הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

Summary

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

Abstract

עוברי דרוזופילה מוקדמים הם תאים גדולים המכילים מגוון עצום של אברונים קונבנציונליים וספציפיים לעובר. במהלך שלוש השעות הראשונות של יצירת העוברים, אברונים אלה עוברים תנועות דרמטיות המופעלות על ידי זרימה ציטופלסמית מבוססת אקטין וסחר מונע על ידי מנוע לאורך מיקרוטובולים. הפיתוח של שפע של בדיקות פלואורסצנטיות קטנות וספציפיות לאברונים (FPs) מאפשר לדמיין מגוון רחב של מבנים שונים המכילים שומנים בכל גנוטיפ, ומאפשר הדמיה חיה ללא צורך בפלואורופור מקודד גנטית. פרוטוקול זה מראה כיצד להזריק צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות לעוברי דרוזופילה כדי לנטר את הסחר באברונים ספציפיים על ידי הדמיה חיה. גישה זו מודגמת על ידי תיוג טיפות שומנים (LDs) ובעקבות תנועתן בתפזורת על ידי וולוצימטריה של תמונת חלקיקים (PIV). פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה מקובלת לחקר אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ומיון, ולמעקב אחר תנועתם של LDs בודדים לאורך מיקרוטובולים. שימוש בצבעים הזמינים באופן מסחרי מביא את היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום. על ידי תיוג משותף של ריבוי של אברונים ו/או יסודות שלדיים באמצעות מיקרו-איניג'קציה, כל המשאבים הגנטיים בדרוזופילה זמינים למחקרי סחר בבני אדם ללא צורך בהחדרת חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. שלא כמו פלואורופורים מקודדים גנטית, בעלי תפוקה קוונטית נמוכה ואקונומיקה בקלות, רבים מהצבעים הזמינים מאפשרים לכידה מהירה ובו זמנית של מספר ערוצים עם תפוקת פוטונים גבוהה.

Introduction

צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות הם כלים רבי עוצמה לדמות מבנים תאיים ספציפיים ואברונים חיים. בעובר Drosophila, אברונים רבים ושונים מציגים לוקליזציה מונעת ציטוסקטון 1,2,3,4, אך היישום של מולקולות קטנות אלה מאתגר מכיוון שקליפת הביצה אטומה לרבים מהם. פרוטוקול זה מתאר שיטה לשימוש בבדיקות פלואורסצנטיות (FPs) בעוברים חיים באמצעות מיקרו-איניג'קציה על מנת לזהות סחר בקנה מידה גדול של אברונים. ההליך כולל הכנת תמיסת ההזרקה, איסוף והכנת ביציות של עוברים, מיקרו-הטמעה, הדמיה וניתוח תמונות.

סידור מרחבי דרמטי של אברונים נפוץ בביצות, ביציות ועוברים רבים של בעלי חיים, בין השאר בגלל גודלם הגדול של תאים אלה. בעובר דרוזופילה , למשל, טיפות שומנים (LDs) ושלפוחיות חלמון נעות לכיוון מרכז העובר רגע לפני התאוליזציה⁵. תנועה זו תלויה במיקרוטובולים ומשאירה אזור של כ-40 מיקרומטר סביב שולי העובר מרוקנים משני האברונים. בשלבי מחשוף מוקדמים יותר, אברונים רבים מועברים על ידי זרמים ציטופלסמיים המונעים על ידי התכווצויות מבוססות אקטין-מיוזין במשטח העובר⁶. אף על פי שהעוברים של מינים רבים מפגינים סידור מחדש דומה, עובר דרוזופילה מתאים במיוחד למעקב אחר תהליכים אלה על ידי הדמיה מכיוון שהוא מתפתח חיצונית ב"טמפרטורת החדר" הסטנדרטית במעבדה, הוא שקוף יחסית, קטן מספיק כדי להתאים לרוב מערכי המיקרוסקופ, וניתן לתמרן אותו באמצעות כלים גנטיים רבי עוצמה.

עבור אברונים מסוימים, קיימים חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי המסמנים באופן ספציפי מבנים אלה. לדוגמה, LSD-2 (הידוע גם בשם dPLIN2) הוא חלבון שבעוברים מכוון באופן ספציפי ל-LDs⁷. קיימים קווי זבובים הנושאים טרנסגנים אינדוקטיביים המקודדים היתוך בין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו-LSD-2⁸ או מלכודת גנים שבה מוחדר חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לאזור הקידוד של הגן האנדוגני LSD-2 ^9,10. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות, כולל העובדה שלחלבוני היתוך אלה יש תפוקה קוונטית נמוכה והם נוטים להלבין בקלות. בנוסף, תיוג מספר מבנים שונים בו זמנית יכול להיות מאתגר: עבור אברונים רבים, רק סוג אחד של תג פלואורסצנטי (לעתים קרובות GFP או mCherry) זמין כיום, ולכן הדמיה של שני אברונים בו זמנית עשויה לדרוש טרנסגנים חדשים או החדרות; כמו כן, גם אם קיימים תגים תואמים, החדרתם לזן יחיד יכולה לדרוש צלבים גוזלים זמן רב. זה גם הופך את השימוש במשאבים הגנטיים החזקים הרבים לפחות נוח, למשל, אם שני סמנים אברוניים, נהג Gal4 ומבנה RNAi אינדוקטיבי כולם צריכים להיות נוכחים באותה אם.

באופן עקרוני, ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות שימוש ב-FPs, כולל צבעים חיוניים (למשל, LysoTracker לסימון ליזוזומים), בדיקות מולקולריות (למשל, SiR-tubulin לסימון מיקרוטובולים), ומולקולות ביולוגיות המסומנות בפלואורסצנטיות (למשל, C12 BODIPY כדי לחקור את חילוף החומרים של חומצות שומן¹¹). החל משימוש בתאים בתרבית, הם בדרך כלל מאומתים היטב ככלים רבי עוצמה לחקר הביולוגיה התאית. FPs הם רב-תכליתיים, בעלי תכונות תמונה מעולות ותואמים לחלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לערבב צבעים מרובים וליישם אותם בו זמנית, לעתים קרובות עם היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום ותזוזות סטוקס קטנות, מה שמונע דימום בתעלה. תזוזות סטוקס קטנות מאפשרות לכידה בו-זמנית של ערוצי הדמיה מרובים, ומאפשרות מעקב אחר מספר אברונים בו-זמנית. לבסוף, ניתן ליישם אותם באותה מידה על תיוג אברונים בעוברים של מיני דרוזופילה אחרים או אפילו חרקים אחרים שבהם לא יהיו חלבונים מתויגים באופן פלואורסצנטי.

עם זאת, רוב ה-FPs האלה לא יכולים לחצות את קליפת הביצית המשוכללת של עובר דרוזופילה . הוא מורכב מחמש שכבות: שלוש שכבות כוריוניות חיצוניות (כוריון) המונעות נזק מכני בתוספת שכבת שעווה המקיפה את קרום הוויטלין היוצרת מחסום כימי¹². למען הפשטות, השילוב של שכבת השעווה וקרום הוויטלין ייקרא "קרום הוויטלין" שמתחת. כדי לעקוף את קליפת הביצית, פרוטוקול זה מתאים גישה מבוססת של מיקרו-זירת עוברים כדי להכניס FPs לעובר Drosophila . הפרוטוקול מתאר כיצד לנטר את הזרימה הציטופלסמית של LDs בעוברים בשלב המחשוף. הוא כולל הכנת מחטי הזרקה וכלובי איסוף ביצים, תהליך איסוף הביצים והסרה מכנית של הכוריון. זה עובר על איך microinject ותמונה של העוברים וכיצד לנתח את הזרימה הגדולה של LDs באמצעות velocimetry תמונה של חלקיקים (PIV, מותאם מ⁶). הוא מספק עצות לפתרון בעיות כדי להבטיח את הישרדות העוברים וליצור את המערכת הטובה ביותר להדמיה. כמו כן, נדון כיצד ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לדלם בו זמנית LDs ומיקרוטובולים או ליישם אותו במחקר של אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ורשתית האנדופלסמית (ER).

Protocol

1. הכינו את החומרים הדרושים

הערה: הכנות אלה נעשות בצורה הטובה ביותר ימים או שבועות מראש.

1. מכינים מחטי הזרקה.
   הערה: ניתן לאחסן מחטים ללא הגבלת זמן במיכל מכוסה. מחטים חייבות להיות עדינות מספיק כדי לספק ~ 700 fL תוך שהן חזקות מספיק כדי לחדור את קרום הוויטלין.
   1. מניחים נימי לתוך מחזיק הנימים על מושך המחטים. אבטחו את הנימים בעזרת הכנפיים. יישרו את מרכז הנימים עם גוף החימום כך שייווצרו שתי מחטים סימטריות.
   2. בחר הגדרות מתאימות במשיכת המחט בהתאם להוראות היצרן.
   3. בצע בקרת איכות באמצעות היקף ניתוח.
      הערה: טיפים למחט צריכים להיות בסדר ככל האפשר. קצוות מחט סדוקים, משוננים או בעלי נשא גדול מושלכים.
   4. להכין אצוות של 10 מחטים (5 נימים שווים) בכל פעם.
   5. מניחים מרק מעוות, אשר כבר מגולגל לתוך גליל, במרכז החלק התחתון של מיכל עם מכסה. לחץ בזהירות על המחטים לתוך המרק כך שהוא מחזיק אותן אופקית כאשר קצות המחט תלויים בבטחה באוויר כדי למנוע נזק. מכסים במכסה ומאחסנים עד לשימוש.
2. מכינים צלחות איסוף ביצים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: צלחות איסוף ביצים הן צלחות אגר קטנות בתוספת מיץ פירות לעידוד הטלת ביצים. כיצד להכין אותם מתואר בפרוטוקולים רבים, כולל¹³.
3. הכינו דבק הפטן.
   הערה: דבק זה מופק מסרט דו-צדדי ומשמש להצמדה מאובטחת של העוברים לכיסוי. זה מונע מהעובר לצוף מחוץ למיקוד במהלך ההזרקה וההדמיה. ניתן להכין את הדבק ימים או שבועות מראש.
   1. מרימים סרט דביק דו-צדדי לגודל גדול יותר מכדור גולף ומניחים אותו בתחתית מיכל זכוכית בגודל של כ-50 מ"ל עם מכסה אטום הדוק. ארזו סרט הדבקה בחוזקה כך שיהיה מספיק דבק.
   2. במכסה אדים, מלאו את מיכל הזכוכית בהפטן כדי לכסות את כל הקלטת. יש לשמור על המיכל סגור היטב כאשר אינו בשימוש.
      אזהרה: הפטאן דליק כנוזל ואדים. זה יכול לגרום לגירוי בעין, בעור ובדרכי הנשימה. אדי נשימה עלולים לגרום לנמנום, סחרחורת ונזק לריאות. הרחיקו את ההפטן ממקורות ההצתה ואחסנו אותו באזור מאוורר היטב המיועד לחומרים דליקים והרחק מחומרים שאינם תואמים.
   3. תנו לדבק ההפטן לשבת לילה או יותר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הניחו את המיכל על שייקר או על מתסיס אחר למשך הלילה כדי לסייע בהמסת הדבק.
      הערה: הקלטת עצמה תישאר, אך הדבק יתמוסס בהפטן. בשלב 5.1.2, הדבק מוחל על כיסוי; הפטן מתאדה, ומשאיר את הדבק מאחור.
   4. בדקו את הכנת דבק ההפטן על ידי הנחת טיפה ממנו על מגלשת זכוכית וודאו שנותרו שאריות דביקות לאחר שההפטן התאדה. אם שאריות דבק אינן נראות לעין לאחר מכן, הוסיפו סרט הדבקה נוסף למיכל הזכוכית וחזור על השלב הקודם.
      הערה: לאחר ההכנה, ניתן להשתמש בדבק במשך חודשים או אפילו שנים.
4. הכינו תמיסת מלאי BODIPY493/503 של 1 מ"ג/מ"ל (3.8 מ"ל) על ידי דילול הכנה שהושגה באופן מסחרי ב-DMSO נטול מים טהור. שמור אותו מכוסה כדי להגן עליו מפני אור ומים. יש לאחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או לטווח קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. מכינים כלובי איסוף ביצים

הערה: בצע פעולה זו לפחות יום (רצוי יומיים או שלושה) לפני ההזרקה המתוכננת.

1. מכינים משחת שמרים.
   הערה: תוספי תוספי משחת שמרים לחלבון וחומרים מזינים חיוניים אחרים שאינם מסופקים בצלחות מיץ התפוחים. הוא מקדם ייצור ביצים והטלת ביצים.
   1. מוסיפים 2-10 גרם של שמרי אופה יבשים, ואז 1 מ"ל של מי ברז לכוס קטנה. מערבבים באמצעות מרית.
   2. המשיכו להוסיף מי ברז במרווחים של 1 מ"ל עד שתגיעו למרקם הרצוי, דמוי משחת השיניים.
   3. מכסים את התערובת ומאחסנים אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הקימו כלובי זבובים לאיסוף ביצים.
   הערה: נדרשים זבובים זכרים ונקבות של הגנוטיפ הרצוי: 10-50 נקבות בנות פחות משבועיים ומספר דומה של זכרים. קיימות מספר אפשרויות שונות לכלובי זבובים, כולל אפשרויות תוצרת בית^14,13. חשוב שגודל צלחות מיץ התפוחים יתאים לגודל כלובי הזבובים.
   1. מניחים כתם קטן של ממרח שמרים על צלחת מיץ תפוחים. שמור אותו מכוסה ותן לו להגיע לטמפרטורת החדר מכיוון שזבובים לא יטילו ביצים על הצלחת אם קר מדי.
   2. מעבירים זבובים לכלוב איסוף עוברים, אוטמים בעזרת צלחת מיץ התפוחים השמרים ומצמידים את הצלחת לכלוב איסוף העוברים.
   3. אפשרו לזבובים שזה עתה הועברו להתאקלם לכלוב למשך 1-2 ימים, והחליפו את הצלחת בצלחת אחת טרייה ביום. אם כל השמרים נאכלו עד למחרת, הגדילו את כמות משחת השמרים לאוספים עתידיים.
      הערה: זהו צעד חשוב להגדלת תפוקת הביצים מכיוון שנקבות שניזונו היטב מטילות יותר ביצים.

3. ביום ההזרקה, להכין את תמיסת ההזרקה ולהעמיס אותה לתוך המחט

1. השתמש בפתרון המלאי של BODIPY 493/503 (3.8 mM ב- DMSO) כפתרון ההזרקה.
2. טען מחט בודדת עם 1 μL של תמיסת ההזרקה באמצעות טיפים להעמסת מחט.
   הערה: שאפו להביא את הנוזל עד לקצה מבלי ללכוד בועות אוויר. היו מוכנים להחליף במהירות את המחט הטעונה במקרה של שבירה בשוגג.
   1. חברו קצה טעינה למיקרופיפט ומשכו 1 μL של תמיסת ההזרקה לתוך הקצה. באמצעות כפפות, החזיקו את המחט ביד אחת כשקצהה מכוון הרחק כדי למזער את הסיכון לשבירה.
   2. הכניסו בזהירות את קצה ההעמסה לתוך המחט ודחפו אותה קרוב לקצה המחט. מחלקים את הנוזל ליד קצה המחט. לאחר הסרת הפיפטה, החזיקו את המחט אנכית עם קצהה כלפי מטה עד שהנוזל זורם לקצה.
3. אחסן את המחטים הטעונות במיכל נפרד עם מרקי כנ"ל (ראה שלב 1.1.5).
   הערה: יש להכין מחטים מראש (עד מספר שעות) של הזרקה, אך אין להשתמש בהן לאחר יותר מיום.
4. יש להרחיק מחטים מאור הסביבה כדי למנוע הלבנה של הצבעים. מכסים את מיכל האחסון בנייר אלומיניום מבלי לפגוע בקצות המחט. ודא שכל האור מוסתר.

4. איסוף עוברים להזרקה

הערה: עיתוי האיסוף תלוי באיזה שלב של עוברים יש לבצע את ההזרקה. עם ערכת התזמון להלן, העוברים בזמן ההכנה להזרקה יהיו בני 0-90 דקות, המתאימים לשלבי המחשוף¹⁵.

1. ביום ההזרקה, להכין צלחות מיץ תפוחים עם שמרים, כמו בשלב 2.2.1. אם מתוכננים N סבבים של זריקות, הכן N + 2 צלחות. שמרו על צלחות אלה בטמפרטורת החדר.
   הערה: בנוסף לצלחות N לאיסוף עוברים להזרקה, יש צורך בצלחת אחת כצלחת טרום איסוף ועוד אחת כדי להאכיל את הזבובים בכלוב לאחר השלמת האיסוף.
2. החליפו את הצלחת שעל הכלוב בצלחת שמרים טרייה (צלחת קדם-איסוף) והשאירו אותה על הכלוב למשך 1-2 שעות.
3. החליפו את הצלחת שעל הכלוב בצלחת טרייה (צלחת איסוף). יש להשליך את הצלחת שלפני האיסוף, שכן היא תכיל עוברים מבוגרים מהרצוי. לאחר מכן, אפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך 1.5 שעות.
   הערה: מכיוון שזבובים שניזונו היטב בדרך כלל מטילים את ביציהם זמן קצר לאחר שהביצים הופרו, זמן איסוף של 1.5 שעות מבטיח כי בסוף האוסף, רוב העוברים בצלחת הם בני 0-90 דקות, כלומר נמצאים בשלבי מחשוף. נקבות זבובים שלא הוזנו בשמרים טריים מאז היום הקודם נוטות לשמור על ביציות מופרות למשך פרק זמן לא מוגדר לפני ההטלה. לפיכך, בצלחת שלפני האיסוף עשויים להיות עוברים שהופרו לפני תחילת האיסוף ולכן הם מעל גיל 60 דקות, לפעמים הרבה יותר מבוגרים.
4. החליפו את הצלחת על הכלוב בצלחת שמרים טרייה. מכסים את צלחת האיסוף כך שזבובים תועים לא מטילים עליהם ביצים.

5. הכינו עוברים למיקרו-מיון

1. הרכיבו את החומרים הדרושים.
   1. חברו חתיכת סרט הדבקה דו-צדדי לשקופית זכוכית. הימנעו מלגעת בקלטת באצבעות מכיוון שזה מפחית את הדביקות שלה.
      הערה: שקופית זו תשמש להסרת הכוריאון ולא להדמיה.
   2. באמצעות פיפטת העברה או מיקרופיפטה (עמ' 200 או עמ' 1000), הניחו טיפה קטנה (200 μL או פחות) של דבק הפטן בערך במרכזו של כיסוי מלבני (60 x 25 מ"מ). אפשרו להפטן להתאדות (זה לוקח פחות מדקה).
      הערה: כיסוי זה ישמש להרכבת העוברים להזרקה והדמיה. הממדים נבחרים כך שיתאימו למחזיק מתכת מתכוונן במיקרוסקופ הקונפוקלי.
   3. הרכיבו תא ייבוש, תא אטום (למשל, קופסת כריך Tupperware) המכילה חרוזי ייבוש. יש להשתמש רק בחרוזי ייבוש שלא התייבשו.
      הערה: כדי להבטיח שהעוברים לוקחים את תמיסת ההזרקה, יש לייבש מעט את העובר כדי להפחית את הלחץ הפנימי. זה נעשה על ידי הצבת הכיסוי עם העוברים ההזויים, החשופים לאוויר, לתוך תא ההתייבשות.
2. באופן מכני להסיר את הכוריאון.
   1. מכסים את צלחת העובר המיושנת כראוי בשכבה דקה של שמן הלוקרבון 27 כדי להפוך את קליפת הביצה לשקופה.
      הערה: עוברים הופכים שקופים תוך עשרות שניות¹⁵. אם שלב זה אינו מתרחש ביעילות, צלחות מיץ התפוחים עשויות להיות רטובות מדי ויש לייבש אותן לפני השימוש.
   2. צפו בצלחת מתחת להיקף דיסקציה עם טרנסילומינציה (כלומר, האור העובר דרך הצלחת אל תוך עיניות) כדי לאשר את שלב העוברים.
   3. בחר עוברים בשלבי מחשוף.
      הערה: עוברי שלב המחשוף אטומים לחלוטין; ניתן לזהות את שלבי הבלסטודרם הבאים על ידי רצועה של ציטופלסמה שקופה סביב המרכז האטום¹⁵. מבוא טוב כיצד לזהות שלבים עובריים שונים זמין באתר (שניתן בהתייחסות¹⁶) המתוחזק על ידי האגודה לביולוגיה התפתחותית.
   4. באמצעות פינצטה עדינה, תפסו עובר של השלב הרצוי על ידי התוספות הגביות שלו והעבירו אותו אל מגלשת הזכוכית המוכנה המכוסה בפיסת סרט דו-צדדי. מניחים את העובר על הקלטת. למזער את העברת השמן.
   5. בעדינות ככל האפשר, גלגלו את העובר על פני השטח של הסרט על ידי דחיפה עדינה של העובר עם הצד של קצה הפינצטה. אין לתקוע את העובר ישירות עם קצות הפינצטה החדים.
      הערה: אם הכוח המופעל נמוך מדי, העובר לא יתגלגל. אם הוא גבוה מדי, הוא יתפוצץ. מציאת כוח הביניים המתאים דורשת ניסיון, ולכן יש לתרגל שלב זה מראש.
   6. ממשיכים לגלגל את העובר עד שהכוריון נדבק באופן חולף לקלטת ונסדק.
   7. לאחר שהכוריון נסדק, המשיכו להתגלגל כדי להפריד את העובר (עדיין בתוך קרום הוויטלין) מהכוריון כאשר הכוריון נשאר דבוק לקלטת.
   8. אשרו כי הכוריון מוסר לחלוטין על ידי התבוננות באובדן התוספות הגביות מהעובר.
   9. גלגלו את העובר בחזרה אל הכוריון, שהוא פחות דביק מהסרט. לשפשף בעדינות את העובר עם הפינצטה עד שהוא מתחבר לפינצטה לצורך העברה.
   10. מעבירים את העובר לכיסוי עם דבק ההפטן ומביאים אותו במגע עם הדבק, מה שבדרך כלל מנתק אותו מהפינצטה.
   11. התאם את כיוון העובר על מכסה הכיסוי.
       1. הטמיעו את המשטח הצדדי של העובר בדבק.
          הערה: פני השטח של העובר המוטבעים בדבק הם אלה שיצטלמו. הטמעת המשטח הצדדי היא הפשוטה ביותר, אך ניתן להתאים זאת בהתאם להעדפה אישית או לשאלה הביולוגית שיש לענות עליה.
       2. כוון את הציר הארוך של העובר בניצב לציר הארוך של הכיסוי.
       3. אם העובר אינו שוכב בכיוון המועדף, נקו את הפינצטה כדי להסיר כל שמן שינתק את העובר מהדבק. לאחר מכן, נסו בעדינות לגלגל את העובר למקומו.
   12. הכן את מספר העוברים הרצוי להזרקה באופן שתואר לעיל.
       הערה: ככל שיעבור הזמן לאחר הסרת הכוריאון, אוויר הסביבה יתחיל לייבש את העוברים וכך ההשפעה של שלב 5.3 לא תהיה אחידה עבור העוברים על הכיסוי, אשר הוסתרו בזמנים שונים. בדרך כלל, 1-3 עוברים הם הטובים ביותר לניהול.
3. ייבשו עוברים.
   1. מניחים את הכיסוי עם העוברים לתוך תא ההתייבשות המוכן ואוטמים אותו.
   2. אפשר לעוברים להתייבש במשך 5-12 דקות.
      הערה: התזמון של שלב זה תלוי בטמפרטורת הסביבה והלחות ולכן יש לקבוע זאת באופן אמפירי.
   3. הסר את הכיסוי מהתא והניח עליו טיפה של שמן הלוקרבון 700, המכסה באופן מלא את העוברים, כדי למנוע התייבשות נוספת.
   4. בדוק את העוברים על היקף ניתוח כדי לשפוט ייבוש תקין.
   5. אם העוברים רק מעט מכווצים, אך לא מנופחים, המשיכו למיקרו-איניג'קציה (שלב 6).
   6. אם העוברים אינם מיובשים במידה מספקת או יתר על המידה, חזרו לשלב 5.2 והכינו קבוצה חדשה של עוברים מכיוון שלא ניתן להסיר את שמן ההלוקרבון 700. אם העוברים יובשו יתר על המידה, קיצרו את זמן ההתייבשות לקבוצה הבאה של העוברים ב-3 דקות; אם הם היו חסרי ייבוש, הגדילו את זמן ההתייבשות ב-3 דקות.

6. עוברים זעירים

הערה: ודא שמערך המיקרו-איניג'קציה כולל מיקרוסקופ הפוך, מיקרומניפולטור להחזקת ומיקום מחט ההזרקה, ומיקרו-איניג'קטור מסחרי כדי לספק נפחים מבוקרים.

1. הפעל את המיקרו-איניג'קטור והזן את ההגדרות המועדפות.
   הערה: עבור פרוטוקול זה, מומלץ להשתמש בפלט תנועה ליניארי ובהגדרה המהירה, אך רבים אחרים יעבדו. המפעיל צריך לקבוע העדפה אישית.
2. טען את המחט לתוך המיקרומניפולטור. כדי למנוע מהמחט להינזק בעת העמסת הכיסוי המכיל את העוברים, הזיזו אותה מהדרך למצב בטוח.
3. מניחים את הכיסוי על הבמה, עם עוברים למעלה, לכיוון המחט. לאחר מכן, הזיזו בזהירות את המחט בחזרה למקומה לצורך הזרקה, כשהקצה שלה עדיין הרבה מעל הבמה.
4. שים את המטרה 4x לתוך נתיב האור. באמצעות ידית המיקוד במיקרוסקופ, הביאו את העוברים לפוקוס.
   הערה: זה יהיה מישור המוקד המשמש להזרקה והוא יותאם רק באופן מינימלי בהמשך.
5. באמצעות פקדי הבמה, הזז את העוברים אופקית למרכז שדה הראייה.
   1. התרחקו מהעוברים, תוך שמירה עליהם בקצה שדה הראייה, כהכנה להנמכת המחט. הישארו באותו מישור מוקד כדי לוודא שהמחט מורדת למיקום הנכון.
6. הורידו את קצה המחט למישור המוקד הנכון וודאו שהוא נראה בשדה הראייה יחד עם העוברים.
   1. באמצעות פקדי המיקרומניפולטור וההסתכלות מלמעלה (עדיין לא דרך השעניות), מפילים באיטיות את קצה המחט לתוך השמן, ומכוונים לאזור שאליו מצביעה המטרה. מכיוון שהשמן צמיג למדי, לכו לאט כדי למנוע פגיעה במחט.
   2. לאחר שהמחט נראית דרך העיניים, המשך להשתמש בבקרות המיקרו-מניפולטור עד שקצה המחט נמצא בפוקוס ובמרכז שדה הראייה.
   3. על ידי הזזת הבמה, החזירו את העוברים למרכז שדה הראייה. השתמש בבקרת הבמה, בבקרת המיקרומניפולטור ובידית המיקוד כדי לכוונן את מיקום העובר ואת קצה המחט ביחס זה לזה בזמן ששניהם נמצאים בפוקוס. יש לשאוף לבצע זריקות קרוב ככל האפשר לכיסוי.
7. בצע בקרת איכות מחט.
   1. כדי להבטיח שהמחט מתפקדת, הוציאו חלק מתמיסת ההזרקה לשמן הלוקרבון 700 המקיף את העובר, הנראה כבועה בשמן.
   2. אם שום דבר לא זורם מתוך המחט, בהדרגה להגדיל את הלחץ על המזרק. אם זה לא עובד, קבל מחט חדשה.
8. להזריק את העובר.
   הערה: נפחי ההזרקה המקובלים נעים בין ~ 0.06-1 pL. הגבול התחתון נקבע על ידי מה שניתן לדמיין כניסה לעובר. הגבול העליון נקבע על ידי הטראומה שהזריקה מפעילה על העובר.
   1. להזריק לאורך הקצוות הצדדיים של העובר מכיוון שזה הכי פחות פולשני.
   2. באמצעות בקרות הבמה, הזז את העובר לכיוון קצה המחט עד שהאחרון מנקב בעדינות את העובר ונכנס אליו.
   3. במקביל, להתחיל את זרימת תמיסת ההזרקה ולצפות בהופעת נקודה שקופה חולפת באתר של קצה המחט, אשר מציין העברה מוצלחת של נוזל לתוך העובר.
   4. עקוב אחר העובר. אם העובר מתנגד למחט ונקרע (ציטופלסמה מתיזה החוצה) עם הכניסה, יש לחזור לשלב 5 ולהאריך את זמן ההתייבשות. אם העובר שטוח כנגד הכיסוי ונראה תקליטון במהלך ההזרקה, חזור לשלב 5, וקצר את זמן ההתייבשות.
   5. אם לא נכנס צבע לעובר, ודא שצבע עדיין יכול לזרום בחופשיות מהמחט כמו בשלב 6.7. אם הצבע אינו זורם, החלף את המחט. אם הצבע אכן זורם, הזריקו עובר חדש והתחילו לשחרר את הצבע רגע לפני שהמחט מנקבת את העובר.
      הערה: זריקות חוזרות ונשנות של אותו עובר אינן מומלצות מכיוון שהוא קורע את פצע/אתר ההזרקה הקודם.
9. חוזרים על הפעולה עד שכל העוברים מוזרקים.

7. דימוי עוברים

הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.

1. מניחים כיסויים לתוך מחזיק המתכת במיקרוסקופ הקונפוקלי, כך שהעוברים מצטלמים ישירות מלמטה דרך הכיסוי; מעל הכיסוי, יש רק שמן ואין מחסום אחר.
2. כצעד של בקרת איכות, התמונה השתמשה תחילה בפונקציית האפיפלואורסצנציה במיקרוסקופ הקונפוקלי, עם מטרה של פי 40. וודאו שהפלואורופור נראה בעובר לפני שתמשיכו.
3. אם מישור ההדמיה הרצוי שונה ממקום ההזרקה, אפשרו מספיק זמן לצבע להתפזר לאזור המטרה.
   הערה: עבור BOPIPY 493/503, הזמן הזה נע בדרך כלל בין 30-60 דקות. מכיוון שזמן הדיפוזיה תלוי מאוד בצבע, צבעים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של מקום ההזרקה וזמן ההמתנה.
4. השתמש במטרות שונות להדמיה בקני מידה שונים. השתמש במטרה של פי 40 כדי לצלם את כל העובר ובמטרה של פי 63 כדי לצלם תתי-סעיפים עבור קני מידה קטנים יותר.
5. להדמיה חיה בשלבים הסינקטיאליים לפני הסלולריזציה, השתמש בתנאים הבאים כדי להתחיל עם: גודל תמונה של 512 x 512 פיקסלים, ממוצע שורה של 3, קצב פריימים של 0.1 פריימים לשנייה (כלומר, מסגרת אחת שנרכשה כל 10 שניות). התאם את התנאים בהתאם ליכולות המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש.
   הערה: תנאים אלה מאפשרים לרכוש ~ 500+ תמונות מ- BOPIPY 493/503 וללכוד את רוב התנועה.

8. נתחו את זרימת ה-LD על ידי שימוש תחילה בפיג'י כדי להכין סדרת זמן של תמונות, ולאחר מכן פייתון לניתוח PIV

1. מטב את רכישת התמונה.
   1. לבצע זריקות של הצבע הרצוי בשלב המתאים. חזור על שלב זה עד שהשונות היומיומית תהיה זניחה.
   2. מטב את הגדרות רכישת התמונה, כולל הגדלה, זום, רזולוציה וקצב פריימים.
      הערה: יש פשרה בין תמונות באיכות גבוהה (רזולוציה + ממוצע קו) לבין מהירות רכישה (קצב פריימים).
2. הכן נתונים בפיג'י.
   1. רכשו סדרת זמן איכותית לניתוח.
   2. פתח מסגרת אחת של סדרת הזמן כדי ליצור מסכה עם FIJI. שכפל את התמונה. המרת סוג התמונה ל- 8 סיביות.
   3. הגדר את הגבול של העובר באמצעות מצולע או כלי בחירה ביד חופשית. השתמשו ב'ברור חיצוני' כדי להגדיר ערכי פיקסלים מחוץ לבחירה ל-0. נקה ולאחר מכן הפוך בתוך הבחירה כדי להגדיר את ערך הפיקסלים בתוך הבחירה לערך המרבי (255).
   4. בטל את הבחירה ולאחר מכן השתמש בפקודה היסטוגרמה כדי להבטיח שקיימים רק ערכי פיקסלים של 0 ו- 255.
   5. שמור מסיכת תמונה חדשה זו עבור סדרת הזמן הספציפית.
   6. פתח את סדרת הזמן של עניין. בחר אילו עשר מסגרות לוכדות בצורה הטובה ביותר את זמן העניין, לדוגמה, מחזור גרעיני 9 בתחילת ההתכווצות בקליפת המוח. שכפל את עשר מסגרות העניין, ויצר שקית משנה.
   7. השתמש בפונקציה Stack to Images כדי ליצור 10 תמונות לניתוח באמצעות PIV.
   8. שמור את הקבצים הבודדים באופן שישמור על הסדר שלהם (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. השתמש במסכה המוכנה ובמסגרות בודדות לניתוח PIV, תוך שימוש בסקריפט הפיתון לדוגמה שסופק (נתונים משלימים) או בסקריפט מותאם אישית שנוצר על-ידי המשתמש.
   הערה: הסקריפט שסופק מבוסס על יישום הפייתון של OpenPIV¹⁷. הוא מפיק מרחק בפיקסלים שניתן להמיר באמצעות רוחב הפיקסלים וקצב הפריימים כדי ליצור מהירויות או מהירויות.
4. צור שכפולים על-ידי השלמת השלבים הקודמים עבור עוברים נוספים והרכבת ערכי הפלט.

Representative Results

לאחר ההזרקה, הצבע יתמקם רק באתר בו הוכנס קצה המחט. לאחר מכן הצבע יתפזר הרחק ממקום ההזרקה בהתאם למאפייניו המפוזרים. איור 1 מראה הזרקה של BODIPY 493/503, זמן קצר לאחר ההזרקה (פאנל A) ו-24 דקות מאוחר יותר (לוח B). לאחר 24 דקות, הצבע הגיע בערך לנקודת האמצע של הציר הארוך של העובר.

ניתוח תנועתיות אברונים יכול להיות מושגת באמצעות זריקות צבע והדמיה בהילוך מהיר. באיור 2, עובר הוזרק במשותף עם BODIPY 493/503 (איור 2A) ו-LysoTracker Red (איור 2B) וצולם באמצעות עירור לייזר ב-488 ו-596 ננומטר, בהתאמה. העובר הזה צולם לאחר מכן בהילוך מהיר (פריים אחד כל 30 שניות במשך 30 דקות, 5 דקות נותחו). לאחר מכן, סדרת הזמן הופעלה באמצעות ניתוח PIV, שהפלט שלו מוצג באמצעות תייעלות באיור 2A,B. שים לב שהזרמים אינם מייצגים את מסלולם של חלקיקים בודדים, אך הזרימה הציטופלסמית מסיקה מניתוח כל החלקיקים באזור זה של הציטופלסמה. באמצעות תיוג של שני מבנים תאיים בלתי תלויים (LDs ואברונים חומציים), ניתוח PIV מוצא זרימות דומות, כאשר שתי התוויות מתכנסות על האזור המרכזי של העובר שבו הציטופלסמה זורמת לתוך פנים העובר⁶.

ה- FPs הזמינים כיום מאפשרים תיוג של אברונים ומבנים תאיים רבים אחרים. איור 3 מראה את הסימון של ה-ER באמצעות גשש ER Green. גשש ER מספק רזולוציה יפה של המעטפת הגרעינית, ומאפשר הדמיה של שלבי מחזור תאים עיקריים. גשש ER Green מצולם באמצעות עירור של 488 ננומטר.

התיוג של המיטוכונדריה הוא מסובך, שכן נראה שרוב הצבעים שנבדקו נלכדו במיטוכונדריה הראשונה שהם נכנסים אליה. מצד שני, לא זוהה שום סימן לרעילות צבע, מה שמאפשר לעקוב אחר מיטוכונדריה מסומנת באמצעות התאים והמחזור הגרעיני האקטודרמלי 15. איור 4 מראה תא אקטודרמלי מספר שעות לאחר ההזרקה עם Mitoview 633 (אורך גל של עירור 633 ננומטר).

BODIPY, Lysotracker ו- LipidSpot הם חזקים וניתן להשתמש בהם כדי לרכוש ~ 500+ תמונות ב 512 x 512, שורה ממוצעת 3, קצבי פריימים מ 1/s עד 0.1/s. גשש ER ירוק, SiR-tubulin, והצבעים המיטוכונדריים שהוזכרו פחות חזקים ומניבים ~ 50-200 תמונות באותם תנאים.

החל משלבי הבלסטודרם, LDs נעים באופן דו-כיווני לאורך מיקרוטובולים, המופעלים על ידי מנועי הקוטביות ההפוכה קינסין-1 ודיינין ציטופלסמי⁵. ניתן לדמיין את התנועה הזו על ידי תיוג משותף של LDs ומיקרוטובולים באמצעות הזרקת BODIPY 493/503 ו-SiR-Tubulin (איור 5). מכיוון ש-LDs הופכים לעתים קרובות את כיוון התנועה שלהם (כשהם עוברים בין קינזין-1 לדינאין ציטופלסמי), קצבי פריימים גבוהים יותר במהלך הרכישה לוכדים טוב יותר פרטים קריטיים של תנועתיות LD.

הדמיה חיה של שלפוחיות חלמון אוטופלואורסצנטיות אפשרית ללא כל צורה של הזרקת צבע (איור 6). עם זאת, האוטו-פלואורסצנציה עמומה, ולייזר העירור הוא פוטוטוקסי. לפיכך, להדמיה חיה של חלמון אוטופלואורסצנטי יש יחס אות לרעש גרוע ביחס להזרקת צבע.

איור 1: דיפוזיה של BODIPY 493/503 דרך העובר. הצבע הוזרק לאורך הקצה הצדדי לכיוון הקצה הקדמי (מימין למעלה) ומתפזר מאתר ההזרקה הזה לתוך העובר, תוך שהוא מסמן LDs. (A) הצבע התפזר דרך חלקים מהעובר הסמוכים לאתר ההזרקה. (B) בערך 24 דקות/2 מחזורים גרעיניים מאוחר יותר, הצבע התפזר מעבר לנקודת האמצע של העובר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: וולוצימטריה של תמונת חלקיקים (PIV) עבור LDs ואברונים חומציים. לעובר הוזרק גם BODIPY 493/503 וגם ל-LysoTracker Red. (A) ערוץ BODIPY. (B) LysoTracker ערוץ אדום. (א', ב') ייעל דיאגרמות שנוצרו על-ידי ניתוח PIV של שני הערוצים שנוצרו מ-10 מסגרות עוקבות, כולל אלה המוצגות ב-A וב-B. A' מתאים לזרימה של LDs, ו-B' מתאים לזרימה של אברונים חומציים. שימו לב שגם A' וגם B' מראים מפגש שמאלי של מרכז שבו התכולה העוברית זורמת מחוץ למישור הראייה, למרכז העובר. כמו כן, שים לב כי BODIPY התפזר יותר מאשר LysoTracker כמו צבעים שונים יש תכונות מפוזרות שונות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: גשש ER מתייג חטיבות גרעיניות סינסיטיאליות. עובר בלסטודרם סינסיטיאלי הוכנס למיקרו-איניג'קט עם גשש ER וחלק מפני השטח שלו צולם לאורך זמן. (A) הרכבת ציר במהלך חטיבת גרעין. (ב) סילוק המעטפת הגרעינית באותה חלוקה. (ג) אינטרפאזה עוקבת. (D) תחילת החלוקה הבאה מסומנת על ידי מראה צנטרוזום (מופע של אזורים מעגליים נטולי ER, המסומנים בראשי חץ). שימו לב להלבנת הצבע ההדרגתית. אורך גל עירור: 488 ננומטר. סרגל קנה מידה: 5 μm. A: מסגרת ראשונית, B: 3 דקות חלפו, C: 10 דקות חלפו, D: 13 דקות חלפו. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: מיטו-וויו 633 תיוג של מיטוכונדריה. לעובר הוזרק Mitoview 633 במהלך שלב הבלסטודרם הסינסיטיאלי וצולם כעבור 4 שעות, לאחר התא. התמונה מציגה תא נוירואקטודרמלי של עובר בהרחבת רצועת הנבט. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: תיוג משותף של LDs ומיקרו-טובולים. לעובר התאולרי הוזרק תערובת של BODIPY 493/503 ( צהוב A,B,C) ו-SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' מראים את הערוצים הממוזגים. לוחות A, A', ו-A '' מציגים את המסגרת הראשונית, לוחות B, B' ו-B'' מציגים את המסגרת לאחר 5 שניות, ולוחות C, C' ו-C' מציגים את המסגרת לאחר 10 שניות. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. מסגרת בגודל 512 x 512 (קו ממוצע 3) נרכשה כל 2.5 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: הדמיה של שלפוחית החלמון באופן אוטומטי במהלך שלבי הבקיעה הסינסיטיאליים. (ב) אחרי 8 דקות (ג) אחרי 16 דקות. אורך גל עירור: 405 ננומטר. עוצמת עירור נמוכה שימשה כדי לשמור על העובר בחיים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. נרכשה מסגרת בגודל 1024 x 1024 (קו ממוצע 4) כל 30 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

נתונים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

עובר דרוזופילה הוא מודל רב עוצמה ונוח לחקר שאלות יסוד בביולוגיה תאית ואורגניסטית. הפשטות היחסית שלו, הגנטיקה החזקה והגודל הקטן שלו הופכים אותה למערכת מצוינת להדמיה הן של תהליכים תאיים והן להתפתחות. כאן, פרוטוקול מיקרו-איניג'קציה סטנדרטי מותאם כדי לאפשר שימוש ב-FP בעוברים. גישה זו מאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של מבנים תאיים ספציפיים ללא צורך בפלואורופורים מקודדים גנטית, ופותחת רקעים גנטיים רבים להדמיה. שילוב של צבעים מרובים בתוספת חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי שנבחר באופן אסטרטגי יכולים לפתוח הדמיה חיה רב-ערוצית המשתרעת על פני כל הספקטרום של האור הנראה.

שלבים קריטיים בפרוטוקול:
פרוטוקול זה משתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לתייג LDs. ניתן להתאים גישה זו בקלות לסימון מבנים תאיים אחרים. לניתוח תמונה מאוחר יותר, אחד הגורמים החשובים ביותר הוא יחס האות לרעש, כלומר בהירות הצבע בהשוואה לאות הרקע. ליזוזומים צולמו בהצלחה (LysoTracker Red, 1 mM), כמו גם מיטוכונדריה (Mitoview 633, 200 μM), ה-ER (גשש ER Green, 10 μM) והמיקרו-טובולים (SiR tubulin, 200 nM ב-DMSO), כפי שמוצג באיור 2, איור 3, איור 4, איור 5. בנוסף, שלפוחיות חלמון הן אוטו-פלואורסצנטיות ומעבירות אור כחול על עירור UV (תמונה המשתמשת ב-405 ננומטר כאורך הגל של העירור (איור 6)). עבור צבעים אחרים, יש לשאוף שריכוז הצבעים יהיה פי 100-1,000 ממה שיידרש להכתמת תאים בתרבית חיה; זה דומה לריכוז של תמיסת מלאי שתדולל למדיה של תרביות תאים. מכיוון שפרוטוקול זה דורש הזרקה של 100 fL ועובר Drosophila הוא בערך 9 nL בנפח¹⁸, ריכוזי הצבעים האלה יהיו בממוצע לריכוז עוברי פנימי של פחות מ-1/100 ממה שנמצא בתקשורת תרביות התאים. באופן זמני, הריכוז המקומי יהיה גבוה יותר באתר ההזרקה, שהוא הרלוונטי ביותר עבור FPs שאינם מתפזרים היטב (כלומר, צבעים מיטוכונדריאליים ו- SiR-tubulin). עבור FPs אלה, התחל בריכוזים הגבוהים המומלצים; אם נצפה מוות בלתי צפוי, מדללים ברצף פי שניים עד שמגיעים לפשרה מקובלת בין הישרדות לעוצמת האות.

בעת הזרקה משותפת של מספר צבעים, שני הצבעים צריכים להיות באותו ממס, או שגם הממסים וגם הצבעים צריכים להיות תואמים לתערובת (ריכוזי אלכוהול העולים על כ-10% אינם מומלצים).

איכות המחטים חיונית להצלחת הליך זה, שכן הקצה צריך להיות בסדר ככל האפשר. אחרת, נזק מפצע ההזרקה עלול לפגוע בהתפתחות הבאה של העובר. מכיוון שמושכי המחטים המסחריים שונים זה מזה, חשוב לעקוב אחר ההצעות של היצרן ולנסות מספר פרמטרים של משיכה עד להשגת הצורה הרצויה. זה קריטי לבצע את שלב בקרת האיכות 1.1.3 מכיוון שעבודה עם קצה מחט סדוק, משונן או משעמם גדול תהפוך את ההזרקה המוצלחת לקשה יותר או אפילו בלתי אפשרית.

יש לייבש את העובר באופן חלקי, כך שניתן יהיה להוסיף כמויות נוספות של נוזלים במהלך ההזרקה. אם העובר לא מיובש מספיק, המחט לא תיכנס בקלות, והציטופלסמה תשפריץ החוצה כשהמחט חודרת או בזמן שהתמיסה מוזרקת. אם העובר מיובש יתר על המידה, הוא ייראה מנופח ולא יתפתח כראוי. זמן הייבוש המדויק תלוי בתנאים המקומיים, למשל, לחות האוויר, ויכול להשתנות מיום ליום. זה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל מפגש.

יכולתו של העובר לשרוד לאחר מיקרו-אינציה תלויה באופן קריטי באיכות המחט, בייבוש נכון ובהגבלת נפח ההזרקה לפחות מ-1 pL (באופן אידיאלי 100 fL). כל עוד פרמטרים אלה מותאמים, לא ניכרת רעילות משמעותית כאשר מזריקים את הצבעים המתוארים בריכוזים המומלצים. אם העוברים שורדים את שלבי ההתייבשות וההזרקה, הם בדרך כלל מתפתחים בהצלחה היטב להרחבת רצועת הנבט, יוצאת דופן היא בדיקות המיקרוטובול והמיון שגרמו לפגמים בסלולריזציה ברמות גבוהות (הזרקת 100 fL של ריכוז המלאי של כל אחד מהם). הבדיקה לא מצאה פגמים התפתחותיים ברורים כאשר DMSO, מים ותערובות של השניים הוזרקו בכמויות המומלצות, עם שיעור הישרדות עובר באמצעות הארכת רצועת נבט של כ-75% או יותר. נפחי הזרקה של יותר מ-1 pL גרמו למומים ועוברים שהוזרקו להם כ-4 נפחי pL שפותחו במשך פחות משעה אחת. לכן, נפחי ההזרקה צריכים להישמר נמוכים, מה שאומר שריכוזי הצבע צריכים להיות גבוהים.

בדרך כלל, זריקות לאורך הקצה הצדדי של העובר מומלצות מכיוון שאלו גורמות לנזק הנמוך ביותר. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים את אתר ההזרקה בהתאם לתכונות המפוזרות של ה- FPs המועסקים. BODIPY 493/503 ו-LysoTracker מתפזרים מהר יותר על פני כל העובר מאשר ליפיד ספוט 610 (צבע נוסף לסימון LDs), בעוד ש-SiR-Tubulin ו-Mitoview 633 לעולם אינם מתפזרים במלואם על פני העובר (הדמיה כבר 7 שעות לאחר ההזרקה). לכן, הזרקה באתר העניין או בסמוך לו עשויה להיות נחוצה. בעת הזרקת באזורים הקדמיים או האחוריים, מומלץ מחט עדינה במיוחד.

רכישת תמונה מסתמכת על מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחתוך אופטית ולפתור אברונים קטנים ואת כל רכיבי השלד הציטוסקליים. טכניקות הדורשות ניתוח של תמונות רבות (למשל, STORM או PALM) לא יעבדו מכיוון שהתכולה העוברית נמצאת בתנועה והפלואורופורים אינם מותאמים לצילום. מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית חסרה את הרזולוציה הצידית והצירית כדי להבחין ברוב האברונים ובמבנים תאיים קטנים יותר. מסיבות אלה, מומלץ מאוד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי או להשתמש בטכנולוגיית יריעת אור.

יכולת השחזור של ניתוח התמונה מסתמכת במידה רבה על נתוני הדמיה עקביים. עבור הסיכוי הגדול ביותר להצלחה, נדרש אופטימיזציה של טכניקת ההזרקה ורכישת התמונה. הקמה ותרגול של טכניקה שבה הצבעים המעניינים, אתר ההזרקה, גיל העובר, נפח ההזרקה ומערך הרכישה הם כולם עקביים תיצור את הנתונים החזקים ביותר לניתוח תמונה.

שינויים ופתרון בעיות של השיטה
פרוטוקול זה מדגים שיטה לניתוח הזרימה הגדולה של LDs בעוברים בשלב המחשוף באמצעות ולוצימטריה של תמונת חלקיקים. אותה גישה יכולה לשמש עבור אברונים אחרים, שלבים התפתחותיים אחרים ושיטות ניתוח אחרות. לדוגמה, איור 2 מראה ניתוח של LDs ואברונים חומציים הזורמים בשלבים הסינסיטיאליים של אמבריוגנזה, והודגם על ידי הזרקה משותפת של BODIPY 493/503 ו-LysoTracker Red. הושגה הדמיה מוצלחת נוספת של תנועת LD בעוברים עד 7 שעות לאחר ההפריה; עוברים אלה אכן שומרים על פצע ההזרקה אך מסוגלים להתפתח במשך מספר שעות.

נתונים שנאספו באמצעות פרוטוקול זה שימשו לולוסימטריה של תמונת חלקיקים, אך טכניקות ניתוח רבות אחרות זמינות. לדוגמה, ניתן להשתמש בתוכניות מעקב אחר חלקיקים כמו אלה שנמצאו ב-ImageJ, ב-Imaris או במעקב ידני כדי להשיג מהירויות וכיוונים של מבנים נעים. שים לב שרוב תוכנות המעקב הללו בנויות לעבודה עם נתונים ממערכות תרביות תאים מישוריות ולא תמיד מסתגלות היטב למבנים תלת-ממדיים כמו עובר דרוזופילה . יתר על כן, עבור יצירת נתוני מעקב אחר חלקיקים באיכות הטובה ביותר, יהיה צורך לצלם מספר מישורי Z; זה אמור להיות אפשרי אם זמני רכישת מחסנית התמונות הם מתחת ל~ 2 שניות. אמת מידה זו צריכה להיות נגישה על קונפוקל דיסק מסתובב, יריעת אור סריג, ומערכות קונפוקליות אחרונות לסריקת לייזר. עם זאת, ההיתכנות של מעקב אחר חלקיקים עבור אברונים שופעים כגון LDs, מיטוכונדריה וליזוזומים נמוכה מכיוון שכמות האות החיובי בשדה ראייה גבוהה מדי עבור שיטות המעקב הנוכחיות. מעקב אחר מבנים פחות נפוצים כמו גרעינים או שלפוחיות חלמון עשוי להיות אפשרי. PIV לניתוח זרימה עובד היטב עבור LDs ואברונים חומציים בשלבי מחשוף מכיוון ששני האברונים נעים בחופשיות. אברונים כמו גרעינים, ER ומיטוכונדריה קשורים למבנים תאיים אחרים ולכן אינם נעים בחופשיות ואינם מתאימים לניתוח תוכנה המניח תנועה חופשית. החוקר צריך לבחור את הטכניקות המתאימות ביותר לאברון של העניין.

במהלך שלבי הבלסטודרם הסינסיטיאליים והתאיים, LDs (כמו גם כמה אברונים אחרים) נעים לאורך מיקרוטובולים בעלי אוריינטציה רדיאלית⁵. לכן ניתן למצוא תצוגות חתך (כמו באיור 5) שבהן מיקרוטובולים בודדים נמצאים במוקד למרחקים ארוכים, מה שמאפשר מעקב אחר חלקיקים בדו-ממד. מכיוון שמישורים אופטיים אלה נמצאים עמוק בתוך העובר, עוצמת האות הכוללת פוחתת, ויחס האות לרעש מצטמצם.

לצורך ניתוח מעקב, הדמיה מהירה ככל האפשר יכולה לחשוף פרטים חיוניים של התנועה וכך של מנגנון תנועתיות. לדוגמה, תנועת ליפיד-טיפה היא תערובת של שני מצבי תנועתיות, תנועה איטית-קצרה (~200 ננומטר לשנייה; מרחק נסיעה ממוצע ~100 ננומטר) ותנועה מהירה-ארוכה (~450 ננומטר לשנייה; מרחק נסיעה ממוצע ~1,000 ננומטר)¹⁹; לפיכך, אם התמונות מצולמות כל שנייה או אפילו בתדירות נמוכה יותר, המצב האיטי-קצר הופך לבלתי ניתן לגילוי. עם זאת, הדמיה תכופה גם גורמת להלבנת פלואורופורים ולטוקסיות פוטוטוקסיות. תנאי ההדמיה, אם כן, צריכים להיות מותאמים בהתאם לשאלה המדויקת שיש לטפל בה.

מגבלות השיטה
בהתאם לצבע הרצוי, השיטה יכולה להיות מוגבלת על ידי תאימות בין מסיסות הצבע לבין הרעילות של תמיסת ההזרקה. אלכוהולים כמו איזופרופנול ואתנול קשים לטיפול בתוך מחט בשל צמיגותם הנמוכה יותר ונראה שהם פוגעים במרכיבים התאיים והורגים את העובר.

השיטה גם לא מתאימה לדמיין את הצעדים המוקדמים ביותר באמבריוגנזה מכיוון שלוקח 30+ דקות להכין את העוברים להזרקה. בטמפרטורת החדר, מחזורי התאים ההתחלתיים של העובר הם באורך של כ-10 דקות בלבד כל אחד; לכן, גם אם היו בוחרים ביצית שזה עתה הופרה בשלב 5.2.3, מחזורי התאים הראשונים כבר היו מסתיימים עד שהעובר יהיה מוכן להדמיה.

תאורה עם אור בטווח ה-UV/כחול היא הרבה יותר פוטוטוקסית מאשר באורכי גל ארוכים יותר. בתנאים כאלה (למשל, לעקוב אחר שלפוחיות חלמון אוטופלואורסצנטיות; איור 6), יש להגביל את זמן ההדמיה (מה שמוביל לסדרות זמן קצרות יותר) או להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר (וכתוצאה מכך יחס אות לרעש מופחת).

לאחר התאים, צבעים המוזרקים במיקום מסוים נוטים להתפזר בצורה גרועה, מכיוון שהם חייבים לחצות קרום תאים רבים. זה מגביל את אזור התצפית בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר.

משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
ניתן לדמיין את התנועה של LDs ואברונים אחרים המכילים שומנים בעוברים מוקדמים באמצעות פלואורופורים מקודדים גנטית, טכניקות ללא תוויות, ועל ידי הכנסת FPs. זה האחרון יכול להיות מושגת על ידי permeabilization של קרום vitelline¹² או את גישת microinjection הנדון כאן.

פלואורופורים המקודדים גנטית הם סמנים רב-תכליתיים שרמותיהם בדרך כלל ניתנות לשחזור גבוה מעובר לעובר. עם זאת, יש להם תפוקות קוונטיות נמוכות יותר ואקונומיקה בקלות רבה יותר מאשר FPs. בדרך כלל, הם זמינים רק בגרסה מתויגת אחת או שתיים (למשל, GFP או mCherry), מה שמגביל את הבחירה אילו מבנים ניתן לצלם בו זמנית. FPs, לעומת זאת, קיימים לעתים קרובות במגוון גדול; לדוגמה, צבעים ספציפיים שונים של טיפות שומנים זמינים עם ספקטרום פליטה מ-Autodot בספקטרום UV/כחול ל-Lipidtox ול-LipidSpot 610 בספקטרום האדום-רחוק. FPs יכולים גם להיות מיושמים ישירות על כל זן בעל עניין, ולכן אינם דורשים בניית מתח כדי, למשל, להכניס את סמן האברונים הרצוי לתוך זן מוטנטי של עניין. יתרון זה בולט במיוחד כאשר יש לסמן מבנים מרובים בו זמנית; במקום צלבים גוזלים זמן רב המתפרשים על פני דורות רבים, ניתן להשיג זאת ביום אחד על ידי ערבוב הצבעים הרלוונטיים והצגתם בו זמנית. לבסוף, אם יש לחקור תהליכים תאיים עם עיכוב פרמקולוגי, ניתן להכניס תרופות וצבעים יחד.

שיטות ללא תוויות הן גישות חזקות מאוד לאיתור מבנים תאיים ספציפיים. לדוגמה, LDs ניתן לזהות באופן ספציפי בעוברים מוקדמים על ידי מיקרוסקופיה דור שלישי הרמוני²⁰ או על ידי femtosecond מגורה Raman Loss מיקרוסקופיה²¹. בדומה ל-FPs, ניתן ליישם גישות אלה בכל רקע גנטי, ומכיוון שהן אינן גורמות להלבנה, הן עשויות לאפשר רכישת תמונה מהירה יותר. עם זאת, הם בדרך כלל מוגבלים לאברונים ספציפיים ולכן אינם תומכים בעצמם בהדמיית מולטיפלקס; הם גם דורשים מיקרוסקופים מיוחדים.

ישנן שתי אסטרטגיות כלליות להחדרת מולקולות קטנות לעוברים. האחת היא גישת המיקרו-איניג'מנט הנהוגה כאן; השני הוא טיפול כימי (טרפן) כדי לחדור את קרום vitelline. הגישה האחרונה¹² פחות מעורבת ממיקרו-אינקציה, אך גם משתנה יותר מעובר לעובר. בנוסף, לאחר חלחול, ההגנה שמספקת קרום הוויטלין נפגעת והעובר הנכון נגיש למדיום החיצוני, מה שמקשה עליו יותר לשמור עליו בחיים. מיקרו-איניג'קציה נוטה הרבה פחות לשבש התפתחות עוברית מאשר חדירה. עם זאת, חלחול מומלץ אם יש צורך במעקב אחר עוברים רבים בו זמנית, למשל למטרות בדיקת סמים. כדי לעקוב אחר התנועה של מבנים תאיים ולהשיג סדרות תמונות הניתנות לשחזור המתאימות לניתוח תמונה, מיקרו-איניג'קציה היא שיטת הבחירה.

חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים
עובר דרוזופילה הוא מודל חשוב לחקר תהליכים תאיים-ביולוגיים והתפתחותיים רבים ^1,5,6. תיוג אברונים עם חלבונים פלואורסצנטיים תרם תרומה משמעותית להבנת האופן שבו העובר המוקדם מתפתח, כיצד תנועה של אברונים שונים, וכיצד סחר כזה מווסת מבחינה התפתחותית וגנטית. עם זאת, הנטייה שלהם להלבין והאתגרים של יצירת זנים שבהם אברונים מרובים מסומנים בצבעים שונים מגבילים את היישום של גישה זו. השימוש ב-FPs שהוכנסו על-ידי מיקרו-אינדקציה פותר רבים מהאתגרים הללו ואף ניתן לשלב אותו עם חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של אברונים מרובים, מבני תאים ורכיבי שלד ציטוסקטליים בכל רקע גנטי. כתוצאה מכך, ניתן להשוות מספר גנוטיפים באמצעות הדמיה חיה, מה שמאפשר לקבוע את השפעת המוטציות על הסחר באברונים מרובים.

פרוטוקול זה מדגים את גישת הזרקת ה-FP לעוברים של Drosophila melanogaster, אך באופן עקרוני, גישה זו חלה על כל ביצי חרקים שעבורם נקבעו טכניקות מיקרו-החדרה, כולל מינים אחרים של דרוזופילה, צרצרים²² וכנימות²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue