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Neuroscience

मुरीन रेटिना में एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर विधि

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/63038
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

Summary

यह प्रोटोकॉल छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन, इंट्राविट्रियल इंजेक्शन, रेटिना इमेजिंग और रेटिना जीनोमिक डीएनए अलगाव के साथ डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) का उपयोग करके माउस रेटिना में एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता की मात्रा कैसे निर्धारित करता है।

Abstract

कई रेटिना सेल जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं अब नियमित रूप से जीन संपादन और नियामक अनुप्रयोगों के लिए Adeno से जुड़े वायरस (AAVs) का उपयोग करें । एएवी ट्रांसडक्शन की दक्षता आमतौर पर महत्वपूर्ण होती है, जो समग्र प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करती है। ट्रांसडक्शन दक्षता के लिए मुख्य निर्धारकों में से एक एएवी वेक्टर का सेरोटाइप या संस्करण है। वर्तमान में, सेल सरफेस रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए विभिन्न कृत्रिम एएवी सेरोटाइप और वेरिएंट विभिन्न समानताओं के साथ उपलब्ध हैं। रेटिना जीन थेरेपी के लिए, इसके परिणामस्वरूप विभिन्न रेटिना सेल प्रकारों के लिए ट्रांसडक्शन क्षमता की अलग-अलग डिग्री होती है। इसके अलावा, इंजेक्शन मार्ग और एएवी उत्पादन की गुणवत्ता रेटिना एएवी ट्रांसडक्शन क्षमता को भी प्रभावित कर सकती है। इसलिए, विभिन्न वेरिएंट, बैचों और पद्धतियों की दक्षता की तुलना करना आवश्यक है। डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) विधि उच्च परिशुद्धता के साथ न्यूक्लिक एसिड की मात्रा को निर्धारित करती है और बिना किसी मानक या संदर्भ के किसी दिए गए लक्ष्य की पूर्ण मात्राकरण करने की अनुमति देती है। डीडी-पीसीआर का उपयोग करके, इंजेक्शन रेटिना के भीतर एएवी जीनोम कॉपी नंबरों की पूर्ण मात्राकरण द्वारा एएवी की ट्रांसडक्शन क्षमता का आकलन करना भी संभव है। यहां, हम डीडी-पीसीआर का उपयोग करके रेटिना कोशिकाओं में एएवी की ट्रांसडक्शन दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं। मामूली संशोधनों के साथ, यह पद्धति माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए की कॉपी संख्या क्वांटिफिकेशन के साथ-साथ आधार संपादन की दक्षता का आकलन करने के लिए भी आधार हो सकती है, जो कई रेटिना रोगों और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है।

Introduction

Adeno संबद्ध वायरस (AAVs) अब आमतौर पर रेटिना जीन थेरेपी अध्ययन की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है । एएवी कम इम्यूनोजेनिसिटी और कम जीनोम एकीकरण के साथ जीन वितरण का एक सुरक्षित और कुशल तरीका प्रदान करते हैं। लक्ष्य कोशिका में एएवी प्रवेश एंडोसाइटोसिस के माध्यम से होता है, जिसके लिए कोशिका की सतह1,2पर रिसेप्टर्स और सह-रिसेप्टर्स के बाध्यकारी की आवश्यकता होती है। इसलिए, विभिन्न सेल प्रकारों के लिए एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता मुख्य रूप से कैप्सिड और मेजबान सेल रिसेप्टर्स के साथ इसकी बातचीत पर निर्भर करती है। एएवी में सेरोटाइप होते हैं और प्रत्येक सेरोटाइप में अलग सेलुलर/टिश्यू ट्रॉपिज्म और ट्रांसडक्शन क्षमता हो सकती है । वायरस कैप्सिड के रासायनिक संशोधन, हाइब्रिड कैप्सिड के उत्पादन, पेप्टाइड प्रविष्टि, कैप्सिड फेरबदल, निर्देशित विकास, और तर्कसंगत म्यूटेनेसिस3के रासायनिक संशोधन द्वारा उत्पन्न कृत्रिम एएवी सेरोटाइप और वेरिएंट भी हैं। यहां तक कि अमीनो एसिड सीक्वेंस या कैप्सिड संरचना में मामूली परिवर्तनों का मेजबान कोशिका कारकों के साथ बातचीत पर प्रभाव पड़ सकता है और इसके परिणामस्वरूप विभिन्न ट्रोपिज्म4हो सकते हैं । कैप्सिड वेरिएंट के अलावा, इंजेक्शन मार्ग और एएवी उत्पादन के बैच-टू-बैच भिन्नता जैसे अन्य कारक न्यूरोनल रेटिना में एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, विभिन्न वेरिएंट के लिए ट्रांसडक्शन दरों की तुलना के लिए विश्वसनीय तरीके आवश्यक हैं।

AAV ट्रांसडक्शन दक्षता का निर्धारण करने के लिए अधिकांश तरीके रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं। इनमें फ्लोरोसेंट इमेजिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, वेस्टर्न ब्लॉट, या रिपोर्टर जीन प्रोडक्ट5,6,7का हिस्टोकेमिकलएनालिसिसशामिल है । हालांकि, AAVs के आकार की बाधा के कारण, यह हमेशा के लिए रिपोर्टर जीन शामिल करने के लिए स्थानांतरण दक्षता की निगरानी संभव नहीं है । हाइब्रिड सीएमवी एन्हांसर/चिकन बीटा-ऐक्टिन या वुडचक हेपेटाइटिस पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेटरी एलिमेंटेशन एलिमेंटेशनल (डब्ल्यूपीआरई) जैसे मजबूत प्रमोटरों का इस्तेमाल एमआरएनए स्टेबलाइजर सीक्वेंस के रूप में और आकार की समस्या8को जटिल बना देता है । इसलिए, इंजेक्शन एएवी की ट्रांसडक्शन दर को अधिक प्रत्यक्ष पद्धति के साथ परिभाषित करना भी फायदेमंद होगा।

डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडी-पीसीआर) नमूनों की मिनट मात्रा से लक्ष्य डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। डीडी-पीसीआर तकनीक तेल की बूंदों द्वारा लक्ष्य डीएनए और पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के एनकैप्सुलेशन पर निर्भर करती है। प्रत्येक डीडी-पीसीआर प्रतिक्रिया में हजारों बूंदें होती हैं। प्रत्येक बूंद को एक स्वतंत्र पीसीआर प्रतिक्रिया के रूप में संसाधित और विश्लेषण कियाजाताहै । बूंदों का विश्लेषण केवल पॉइसन एल्गोरिदम का उपयोग करके किसी भी नमूने में लक्षित डीएनए अणुओं की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की गणना करने में सक्षम बनाता है। चूंकि एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता न्यूरोनल रेटिना में एएवी जीनोम की कॉपी संख्या के साथ सहसंबद्ध है, इसलिए हमने एएवी जीनोम की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीडी-पीसीआर विधि का उपयोग किया।

यहां, हम रेटिना जीनोमिक डीएनए6,10से एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन दक्षता की गणना करने के लिए डीडी-पीसीआर पद्धति का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, TDTomato रिपोर्टर व्यक्त करने वाले AAVs को छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, और डीडी-पीसीआर विधि11द्वारा टिटर किया गया था। दूसरे, AAVs को न्यूरोनल रेटिना में इंट्राविटली इंजेक्ट किया गया था । ट्रांसडक्शन दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पहले tdTomato अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की। इसके बाद डीडी-पीसीआर का उपयोग कर इंजेक्शन रेटिना में एएवी जीनोम की मात्रा के लिए जीनोमिक डीएनए का अलगाव किया गया । डीडी-पीसीआर द्वारा निर्धारित ट्रांसड्यूडेड एएवी जीनोम के साथ टीडीटोमाटो अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना से पता चला है कि डीडी-पीसीआर विधि ने एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन दक्षता को सटीक रूप से निर्धारित किया है। हमारे प्रोटोकॉल ने एएवी ट्रांसडक्शन क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए डीडी-पीसीआर आधारित कार्यप्रणाली का विस्तृत विवरण प्रदर्शित किया। इस प्रोटोकॉल में, हम एएवी जीनोम की पूर्ण संख्या भी दिखाते हैं जो जीनोमिक डीएनए अलगाव और डीडी-पीसीआर परिणामों के बाद कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके इंट्रावियल इंजेक्शन के बाद ट्रांसड्यूड किए जाते हैं। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, जो रेटिना में एएवी वैक्टर की ट्रांसडक्शन क्षमता को निर्धारित करने के लिए रिपोर्टर अभिव्यक्ति का विकल्प होगा।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल सबासी विश्वविद्यालय आचार समिति द्वारा स्वीकार किए गए थे और अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ' द एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ऑप्थेलमोलॉजी ' के बयान के अनुसार प्रयोग किए गए थे ।

1. छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन12

  1. संस्कृति HEK293T कोशिकाओं DMEM के पूर्ण 10 एमएल में 15 सेमी प्लेटों का उपयोग कर/
  2. हेल्पर प्लाज्मिड (pHGT1-Adeno1), कैप्सिड प्लाज्मिड के 7 माइक्रोन और AAV2-CBA-tdTomato-WPRE वेक्टर के 7 माइक्रोन और डीएमईएम के 5 एमएल में पीई समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) के 136 माइक्रोन के साथ ट्रांसफेक्शन मिश्रण तैयार करें।
  3. 5 एमएल तैयार ट्रांसफेक्शन मिश्रण को एक सेल कल्चर डिश में जोड़ें जिसमें 10 एमएल कल्चर मीडिया होता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-60 घंटे के लिए संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. 48-60 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर मीडिया को इकट्ठा करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 250 यू/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर DNase I के साथ इसे पचा लें।
  5. 4000 x ग्रामपर पचा मीडिया अपकेंद्रित्र, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और फिर इसे 100 केडीए के लिए पूर्व गीला पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली में 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
  6. 4000 x ग्राम,30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली को सेंट्रलाइज करें और मीडिया को त्यागें।
  7. 4000 x ग्राम,30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.001% Pluronic F-68 तीन बार युक्त पीबीएस के साथ पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली को धोएं और अपकेंद्रित्र करें। प्रत्येक चरण में पीबीएस को त्यागें।
  8. आगे के उपयोग के लिए पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली और एलिकोट के शीर्ष भाग से केंद्रित एएवी एकत्र करें।
  9. 15 मिनट के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase I (0.2U/μl) के साथ हौसले से बनाया AAV के 5 μL पचाने के लिए titering के लिए । इसके बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट इनक्यूबेशन दोनों को निष्क्रिय करने और वायरल कैप्सिड्स को अपमानित करने के लिए किया जाता है।
  10. 0.05% Pluronic F-68 का उपयोग कर पचा एएवी से एक 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें। टाइटलर(टेबल 1)के लिए AAV2-आईटीआर और डब्ल्यूपीआरई प्राइमर का इस्तेमाल करें । टाइटर्स की गणना कमजोर पड़ने वाले कारकों के साथ डीडी-पीसीआर परिणामों को गुणा करके की गई थी। परिणाम जीनोम कॉपी/एमएल (जीसी/एमएल) में बदल दिए गए ।
    नोट: छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन के लिए एएवी सांद्रता 1 x 1012 जीसी/एमएल के आसपास होने की उम्मीद है । यह प्रोटोकॉल एएवी उपभेदों के लिए लागू नहीं होता है जो AAV213जैसे मीडिया में AAVs को कुशलतापूर्वक जारी नहीं करते हैं।

2. एएवी का इंट्राविट्रियल इंजेक्शन

  1. उपकरणों की तैयारी
    1. शुरू करने से पहले, 36 जी कुंद सुई के साथ 10 माइक्रोसिरिंग तैयार करें। कुल्ला 70% EtOH के साथ पांच बार, डीडीएच2ओ में पांच बार, और अंत में PBS के साथ पांच बार.
    2. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए माइक्रोसिरिंग में एएवी की उचित मात्रा लोड करें।
    3. सर्जिकल सुई (सीवन, रेशम, 6/0), टेप, संदंश, और कैंची तैयार करें।
  2. इंट्राविट्रियल इंजेक्शन
    1. विद्यार्थियों को फैलाने के लिए संज्ञाहरण से पहले आंखों की बूंद युक्त 0.5% ट्रॉपिकेमाइड और 2.5% फेनिलेफ्रीन हाइड्रोक्लोराइड (जैसे, Mydfrin) की 1 बूंद लागू करें।
    2. आइसोफ्लुन 5% (1 एल/मिनट) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें और प्रक्रिया के दौरान 1.5% आइसोफ्लुरेन (1 एल/मिनट) के साथ जारी रखें। पहले इंडक्शन के लिए एक छोटे आइसोफ्लुरेन चैंबर का उपयोग किया जाता है।
    3. सही पलटा, वापसी पलटा, और पूंछ चुटकी प्रतिक्रिया के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करें।
    4. इंजेक्शन प्रक्रिया से पहले प्रत्येक आंख में 0.3% टोब्रामाइसिन और 0.1% डेक्सामेथासोन बाँझ नेत्र समाधान लागू करें। आई ड्रॉप का आवेदन सूखापन को रोकता है और एंटी-भड़काऊ और एंटी-बैक्टीरियल प्रभाव डालती है।
    5. ऊपरी पलक को स्थिर करने के लिए सर्जिकल हुक का प्रयोग करें। आंख के पृष्ठीय भाग को बेनकाब करने के लिए थोड़ा पीछे खींचें। इसे स्थिति में रखने के लिए बेंच को हुक टेप करें।
    6. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे आंख के स्क्लेरा को बेनकाब करने के लिए घुमावदार आईरिस कैंची के साथ कंजक्टिवा (1 मिमी से कम2)निकालें। स्क्लीरा को पंचर करने के लिए फ्रेश और बाँझ इंसुलिन सिरिंज (30 जी) का इस्तेमाल करें।
    7. माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके उसी पंचर के माध्यम से माइक्रोसिरिंग की सुई डालें। लेंस के पीछे सुई की नोक को आईकप के बीच में रखें।
    8. AAV2/BP2 और AAV2/PHP के 1 μL इंजेक्ट करें । एस वैक्टर १.६३ x 1012 जीसी/एमएल और १.७ x 1012 जीसी/एमएल सांद्रता धीरे आंख के vitreous में । इंजेक्शन वॉल्यूम नियंत्रण मैन्युअल रूप से किया जाता है। सुई को 1 मिनट के लिए जगह में छोड़ दें और धीरे-धीरे सुई को वापस लें।
    9. पलक को छोड़ दें और एंटी-भड़काऊ और एंटी-बैक्टीरियल सामयिक जेल उपचार लागू करें जिसमें 0.3% टोब्रामाइसिन और 0.1% डेक्सामेथासोन को आईकप पर लागू करें। उपस्थिति (उज्ज्वल आंखें, तैयार कोट, कूबड़), व्यवहार (गतिविधि, स्थिरीकरण, आत्म-विकृति), और शरीर के वजन के संदर्भ में 0 से 3 के पैमाने पर स्कोर शीट के अनुसार अगले दिनों में चूहों की निगरानी और मूल्यांकन करें। प्रत्येक शर्त 0-3 से एक अंक है और 3 या उससे ऊपर के कुल स्कोर एक समाप्ति कसौटी है ।
    10. वसूली के बाद जानवरों को पिंजरे में रखें।

3. फ्लोरेसेंस और फंडस इमेजिंग

  1. माउस को तनाव दें और प्रत्येक आंख में 0.5% उष्णकटिबंधीय और 2.5% फेनिलेफ्रीन हाइड्रोक्लोराइड की बूंदों को रखकर पुतली को फैलाएं।
  2. आइसोफ्लुएंज के साथ उपरोक्त प्रक्रिया के साथ जानवर को एनेस्थेटाइज करें। पंजे को चुटकी बजाकर एनेस्थीसिया की गहराई का सावधानी से आकलन करें।
  3. माउस को इमेजिंग स्टेज पर रखें और फंडस कैमरे के जरिए चेक करके उचित फैलाव को सत्यापित करें। एनेस्थीसिया के तहत आंखों को निर्जलीकरण से बचाने और इमेजिंग के लिए कपलिंग जेल के रूप में उपयोग करने के लिए आंखों की सतह पर सामयिक जेल (0.2% कार्बोमर 980) लागू करें।
  4. उद्देश्य के नाक के साथ लाइन के लिए इमेजिंग चरण में हेरफेर। माउस आंख को केंद्र में लाने के लिए आवश्यकतानुसार मंच को समायोजित करें। एक बार जब आंख केंद्रित हो जाती है, तो धीरे-धीरे उद्देश्य को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि यह आंखों से संपर्क न कर ले।
  5. इंट्राविट्रियल इंजेक्शन(चित्रा 3B)14के 1 सप्ताह और 2 सप्ताह बाद टीडीटोमा अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए दोनों आंखों पर फंडस और फ्लोरेसेंस इमेजिंग करें। रिपोर्टर अभिव्यक्ति की तुलना के लिए समान सेटिंग्स पर फंडस और फ्लोरेसेंस छवियों को लें।

4. रेटिना अलगाव

  1. 2 सप्ताह के समय बिंदु पर रेटिना संग्रह के लिए सीओ2 साँस लेना द्वारा fundus और फ्लोरेसेंस इमेजिंग के बाद जानवरों को इच्छामृत्यु।
  2. 13.5 सेमी स्प्लिटर संदंश की मदद से आंखों की पुतली को आगे शिफ्ट करें।
  3. संदंश के साथ कोमल दबाव लागू करके बचे हुए विट्रियस के साथ लेंस को एक साथ निकालें।
  4. आंखों की पुतली के कनेक्शन को सटीक घुमावदार संदंश के साथ ऑप्टिक तंत्रिका में काट लें और धीरे-धीरे रेटिना को उसी घुमावदार संदंश के साथ निचोड़ें।
  5. विच्छेदित रेटिना को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. स्नैप फ्रीज रेटिना तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों रखकर।

5. ऊतक जीनोमिक डीएनए अलगाव

  1. जीनोमिक डीएनए को एक व्यावसायीकृत प्रोटीन के पाचन आधारित ऊतक जीनोमिक डीएनए किट के साथ अलग करें।
  2. 55 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्ट रेटिना, 200 एक्स ग्राम प्रोटीनेज कश्मीर के साथ 30 मिनट के लिए, जो पहले से ही किट में आपूर्ति की जाती है।
  3. कदम इनक्यूबेशन RNase प्रदर्शन, धोने बफर मैं और द्वितीय के साथ कदम धोने, और अंत में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कदम elution ।
  4. अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए अंतिम धोने के बाद एक अतिरिक्त स्पिन कदम जोड़ें।
  5. जीनोमिक डीएनए की एकाग्रता को मापें और -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

6. वायरल जीनोम की मात्रा के लिए माउस रेटिना नमूनों की बूंद डिजिटल पीसीआर विश्लेषण

  1. प्रत्येक नमूने के लिए 1 एनजी/μL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 0.05% Pluronic F-68 समाधान में इंजेक्शन रेटिना से पतला जीनोमिक डीएनए।
  2. प्रत्येक प्राइमर के लिए 125 एनएम की अंतिम एकाग्रता के साथ लक्ष्य विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके डब्ल्यूपीआरई और 18S के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाएं करें।
  3. 1 एनजी जीनोमिक डीएनए, 125 एनएम प्राइमर और 2x एवाग्रीन सुपरमिक्स सहित पीसीआर रिएक्शन मिक्स के 20 माइक्रोन में ड्रॉपलेट जनरेशन करें।
  4. बूंद पीढ़ी के लिए कारतूस के बीच के हिस्से में नमूना मिश्रण लोड करें।
  5. कारतूस के लिए नमूना लोड करने के बाद किया गया था, कारतूस की निचली पंक्ति में बूंद पीढ़ी के तेल के 70 μL जोड़ें।
  6. कारतूस के ऊपर गैसकेट रखो और बूंद जनरेटर में जगह है। सुनिश्चित करें कि गैसकेट और कारतूस के बीच कोई अंतर नहीं है।
  7. धीरे-धीरे ऊपर अच्छी तरह से उत्पन्न होने वाली बूंदों में से लगभग 40 माइक्रोन लें। अर्ध-स्कर्ट 96-अच्छी पीसीआर प्रतिक्रिया प्लेट में बूंद समाधान जोड़ें।
  8. पीसीआर प्लेट सीलर के साथ पीसीआर प्लेट को एल्यूमीनियम सीलिंग फॉयल का उपयोग करके सील करें।
  9. पीसीआर प्लेट को 96-अच्छी तरह से गर्मी से सील थर्मल साइकिलर में रखें। पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करें; 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस अनंत होल्ड के लिए। साइकिलिंग के दौरान प्रत्येक चरण के लिए बूंदों को सही तापमान तक पहुंचाने के लिए प्रत्येक चक्र पर 2 डिग्री सेल्सियस/s रैंप दर लागू करें
  10. डीडी-पीसीआर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बूंदों की मात्रा निर्धारित करने के लिए पीसीआर प्लेट को बूंद पाठक में रखें। एक टेम्पलेट evagreen के लिए विशिष्ट सेटिंग्स का उपयोग कर स्थापित किया जाता है।
  11. फ्लोरेसेंस तीव्रता बनाम बूंद संख्या के लिए प्रत्येक नमूने के साथ 1-डी प्लॉट ग्राफ का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें। दहलीज मूल्य की व्यवस्था की जाती है ताकि दहलीज के ऊपर की बूंदों को सकारात्मक और नीचे वाले को नकारात्मक के रूप में सौंपा जा सके। इसके बाद प्रतियों/μL की इकाइयों में लक्ष्य डीएनए की शुरुआती एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पॉइसन एल्गोरिदम के आवेदन के बाद किया जाता है । WPRE बनाम 18S के अनुपात की गणना एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता को मापने के लिए की जाती है।

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Representative Results

छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन एक तेज और कुशल तरीका है जो इंट्राविट्रियल इंजेक्शन(चित्र 1)के लिए वैक्टर प्रदान करता है। छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन आमतौर पर 1 x 1012 जीसी/मिलीलीटर की सीमा के भीतर टाइटर्स देता है जो रेटिना(चित्रा 2)में रिपोर्टर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए पर्याप्त है । डीडी-पीसीआर का उपयोग करके एएवी की टाइटरिंग लगातार परिणाम देती है। ITR2 और WPRE विशिष्ट प्राइमर नियमित रूप से उपयोग किए जाते हैं और प्रत्येक लक्ष्य अणु की शुरुआती एकाग्रता की गणना डीडी-पीसीआर सॉफ्टवेयर के साथ एक पॉइसन वितरण के रूप में मॉडलिंग द्वारा की जाती थी। गणना को कमजोर पड़ने वाले कारकों के गुणा द्वारा अंतिम रूप दिया गया था और प्रति एमएल जीनोम कॉपी में परिवर्तित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के लिए उत्पादित किए जाने वाले एएवी में क्रमशः 1.63 x 1012 जीसी/एमएल और 1.7x 1012 जीसी/एमएल के लिए AAV2/BP2 और AAV2/PHP.S7,15केटाइटर्स थे । तुलना के लिए, दोनों उपभेदों के लिए समान टीडीटोमा एक्सप्रेशन निर्माण का उपयोग किया गया था। हमने एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए एएवी के लगभग समान टाइटर्स को इंजेक्ट किया। AAVs के उपरोक्त सांद्रता से 1 μL के इंजेक्शन के बाद, जानवरों को 1 सप्ताह और 2 सप्ताह के समय बिंदुओं पर चित्रित किया गया था। AAV2/BP2 और AAV2/PHP दोनों के लिए एक फंडस और फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम का इस्तेमाल किया गया था । एस रेटिना #1(चित्रा 3A,बी)के अलावा इसी तरह के रिपोर्टर अभिव्यक्ति प्रोफाइल पैदा रेटिना इंजेक्शन । TdTomato अभिव्यक्ति औसत ग्रे मूल्य (मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता) के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था ताकि पार प्रणाली दक्षता और रिपोर्टर अभिव्यक्ति(चित्रा 3A,बी)की तुलना को पार करने के लिए । यह मूल रूप सेपिक्सल 16की संख्या से विभाजित चयन में सभी पिक्सल के ग्रे मूल्यों का योग है । रेटिना #1 की फ्लोरोसेंट छवियों ने केवल टीडीटोमा एक्सप्रेशन का एक छोटा सा क्षेत्र दिखाया, जो इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के बाद बैकफ्लो या रिसाव के कारण सबसे अधिक संभावना है। इस खोज के अनुरूप, रेटिना #1 की फ्लोरेसेंस तीव्रता 0.9 थी जो सभी रेटिना की तुलना में सबसे कम थी जो इंट्राविटेली इंजेक्शन और इमेज्ड थी। मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता 4 -11 के बीच थी। इससे पता चला कि टीडीटोमा एक्सप्रेशन की फ्लोरोसेंट छवियों का मात्राकरण सफल रहा और दिखाए गए चित्रों(चित्र 3 ए,बी)के साथ सहसंबद्ध था।

रेटिना की इमेजिंग के बाद जीनोमिक डीएनए को 2 हफ्ते के टाइम पॉइंट पर इंजेक्शन रेटिना से अलग कर दिया गया । डीडी-पीसीआर एएवी जीनोम क्वांटिफिकेशन के लिए डब्ल्यूपीआरई प्राइमर का उपयोग करके किया गया था। माउस 18S का उपयोग एव जीनोम को सामान्य बनाने के लिए माउस जीनोम(चित्र 3सी)17का उपयोग किया गया था । मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता और छवियों के अनुरूप, रेटिना #1 रेटिना #2 रेटिना की तुलना में 18S, ०.०११ गुना कम के सापेक्ष एक बहुत कम AAV जीनोम कॉपी संख्या थी । इसके अलावा, रेटिना #2, 3, 4, और 5 समान गुना स्तर के अंतर देते हैं। रेटिना #2 की तुलना में रेटिना #3, 4 और 5 की तुलना में गुना अंतर क्रमशः १.७५, ०.५५ और ०.९९ थे । उन लोगों में रेटिना #3 दोनों ने सबसे ज्यादा फ्लोरोसेंट तीव्रता और एएवी जीनोम कॉपी नंबर दिया । इससे पहले ही पता चला है कि डीडी-पीसीआर के साथ ट्रांसड्यूडेड एएवी जीनोम का मात्राकरण फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ संबंधित है और इस प्रकार टीडीटोमा एक्सप्रेशन है जो मनाया जाता है। डीडी-पीसीआर विधि ने हमें ट्रांसड्यूडेड एएवी का पूर्ण मात्राकरण करने की भी अनुमति दी। रेटिना प्रति कुल एएवी जीनोम के पूर्ण मात्राकरण की गणना डीडी-पीसीआर से पहचानी गई कुल संख्या और जीनोमिक डीएनए के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक को गुणा करके की गई थी। यह 18S सामान्यीकृत AAV जीनोम ट्रांसडक्शन दक्षता (चित्रा 3 डी) की तुलना में इसी तरह के परिणाम मिले ।

Figure 1
चित्रा 1:प्रायोगिक प्रक्रियाओं का प्रवाह चार्ट। छोटे पैमाने पर एएवी उत्पादन डीडी-पीसीआर आधारित एएवी टाइटरिंग द्वारा किया जाता है। AAVs वयस्क रेटिना में इंट्राविट्रीली इंजेक्शन हैं। जानवरों का अनुवर्ती प्रदर्शन रिपोर्टर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक फंडस और फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके किया गया था। Fundus और फ्लोरोसेंट छवियों को 1 सप्ताह और 2 सप्ताह के समय अंक पर लिया गया । जीनोमिक डीएनए को डीडी-पीसीआर के साथ विश्लेषण के लिए इंजेक्शन रेटिना से अलग किया जाता है ताकि इंजेक्शन रेटिना में मौजूद कुल एएवी जीनोम की मात्रा निर्धारित की जा सके । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:डीडी-पीसीआर विधि का उपयोग करके एएवी टाइटरिंग। (एक)डीडी-पीसीआर विधि एक बूंद के भीतर समझाया पीसीआर प्रतिक्रियाओं से लाभ । एवग्रीन रसायन विज्ञान का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रिया के बाद, समाधान के भीतर लक्ष्य डीएनए की पूर्ण संख्या निर्धारित करने के लिए लक्ष्य जीन के लिए सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों का विश्लेषण किया गया था। (हरी बूंदों में लाल बक्से)। }एएवी टाइटरिंग के लिए प्रतिनिधि डीडी-पीसीआर डेटा। ITR2 प्राइमर का उपयोग करके एएवी के कई बैचों को तितर-30 किया गया था। सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों को दहलीज (बैंगनी रेखा) के ऊपर और नीचे अलग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-डीडी-पीसीआर द्वारा रेटिना में ट्रांसड्यूडेड एएवी जीनोम का क्वांटिफिकेशन। 16 सप्ताह पुराने जंगली किस्म के जानवरों को AAV2/BP2 और AAV2/PHP के साथ इंट्राविटली इंजेक्ट किया गया । एस वैक्टर क्रमशः 1.63 x 1012 जीसी/एमएल और 1.7x10 12 जीसी/एमएल सांद्रता वाले हैं। दोनों AAVs समान tdTomato अभिव्यक्ति का निर्माण किया था और सभी AAVs के लिए इंजेक्शन की मात्रा 1 μL था । इंजेक्शन रेटिना (1-7) fundus और फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ पीछा किया गया । ली गई छवियों को इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कैप्सिड अंतर के बावजूद, सभी जानवरों में फ्लोरेसेंस मतलब तीव्रतामूल्य (औसत ग्रे मूल्य)रेटिना #1 को छोड़कर 4 से 11 के बीच था जिसमें सबसे कम तीव्रता, 0.9 और कमजोर टीडीटोमा एक्सप्रेशन था। लाल और भूरे रंग के कॉलम AAV2/BP2 और AAV2/PHP हैं । एस इंजेक्शन रेटिना, क्रमशः(ए-बी)। डीडी-पीसीआर को एएवी जीनोम के लिए डब्ल्यूपीआरई प्राइमर और 2-सप्ताह के समय बिंदु पर सामान्यीकरण के लिए 18S प्राइमर का उपयोग करके किया गया था। रेटिना # 1 ने प्रति 18S प्रतियों(C)में विशिष्ट रूप से कम एएवी कॉपी नंबर भी दिखाए। रेटिना प्रति कुल एएवी जीनोम की गणना जीनोमिक डीएनए अलगाव(डी)के लिए डब्ल्यूपीआरी कॉपी नंबर और कमजोर पड़ने के कारक का भी उपयोग करके की गई थी। लाल और ग्रे वर्ग AAV2/BP2 और AAV2/PHP हैं । एस क्रमशः रेटिना इंजेक्शन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डीडीपीसीआर प्राइमर
आईटीआर 2 एफ GGAACCCCCCTAGTGATGGAGTT
आईटीआर2 आर CGGCCTCAGTGAGGGGA
डब्ल्यूपीआरई एफ GGCTGTTGGGCACTGACAA
डब्ल्यूपीआरी आर CCAAGGAAAGGACGATGATTTC
18S एफ जीजीसीसीटीटीटीटीटीटीजीजीए
18S आर CCCGGACATCTAAGCATCATC

तालिका 1: डीडी-पीसीआर प्राइमर सीक्वेंस। WPRE, ITR2, और माउस 18S के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर के दृश्य।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने दो एएवी वैक्टर उत्पन्न किए जिनमें अलग-अलग कैप्सिड प्रोटीन होते हैं और फिर तदनुसार उन्हें टाइटर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम यह है कि पर्याप्त मात्रा में एएवी का उत्पादन किया जाए जो12,13के बाद पता लगाने योग्य रिपोर्टर अभिव्यक्ति प्राप्त करेगा ।

इंट्राविट्रियल इंजेक्शन के लिए एएवी की खुराकों को समायोजित करने के लिए एएवी का टाइटरिंग भी एक महत्वपूर्ण कारक है। एक बार इन महत्वपूर्ण मानदंडों को प्राप्त कर लिया जाता है, डीडी-पीसीआर पद्धति द्वारा एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता की मात्रा निर्धारित करना संभव है।

कई प्रयोगशालाएं एएवी टाइटरिंग के लिए मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) विधि का उपयोग कर रही हैं। क्यूपीसीआर-आधारित पूर्ण मात्राकरण विधि के लिए एक मानक वक्र की आवश्यकता होती है जिसमें लक्षित डीएनए18की ज्ञात मात्रा में कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है। हालांकि, डीडी-पीसीआर को एक मानक वक्र की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि यह सीधे सकारात्मक बूंदों का पता लगाकर दिए गए नमूने के भीतर लक्ष्य अणुओं की कुल संख्या को निर्धारित करता है जिसमें लक्ष्य डीएनए की कम से कम एक प्रति होती है। चूंकि डीडी-पीसीआर एक अंतिम बिंदु विश्लेषण है और किसी मानक वक्र की आवश्यकता नहीं है, इसलिए क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के दौरान हुई दक्षता संबंधी समस्याएं डीडी-पीसीआर जैसे कम दक्षता वाले पीसीआर या मानक घटता 9की गुणवत्ता के लिए कम चिंता का विषय हैं। डीडी-पीसीआर पद्धति उन नमूनों पर लागू की जा सकती है जो पहले से ही क्यूपीसीआर के लिए तैयार किए जाते हैं। चूंकि एएवी टाइटरिंग के लिए विधि खंड में पहले से ही उल्लेख किया गया था, डीडी-पीसीआर को पतला नमूनों की आवश्यकता होती है। यह एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि नमूना एकाग्रता को इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए कि पॉइसन एल्गोरिदम करने के लिए पर्याप्त नकारात्मक बूंदें हैं। दूसरे शब्दों में, लक्ष्य डीएनए की बहुत अधिक सांद्रता के साथ नमूनों के साथ डीडी-पीसीआर प्रतिक्रिया करना संभव नहीं है जो नकारात्मक बूंदों को नहीं उपजते हैं।

एएवी टाइटरिंग और ट्रांसडक्शन दक्षता माप दोनों के लिए, विभिन्न लक्ष्य सेट का उपयोग करना संभव है। एएवी टाइटरिंग के लिए, हम मुख्य रूप से हमारे निर्माणों में AAV2 रीढ़ के कारण AAV2 आईटीआर विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करते हैं। विश्लेषण किए गए एएवी निर्माण के आधार पर डब्ल्यूपीआरी और अन्य जीन-विशिष्ट लक्ष्यों का उपयोग करना भी संभव है।

न्यूरोनल रेटिना में एएवी की ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने प्रति रेटिना एएवी जीनोम की कुल मात्रा को निर्धारित करने के लिए पूरे रेटिना नमूनों का उपयोग करके डीडी-पीसीआर विधि लागू की। हमने एक एएवी वेक्टर का उपयोग करके कार्यप्रणाली की सटीकता का आकलन किया जो tdTomato रिपोर्टर को व्यक्त करता है। दो आउटलर्स को छोड़कर टीडीटोमा एक्सप्रेशन लेवल के साथ डीडी-पीसीआर परिणामों की तुलना सहसंबद्ध है। रेटिनास #6 और #7 ने रेटिनास #2,3 4 या 5 की तुलना में इसी तरह की फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाने के बावजूद अतिरिक्त एएवी जीनोम प्रतियां प्राप्त कीं । ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि इन रेटिना में सीमित अभिव्यक्ति के स्तर के साथ अधिक ट्रांसडक्शन दर होती है या भाग में विट्रियस या न्यूरोनल रेटिना19,20के भीतर स्थायी एएवी कणों या वेक्टर डीएनए से संबंधित हो सकता है । कुल मिलाकर, यह हमारी विधि के लिए एकमात्र सीमित कारक था और आसानी से अन्य नमूनों के बीच पहचाना जा सकता है। हमने प्रति रेटिना एएवी जीनोम की कुल संख्या भी निर्धारित की है जो इस पद्धति की शक्तियों में से एक था । यह विभिन्न प्रयोगशालाओं और जानवरों के बैचों के बीच डेटा की तुलना की अनुमति देता है। इसलिए, इस विधि को आसानी से एएवी वैक्टर के लिए बैच भिन्नता के लिए एक नए सेरोटाइप, वैरिएंट या बैच की ट्रांसडक्शन दक्षता का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें कोई रिपोर्टर अभिव्यक्ति नहीं है और हमें विभिन्न सेटिंग्स में डेटा की तुलना करने में मदद करता है। यह एएवी वैक्टर के लिए महत्वपूर्ण है जो आकार की बाधाओं के कारण रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की अनुमति नहीं देते हैं।

यह विधि अन्य प्रकार के संवेदनशील परखों के लिए एक आधार भी प्रदान करती है जो लक्षित डीएनए का उपयोग करती है। समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम उपयुक्त प्राइमर के साथ माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम कॉपी नंबरों की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। इसके अलावा सुधार भी संभव है रेटिना और प्रवाह साइटोमेट्री छंटाई कदम के वियोजन सहित या तो एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के बैचों में लक्ष्य डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए । इसके अलावा, इस विधि21, 22का उपयोग करके आधार संपादन की सुधार दक्षता का आकलन करना भी संभवहै,जो कई रेटिना रोगों और जीन उपचारों के लिए भी महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम AAV उत्पादन के लिए उनकी मदद और समर्थन के लिए Oezkan Keles, जोसेफिन Jüttner, और प्रो Botond Roska, आणविक और नैदानिक नेत्र विज्ञान बेसल, जटिल वायरस मंच के संस्थान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम AAV8/BP2 तनाव के लिए पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के पेरेलमैन स्कूल ऑफ मेडिसिन के प्रोफेसर जीन बेनेट को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । पशु काम Gebze तकनीकी विश्वविद्यालय पशु सुविधा में किया जाता है । इसके लिए हम लेयला दीक्षित और प्रो उइगर हलीस ताजेबे को पशुपालन के लिए तकनीकी सहायता और सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणियों के लिए डॉ फातमा ओजडेमिर को भी धन्यवाद देना चाहेंगे । यह काम TUBITAK, अनुदान संख्या 118C226 और 121N275, और सबांसी विश्वविद्यालय एकीकरण अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-Well Semi-Skirted ddPCR plates BioRad 12001925 ddPCR
Amicon Filter Millipore UFC910096 AAV
C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS BioRad 1851197 ddPCR
C57BL/6JRj mice strain Janvier C57BL/6JRj Mice
DG8 gaskets BioRad 1863009 ddPCR
DG8 Cartridges BioRad 1864008 ddPCR
DMEM Lonza BE12-604Q AAV
DPBS PAN BIOTECH L 1825 AAV
Droplet generation oil eva green BioRad 1864006 ddPCR
Droplet reader oil BioRad 1863004 ddPCR
FBS PAN BIOTECH p30-3306 AAV
Foil seals for PX1 PCR Plate sealer BioRad 1814040 ddPCR
Insulin Syringes BD Medical 320933 Intravitreal injection
Isoflurane ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET N01AB06 anesthetic
Microinjector MM33 World Precision Instruments 82-42-101-0000 Intravitreal injection
Micron IV Phoenix Research Labs Micron IV Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) Alcon S01FB01 pupil dilation
Nanofil Syringe 10 μl World Precision Instruments NANOFIL Intravitreal injection
Needle RN G36, 25 mm, PST 2 World Precision Instruments NF36BL-2 Intravitreal injection
PEI-MAX Polyscience 24765-1 AAV
Penicillin-Streptomycin PAN BIOTECH P06-07100 AAV
Plasmid pHGT1-Adeno1 PlasmidFactory PF1236 AAV
Pluronic F-68 Gibco 24040032 AAV
PX1 PCR Plate Sealer system BioRad 1814000 ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix BioRad 1864034 ddPCR
QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator BioRad 1864001 ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER
MAKER - LENGTH = 13.5 CM		 endostall medical EJN-160-0155 Retina isolation
Steril Syringe Filter AISIMO ASF33PS22S AAV
Tissue Genomic DNA Kit EcoSpin E1070 gDNA isolation
Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) Alcon S01CA01 anti-inflammatory / antibiotic
Tropamid (% 0.5 tropicamide) Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. S01FA06 pupil dilation
Turbonuclease Accelagen N0103L AAV
Viscotears (carbomer 2 mg/g) Bausch+Lomb S01XA20 lubricant eye drop

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 178
मुरीन रेटिना में एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर विधि
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Okan, I. C. T., Ahmadian, M.,… More

Okan, I. C. T., Ahmadian, M., Tutuncu, Y., Altay, H. Y., Agca, C. Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina. J. Vis. Exp. (178), e63038, doi:10.3791/63038 (2021).

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