורכישת תמונה. (A)דיאגרמת חיישן גלוקוז מבוססת FRET המשמשת למדידת ספיגת גלוקוז בתאי עצב מוטוריים. כריכת גלוקוז גורמת FRET להתרחש. (B)דיאגרמה של צומת עצבית (NMJ) דיסקציה המציגה אזור בתמונה ב- VNC. תמונות משמאל המציגות TDP-43^G298S לפני ואחרי גירוי גלוקוז הן בערוצי FRET (YFP) והן בערוצי CFP. סרגלי קנה מידה: 20 מיקרומטר. הגדלה: 40x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח תמונה של חיישן גלוקוז בהקשר של מוטציה TDP-43. (A)תמונות מייצגות של אותות FRET ו- CFP בבקרות חיישן גלוקוז ודגימות TDP-43^G298S בתנאי בסיס וגירוי. נוירון מוטורי מייצג מתואר בכל תמונה כדוגמה ל- ROI. מוטות קנה מידה: 20 מיקרומטר. הגדלה: 40x. (B)היחסים הממוצעים של FRET / CFP בחיישן גלוקוז נוירונים מוטוריים מוטנטיים TDP-43 מעל 20 דקות של הדמיה. היחסים נוטרלו ליחס הבסיס הממוצע עבור כל גנוטיפ (ראה נורמליזציה בסיסית בפרוטוקול). הערכים המוצגים הם הממוצע של 25-30 נוירונים מוטוריים (ROI) מ 5 VNCs לכל גנוטיפ. מאן-וויטני שימש להערכת מובהקות סטטיסטית. =_ערך P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח נתונים של חיישן גלוקוז בהקשר של TDP-43^G298S. (A)יחסי FRET/CFP של TDP-43^G298S מנורמלים לבקרת חיישן גלוקוז בכל נקודת זמן. מאן-וויטני שימש להערכת מובהקות סטטיסטית. =_ערך P < 0.0001. (B)ייצוג גרף בר של ספיגת גלוקוז בבקרת חיישן גלוקוז ו TDP-43^G298S מראה עלייה משמעותית בספיגת הגלוקוז בתאי העצב המוטוריים שליטה בעת גירוי ובהקשר של TDP-43^G298S בהשוואה לבקרות. Kruskall-Walis שימש להערכת מובהקות סטטיסטית. ** =_ערך P < 0.01, **** =_ערך P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הטכניקה המתוארת בפירוט כאן ניתן ליישם כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בסוג מסוים של עניין Drosophila חי באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, חיישן מבוסס FRET אשר יכול לזהות שינויים ברמות הגלוקוז לטווח מילימולרי^10,¹¹^,¹². חיישן זה שימש בעבר בשילוב עם מערכת UAS-GAL4 כדי למקד את הביטוי שלו לסוגי תאים ספציפיים, כולל נוירונים⁹^,¹⁰. במחקר זה, D42 GAL4 שימש לבטא FLII12Pglu-700μδ6 בכוחות עצמו או יחד עם מחלה הקשורים TDP-43^G298S כדי להדגים כיצד גישה זו יכולה לשמש כדי להעריך את ספיגת הגלוקוז נוירונים מוטוריים ALS. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לדמיין שפע של חיישנים פלואורסצנטיים ב- VNC זחל.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים את מיקסום יחס האות לרעש. לכך נקבעו פרמטרי רכישת תמונה כך שהפלואורסצנטיות אינה רוויה יתר על המידה, וניתן לכמת את הטווח המלא של עוצמת האות. פרמטרי הדמיה כגון רווח, מהירות סריקה, גודל חור הסיכה וזום נותרו ללא שינוי לאורך המחקר. הניסויים בוצעו במשך מספר ימים; עם זאת, בכל ניסוי הן הגנוטיפים, כלומר הפקדים והן TDP-43^G298S צולמו יחד כדי להסביר את השונות. הדמיית Drosophila זחל CNS באמצעות עדשת טבילת מים יכול לגרום לשינויים במישור אופטי לאורך זמן. יש להקפיד להימנע משינויים דרסטיים במישור האופטי באמצעות חיץ מספיק. דוגמאות עם שינויים במוקד נמחקו.

למרות שהתנאים והפרמטרים נשמרים ללא שינוי לאורך הניסויים, טכניקה זו דורשת שינוי במאגר במהלך ההדמיה. לאחר 10 דקות של הדמיה יש להחליף את מאגר הגלוקוז ללא גלוקוז במאגר HL-3 בתוספת גלוקוז, מה שעשוי לשנות את מישור המוקד האופטי. העדשה חייבת להיות ממוקדת מחדש לאותו מישור מוקד, כך שאותה קבוצה של תאים תמונה לפני ואחרי תוספי גלוקוז. תת-קבוצה של נוירונים מוטוריים הציגה ירידה ביחסי FRET/CFP בעקבות גירוי. זה מצביע על כך נוירונים מסוימים לא ספיגת גלוקוז, אולי בגלל מתח שנגרם על ידי ניתוח והם בוטלו מהניתוח.

בחירת ROI, עיבוד וכימות תמונה בוצעו באמצעות פיג'י/ImageJ. בעוד ROI נבחר באופן ידני בתמונה הראשונה של הסדרה, זה קריטי כדי לתקן סחיפה קלה בהדמיית זמן לשגות כדי לשמור על ROI זמין לאורך סדרת ההדמיה. תוסף תיקון דריפט בקוד פתוח, Stackreg, שימש לחשבון עבור בעיה זו.

הזמינות של לייזר העירור הנכון היא מגבלה גדולה לטכניקה זו. למרות לייזר עירור 436 ננומטר הוא אידיאלי עבור חיישן גלוקוז זה, הראינו כי החיישן יכול לשמש עם לייזר עירור 405 ננומטר, אשר זמין באופן נרחב יותר. מגבלה נוספת לטכניקה זו היא שניתן להשתמש בה כדי למדוד דינמיקה של גלוקוז אך לא ריכוזי גלוקוז מוחלטים. אסטרטגיה חלופית פוטנציאלית למדידת רמות גלוקוז מוחלטות היא iGlucoSnFR-TS, חיישן גלוקוז לכל החיים, אשר ניתן לכייל כדי למדוד ריכוזי גלוקוז מוחלטים¹⁵.

גלוקוז הוא מקור אנרגיה מרכזי במוח והוא נדרש לתפקודים פיזיולוגיים. פגמים בחילוף החומרים של גלוקוז קושרו למספר מצבים פתולוגיים (נבדקו ב¹⁶). Drosophila הוא מודל גנטי רב עוצמה המשמש לחקר הפרעות ניווניות¹⁷. עם זאת, ישנן טכניקות מוגבלות זמינות למדוד ישירות את רמות הגלוקוז בדרוסופילה. חיישן גלוקוז מבוסס FRET זה מספק מדד ישיר של שינויים תאיים ברמות הגלוקוז. למרות כמה אתגרים ומגבלות ניסיוניים חיישן זה יכול לשמש בהצלחה כדי ללמוד דינמיקת גלוקוז בסוגי תאים ספציפיים (למשל, נוירונים מוטוריים, גליה, שרירים) במודלים שונים של מחלות, כולל סוגים מרובים של ALS והפרעות ניווניות הקשורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים לסטפני שירמאייר וטוקשי איווצובו על שסיפקו זני דרוזופילה. אנו מודים גם לפטרישיה ג'נסמה על הסיוע בהדמיה בליבת ההדמיה של מארלי באוניברסיטת אריזונה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH NS091299, NS115514 (ל- DCZ), מלגת HHMI גיליאם (ל- EM) והתוכנית לחקר הביולוגיה לתואר ראשון (ל- HB).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm tissue culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430165
40X water immersion lens	Zeiss	440090	dippable, N.A. 0.8
dissection scissors	Roboz	RS-5618
Dumont #5 forceps	VWR	100189-236
Dumont #55 forceps	VWR	100189-244
Minutien pins	Fine Science tools	26002-10	used for dissections
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dow	1317318
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope	Zeiss	N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).
Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).

Neuroscience

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.