Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Подход к сегментации без меток для прижизненной визуализации микроокружения опухоли молочной железы

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

Описанный здесь метод прижизненной визуализации использует вторую гармоническую генерацию коллагена и эндогенную флуоресценцию от метаболического кофактора NAD(P)H до неинвазивного сегментирования немаркированного микроокружения опухоли в опухолевые, стромальные и сосудистые компартменты для углубленного анализа 4D-прижизненных изображений.

Abstract

Способность визуализировать сложные и динамические физиологические взаимодействия между многочисленными типами клеток и внеклеточным матриксом (ECM) в микроокружении живой опухоли является важным шагом на пути к пониманию механизмов, которые регулируют прогрессирование опухоли. Хотя это может быть достигнуто с помощью современных методов прижизненной визуализации, это остается сложным из-за гетерогенной природы тканей и необходимости пространственного контекста в рамках экспериментального наблюдения. С этой целью мы разработали рабочий процесс прижизненной визуализации, который сочетает в себе визуализацию коллагена второй гармонической генерации, эндогенную флуоресценцию из метаболического кофактора NAD(P)H и флуоресцентную пожизненную визуализационную микроскопию (FLIM) в качестве средства неинвазивного разделения микроокружения опухоли на основные домены опухолевого гнезда, окружающей стромы или ECM и сосудистой системы. Этот неинвазивный протокол детализирует пошаговый процесс, начиная от получения покадровых изображений моделей опухолей молочной железы до постобработочного анализа и сегментации изображений. Основным преимуществом этого рабочего процесса является то, что он использует метаболические сигнатуры для контекстуализации динамически изменяющегося микроокружения живой опухоли без использования экзогенных флуоресцентных меток, что делает его выгодным для моделей ксенотрансплантата (PDX), полученных от пациентов, и будущего клинического использования, где внешние флуорофоры не всегда применимы.

Introduction

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) в микроокружении опухоли динамически депонируется и ремоделируется несколькими типами клеток для дальнейшего облегчения прогрессирования заболевания 1,2,3. Эти изменения матрицы обеспечивают как механические, так и биологические сигналы, которые изменяют поведение клеток и часто приводят к непрерывному циклу ремоделированияматрицы 4. Исследование динамического, реципрокного взаимодействия между опухолевыми клетками и внеклеточным матриксом часто проводится с использованием трехмерной (3D) культуры in vitro или микрофлюидных систем. В то время как эти подходы снизу вверх продемонстрировали механизмы ремоделирования ECM 5,6,7, увеличения пролиферации8, эпителиального перехода в мезенхимальное 9,10,11,12 и миграции и инвазии опухолевых клеток 7,13,14,15,16 , их внимание было сосредоточено в основном на нескольких типах клеток (например, опухолевых клетках или фибробластах) в однородной 3D-матрице по сравнению с разнообразием и неоднородностью взаимодействий, присутствующих в физиологической ткани. В дополнение к системам in vitro, гистология опухоли ex vivo также может дать некоторое представление об этих взаимодействиях клетка-клетка и клетка-ECM17. Иммуногистохимия имеет то преимущество, что может анализировать несколько типов клеток относительно пространственно неоднородного состава и архитектуры ECM, но статические конечные точки фиксированной ткани не отражают динамический характер взаимодействий между клетками и микросредой. Прижизненная визуализация открыла дверь для изучения разнообразных и динамических взаимодействий в физиологическом контексте микроокружения нативной опухоли.

Возможности прижизненной визуализации опухоли быстро развиваются. Усовершенствования в конструкции окон визуализации и хирургические методы имплантации окон позволили проводить долгосрочную продольную визуализацию опухоли в различных анатомических местах (т.е. первичная опухоль, лимфатические узлы, метастатические участки 18,19,20). Кроме того, способность оптических приборов визуализировать и собирать данные в нескольких измерениях (т.е. спектральных, пространственных флуоресцентных интенсивностях и сроке службы), а также при высоком разрешении и скорости (скорости видео) становится широко доступной. Усовершенствованная технология дает возможность исследовать быстрые изменения клеточной сигнализации и фенотипической динамики в физиологической среде. Наконец, расширение оптогенетических инструментов и широкий спектр генетических флуоресцентных конструкций позволяют маркировать конкретные типы клеток для захвата миграции клеток в микроокружении опухоли или отслеживания клеточной линии во время развития или прогрессирования заболевания21,22. Использование этих инструментов в сочетании с технологией CRISPR/Cas9 дает исследователям возможность своевременно генерировать уникальные модели животных.

Хотя все эти достижения делают прижизненную визуализацию все более мощным методом изучения динамических и физиологических клеточных взаимодействий, по-прежнему существует важная необходимость в разработке стратегий, которые обеспечивают пространственный, временный и структурный контекст на тканевом уровне для этих биологических взаимодействий. В настоящее время многие исследования прижизненной визуализации компенсируют отсутствие визуальных ориентиров, таких как кровеносные сосуды, путем введения флуоресцентных красителей в сосудистую систему или использования мышиных моделей, которые экзогенно экспрессируют флуоресцентные белки для очерчивания физических особенностей. Инъекционные красители и субстраты, такие как флуоресцентный декстранс, широко используются для успешной маркировки сосудистой системы в прижизненных коллекциях19, 23, 24. Однако такой подход не лишен ограничений. Во-первых, он требует дополнительных манипуляций с мышью, и его полезность ограничена краткосрочными экспериментами. Для продольных исследований флуоресцентный декстран может быть проблематичным, поскольку мы наблюдаем накопление декстрана в фагоцитарных клетках или диффузию в окружающие ткани с течением времени25. Включение экзогенного флуоресцентного белка в модель мыши было представлено в качестве альтернативы флуоресцентному декстрансу, но имеет свои собственные ограничения. Доступность и разнообразие экзогенных флуорофоров в мышиных моделях по-прежнему ограничены и дороги в создании. Кроме того, в конкретных моделях, таких как модели PDX, генетические манипуляции нежелательны или невозможны. Также было показано, что присутствие флуоресцентных или биолюминесцентных белков в клетках распознается как чужеродное внутри мыши, а в иммунокомпетентных мышиных моделях это уменьшает количество метастазов из-за реакции иммунной системы хозяина26,27. Наконец, экзогенные флуоресцентные белки или флуоресцентные красители, используемые для пространственного контекста или для сегментации последующих данных, часто занимают основные диапазоны светового спектра, которые в противном случае могли бы быть использованы для исследования физиологических взаимодействий, представляющих интерес.

Использование внутреннего сигнала от ECM или эндогенной флуоресценции от клеток внутри ткани представляет собой потенциальное универсальное средство без меток для сегментации прижизненных данных для более глубокого клеточного и пространственного анализа. Второе поколение гармоник (SHG) уже давно используется для визуализации ECM28. С последующей разработкой важных инструментов, помогающих в характеристике организации волокон 29,30,31, можно охарактеризовать поведение клеток относительно локальной структуры ECM. Кроме того, аутофлуоресценция из эндогенного метаболита NAD(P)H обеспечивает еще один инструмент без меток для разделения микроокружения опухоли in vivo. NAD(P)H ярко флуоресцирует в опухолевых клетках и может быть использован для различения границ растущего опухолевого гнезда от окружающей егостромы 21,32. Наконец, сосудистая система является важной физиологической структурой в микроокружении опухоли и местом ключевых клеточных специфических взаимодействий 33,34,35. Возбуждение эритроцитов (эритроцитов) или плазмы крови было использовано для визуализации сосудистой системы опухоли, и с помощью двух- или трехфотонного возбуждения (2P; 3P) было показано, что измерение скорости кровотока возможно36. Однако, в то время как более крупные кровеносные сосуды легко идентифицируются по их эндогенным флуоресцентным сигнатурам, идентификация тонких, переменных и менее флуоресцентных мелких кровеносных сосудов требует большего опыта. Эти неотъемлемые трудности препятствуют оптимальной сегментации изображения. К счастью, эти источники эндогенной флуоресценции (т.е. эритроциты и плазма крови) также могут быть измерены с помощью флуоресцентной визуализации37, которая извлекает выгоду из уникальных фотофизических свойств сосудистой системы и представляет собой полезное дополнение к растущему набору инструментов прижизненного нерва.

В этом протоколе описан рабочий процесс сегментации четырехмерной (4D) прижизненной визуализации с явным использованием внутренних сигналов, таких как эндогенная флуоресценция и SHG, от сбора до анализа. Этот протокол особенно актуален для продольных исследований через окно визуализации молочной железы, где экзогенная флуоресценция может быть непрактичной или невозможной, как в случае с моделями PDX. Однако принципы сегментации, изложенные здесь, широко применимы к прижизненным пользователям, изучающим биологию опухоли, развитие тканей или даже нормальную физиологию тканей. Представленный набор подходов к анализу позволит пользователям дифференцировать клеточное поведение между областями выровненных или случайных конфигураций коллагеновых волокон, сравнивать количество или поведение клеток, проживающих в определенных областях микроокружения опухоли, и сопоставлять сосудистую систему с микроокружением опухоли, используя только безмечажный или внутренний сигнал. Вместе эти методы создают операционную основу для максимизации глубины информации, получаемой от 4D-прижизненной визуализации молочной железы, сводя к минимуму необходимость в дополнительных экзогенных метках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Висконсин-Мэдисон. Благополучие и лечение боли во всех экспериментах на животных имеет первостепенное значение. Таким образом, прилагаются все усилия, чтобы убедиться, что животное комфортно и хорошо ухаживает на каждом этапе процедуры.

1. Генерация окна визуализации молочной железы (MIW)

  1. Чтобы построить окно для визуализации молочной железы, изготовьте кольцо 14 мм из хирургической нержавеющей стали.
  2. Очистите обработанную оконную раму с помощью горячего раствора 5% моющего средства, промойте в течение 10 минут под проточной деионизированной водой (DI), замочите 100% этанол в течение 10 минут, а затем высушите под тепловой лампой. Автоклавируйте высушенную раму MIW и сохраните ее для последующего использования.
  3. Подготовьте защитное стекло MIW следующим образом: Замочите круглое покровное стекло No 1,5 12 мм в 100% этаноле в течение 10 минут, высушите под тепловой лампой, а затем закрепите его на металлической раме MIW с помощью цианоакрилатного клея. Отверните клей в течение ночи.
  4. Очистите собранный MIW от избытка клея, используя пропитанный ацетоном тампон, и очистите, погрузив его в 70% этанол в течение 10 минут. Дайте высохшему очищенному окну. Подготовьте MIW заранее и храните его в стерильной чашке Петри перед хирургической имплантацией.

2. Хирургическая имплантация MIW

  1. Автоклавные хирургические инструменты и дезинфицируйте поверхности 70% этанолом перед началом операции по имплантации окна.
  2. Выполните операцию на дезинфицированной столешнице с помощью согревающего одеяла, покрытого стерильным полем. Установите согревающее одеяло таким образом, чтобы температура, измеренная поверх стерильного поля, составляла 40 °C.
  3. Используйте вспомогательное холодное освещение, чтобы предотвратить высыхание тканей. Используйте увеличительные стекла для облегчения хирургической процедуры. Носите СИЗ, состоящие из стерильного, одноразового лабораторного халата, хирургических рукавов, перчаток, защиты глаз и маски для лица, как рекомендовано лучшими хирургическими практиками.
  4. Обезболить мышь с помощью аппарата испарителя анестезии с установкой изофлурана 2,0% и скоростью потока кислорода 2,0 л/мин. Вводят анальгетик (10 мг/кг мелоксикама) путем подкожной инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводят дополнительные дозы в течение первых 24 ч, предпочтительно каждые 8-12 ч в течение первых 2 дней после операции.
  5. После анестезии (подтвержденной отсутствием реакции на защемление пальцев ног) нанесите увлажняющий гель для глаз, чтобы предотвратить пересыхание глаз. Используйте крем для депиляции для удаления меха в месте операции (4-я паховая молочная железа) с последующим полосканием стерильной пропитанной водой марлей.
  6. Подготовьте депилированный хирургический участок к операции, продезинфицировав поверхность кожи 3 чередующимися скрабами с бетадином и этанолом.
  7. Чтобы начать операцию, аккуратно поднимите кожу над 4-й молочной железой No 4 с помощью щипцов. Как только кожа будет оттянута от стенки тела, удалите участок кожного слоя ~ 1 мм на кончике щипцов хирургическими микроножницами. При возникновении кровотечения прикладывайте мягкое давление стерильной марлей до тех пор, пока кровотечение не прекратится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, более крупные опухоли имеют больший потенциал кровотечения, чем меньшие опухоли или нормальные ткани.
  8. Отделите молочную железу от кожного слоя мягкими движениями щипцов в хирургическом отверстии, чтобы избежать разрезания подлежащей железы.
  9. Создайте разрез 10 мм и освободите молочную железу от кожного слоя на периферии, чтобы швы можно было наложить, не проникая в молочную железу. Добавьте PBS, чтобы покрыть открытую железу / опухоль и предотвратить высыхание.
  10. Создайте шов кошелька-струны по периферии отверстия с помощью 5-0 шелковых плетеных швов. Вставьте край MIW так, чтобы кожный слой вовлекался в приемную выемку MIW.
  11. Осторожно растяните эпителий на противоположной стороне MIW и подтолкните металлический MIW на место так, чтобы кожный слой полностью задействовал приемную выемку по всей окружности MIW. Плотно зажмите нить кошелька, чтобы втянуть дермальный слой в выемку и завязать его, чтобы полностью закрепить MIW.
  12. Добавьте местный антибиотик в кожный слой в MIW и постоянно контролируйте мышь, пока она не придет в достаточное сознание для поддержания грудинной лежачи. Поместите имплантированную MIW мышь отдельно на мягкую подстилку с иглу, помещенным в клетку, и дайте мыши восстановиться в течение 48 часов до визуализации.

3. Позиционирование и поддержание мыши на сцене микроскопа для визуализации

  1. Установите нагревательную камеру на ступень микроскопа. Используйте систему принудительного воздуха, установленную на 30 °C или любую другую подобную систему. Используйте объективный нагреватель, чтобы избежать дрейфа в фокусе z. Позвольте системе прийти в равновесие не менее чем за 1 ч до визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболенные мыши не способны должным образом поддерживать температуру своего тела, и поэтому необходимо иметь нагретую среду для любых покадровых приобретений. Объективный нагреватель помогает бороться с эффектами теплового расширения, явлением, которое вызывает дрейф в фокусе z, поскольку объективная линза и изображаемая ткань приходят к тепловому равновесию.
  2. После того, как нагревательная камера на микроскопе стабилизируется при 30 °C, обезболивайте мышь-реципиент с помощью анестезиологического аппарата, устанавливающего 2% изофлурана и скорость потока кислорода 2 л/мин.
  3. После того, как мышь успокоится (что подтверждается отсутствием реакции на защемление пальца ноги), очистите внешнюю сторону стекла MIW с помощью хлопкового аппликатора и очистителя стекла, добавьте мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание, и вставьте катетер для хвостовых вен, если это необходимо.
  4. Для поддержания надлежащей гидратации введите начальную инъекцию 0,5 мл PBS подкожно или 100 мкл через катетер хвостовой вены. Повторяйте каждые 2 ч в течение всего сеанса визуализации.
  5. Как только мышь будет должным образом подготовлена, настройте микроскоп для визуализации. Чтобы уменьшить испарение во время покадровых измерений, используйте гель на водной основе вместо воды для погружной среды. Это необходимо сделать перед размещением мыши на сцене. Пожалуйста, ознакомьтесь с Таблицей материалов для получения подробной информации об оптических компонентах.
  6. Положите мышь на ступень микроскопа, установите изофлурановый шланг и прижмите воротник MIW в 14-миллиметровое приемное отверстие во вставке сцены для стабилизации изображений. Поместите поле визуализации в фокус с помощью микроскопа и используйте яркое освещение для наблюдения сосудистой системы с кровотоком.
  7. Проверьте стабильность поля зрения. Если присутствуют артефакты дыхательного движения, нанесите мягкое сжатие на заднюю сторону железы с помощью небольшого пеноблока и куска клейкой ленты. После применения компрессии убедитесь, что кровоток поддерживается по всему полю зрения.
  8. Периодически регулируйте уровни изофлурана с шагом 0,25% во время сеанса визуализации, чтобы поддерживать надлежащий уровень седации, вручную подсчитывая дыхание животных.
  9. Поддерживайте скорость 36-40 дыханий в минуту (об/мин) для улучшения долголетия животных и оптической визуализации. Более низкая частота дыхания может привести к тому, что мышь не выживет в эксперименте, тогда как частота дыхания более 60 оборотов в минуту может привести к плохой седации, что может увеличить артефакты дыхания и движения в данных изображения.

4. Настройка для 4D, основанной на интенсивности, без маркировки прижизненной визуализации динамического поведения клеток

  1. Как только мышь будет успокоена и надежно расположена на сцене перевернутого микроскопа, начните находить интересующие области.
  2. Используя источник света, направленный на MIW, используйте окуляры микроскопа для определения потенциальных областей для исследования. Добавьте и сохраните позиции x, y в программном обеспечении, чтобы вернуться к этим позициям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мелкие детали опухоли не будут легко видны при этом типе освещения. Цель состоит в том, чтобы просто определить регионы для дальнейшего расследования. Основное внимание уделяется наблюдению за сосудистой системой и кровотоком.
  3. После сохранения нескольких позиций в программном обеспечении просмотрите выбранные поля зрения с помощью возбуждения 890 нм и куба фильтра FAD/SHG. Используйте максимальное время выдержки 4 мкс с более низкой мощностью и высокой настройкой PMT. Цель состоит в том, чтобы просмотреть поля зрения, не подвергая ткань чрезмерному лазерному свету.
  4. После установки соответствующих уровней мощности настройте z-стеки. Наблюдайте за появлением обильных коллагеновых волокон (SHG) на расстоянии 20-50 мкм под стеклянной поверхностью MIW. Коллаген станет менее распространенным, поскольку микроскоп проникает глубже в опухоль (рисунок 1B). Пустоты в ГСП выявляют расположение опухолевых масс.
  5. Установите верхний z-срез, под слоем одиночных клеток, где появляются первые коллагеновые волокна на ~50-100 мкм. Установите нижний z-срез на ~250 мкм, где волокна исчезают и доминирует плохой сигнал. Повторите это для всех сохраненных позиций x-y.
  6. После установки диапазона z-стека увеличьте время выдержки (до 8 мкс) и оптимизируйте мощность и настройки детектора. Оптимизируйте уровни мощности по мере необходимости, чтобы возбудить ткань для каждого эксперимента. Использование мощностей до 90 мВт при 750 нм или 70 мВт при 890 нм на задней апертуре объектива находятся в допустимом диапазоне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина изображения, количество рассеяния в ткани, объективные характеристики и чувствительность детектора будут значительно влиять на количество энергии, необходимой для получения изображения.
  7. Отрегулируйте временные интервалы в соответствии с экспериментальными целями. Начните с 10-минутных интервалов между точками сбора для большинства фильмов о прижизненной миграции.
  8. Несмотря на то, что возбуждение 2P мягко влияет на клетки и ткани, будьте осведомлены о признаках фототоксичности, таких как блеббинг клеток или быстро увеличивающаяся автофлуоресценция и чрезмерное фотоотбеливание. Уменьшите мощность лазера или увеличьте интервалы замедления в зависимости от условий.

5. Флуоресцентная пожизненная визуализация (FLIM) NAD(P)H

  1. Сохраняя позиции x-y от таймлапс-приобретений, настройте микроскоп для сбора стека FLIM. Вставьте фильтр 440/80 в фильтродержатель перед детектором GaAsP и установите напряжение детектора GaAsP на 800 в программном обеспечении. Выключайте свет в комнате, когда детекторы включены.
  2. В программном обеспечении переключитесь с визуализации интенсивности на основе гальванометра в режим изображения FLIM.
  3. Для идентификации и маскировки сосудистой системы установите разрешение 512 x 512 пикселей. Для сбора дополнительной метаболической информации установите разрешение 256 x 256 пикселей, чтобы увеличить временное разрешение пожизненной подписи. Установите время выдержки на 4 мкс и настройте лазер на 750 нм.
  4. Запустите предварительное сканирование и начните регулировать мощность лазера. Отрегулируйте мощность лазера до тех пор, пока показания для постоянного дробного дискриминатора (CFD) не составят от 1 x 105 до 1 x 106. Не превышайте 1 x 106, так как это приведет к накоплению фотонов и плохим общим результатам.
  5. После установки уровня мощности установите время интеграции между 90 с и 120 с и запустите коллекцию FLIM. Он будет получать фотоны из поля зрения за отведенное время.
  6. Необязательно: после того, как все необходимые коллекции были сделаны и мышь была удалена из рабочей области, соберите функцию отклика инструмента (IRF). Измерьте IRF, визуализируя поверхность коммерчески доступных кристаллов мочевины в стеклянной тарелке с теми же параметрами и настройкой, используемой для визуализации ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: IRF учитывает любые задержки или отражения из-за электронной или оптической установки. IRF участвует во всех приобретениях FLIM, и его извлечение из данных может повысить точность расчетных кривых распада флуоресценции. С учетом сказанного, рассчитанные IRF часто могут разумно воспроизводить качество кривых распада флуоресценции из измеренных IRF. Хорошей практикой является измерение IRF до тех пор, пока не будет определено, что рассчитанный IRF даст эквивалентные соответствия кривых распада и адекватно аппроксимирует результаты измеренного IRF.

6. Анализ изображений NADH Lifetime

  1. Откройте программное обеспечение FLIM и импортируйте образ времени жизни NAD(P)H из набора данных. Для получения более подробной информации о том, как правильно использовать программное обеспечение, обратитесь к руководству по сроку службы флуоресцентных ламп (см. Таблицу материалов).
  2. Для начала определите параметры модели в программном обеспечении. В строке меню выберите Параметры > Модель. Установите следующие флажки: Параметры > Многоэкспоненциальный распад», Метод подгонки > MLE, Пространственное биннинг > квадрат, Пороговое > Пик и установите флажок Исправить сдвиг перед вычислением изображения.
  3. В строке меню выберите Цвет > A1% в раскрывающемся меню. В правой части окна определите его как трехкомпонентную подгонку. Установите размер корзины > 3.
  4. Отрегулируйте пороговое значение > ~10. Переоцените пороговую точность после того, как матрица распада была рассчитана в первый раз.
  5. Исправьте τ1 до 200 ps. Это представляет собой короткое время жизни красных кровяных телец. Постарайтесь найти значение, которое наилучшим образом соответствует нескольким пятнам в более крупном кровеносном сосуде, которое можно увидеть на изображении интенсивности. Зафиксируйте τ2 до 1200 ps. Это представляет собой длительное время жизни красных кровяных телец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заданные значения являются только отправной точкой. Значения должны быть оптимизированы, чтобы выявить сосудистую систему больше. В большинстве случаев, но не всегда, эти значения будут уменьшаться.
  6. В разделе Вычислить в строке меню выберите Матрица распада. Это сгенерирует начальные изображения1% времени жизни с сосудистой системой, имеющей высокие значения. Используйте курсор (перекрестие), чтобы навести курсор на сосудистую систему. Систематически и по одному плавайте (снимите флажок Fix ) на τ1 и τ2. Запишите эти значения, так как они помогут оптимизировать фиксированные параметры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит не обязательно в том, чтобы получить наиболее точные значения на изображении, а скорее в том, чтобы максимизировать несоответствие между сосудистой системой и тканью без резкого уменьшения области, идентифицированной как сосудистая система.
  7. После определения соответствующих параметров для τ1 и τ2 в строке меню выберите Рассчитать > пакетной обработки. Убедитесь, что большинство параметров между z-срезами похожи.
  8. Убедитесь, что нет ни одного параметра, сильно отличающегося от других. Если это так, сначала отрегулируйте сдвиг и повторите попытку. Если проблема не устранена, перенастройте ее с помощью новых параметров. Неправильное смещение может быть большой причиной шума при припадках и может увеличить значения А1% в смежных областях опухоли.
  9. На вкладке меню сохраните файлы, а затем экспортируйте файлы A1%. Загрузите эти файлы в ImageJ для маскировки и сегментации.

7. Сегментация изображения сосудистой системы

  1. Откройте ImageJ и импортируйте изображение A1% в виде текстового изображения. Повторите это для всех изображений в стеке.
  2. Открыв все изображения A1%, выберите Стек изображений > > Z-Project. Используйте проекцию максимальной интенсивности и сохраните изображения. Репрезентативное изображение см. в разделе Дополнительные данные 1 .
  3. Перейдите в раздел Плагины > сегментация. Выберите обучаемый плагин сегментации WEKA38.
  4. Как только откроется окно WEKA, используйте настройки по умолчанию и начните обучение программного обеспечения, создав два класса и линии трассировки над сосудистой системой (области с высоким A1%) и не-vasculature (низкиеобласти A 1%).
  5. Продолжайте добавлять новые следы к двум классам до тех пор, пока программное обеспечение не определит области с высоким уровнем А1% сосудистой системы, устраняя при этом любые более высокие области фонового шума. Дополнительная модель для репрезентативной модели классификатора.
  6. После того, как классифицированное изображение будет создано, нажмите на Image > Type > 8 Bit. Порог изображения и создайте маску. Если пороговое изображение все еще нуждается в дальнейшей очистке, используйте функцию Анализ частиц .
  7. Отрегулируйте размер и окружность до тех пор, пока не будут исключены все меньшие и круглые области порогового изображения. Получается чистая маска только с сосудистой системой и очень небольшим фоном.
  8. Нажмите «Редактировать > выбор» > «Создать выбор». Передайте выбор менеджеру ROI, нажав на Analyze > Tools > ROI manager.
  9. Продублируйте классифицированное изображение. Перейдите к разделу Обработка двоичных >. Чтобы развернуть маску и определить расстояние от сосудистой системы, которая будет включена в сегментацию изображения, выберите Расширить. Повторяйте до тех пор, пока маска не расширится до нужного диапазона. Запишите эту интересующую область (ROI) в менеджере ROI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является количественная оценка количества или поведения в пределах определенной близости к кровеносному сосуду (например, количество клеток, присутствующих в пределах X мкм кровеносных сосудов). Величина требуемого расширения полностью определяется научным вопросом.
  10. Чтобы количественно оценить количество ячеек в ограничительных областях, выберите интересующее окно (изображение/канал). Это может быть любое окно, которое разделяет то же поле зрения, что и сосудистая маска. Примените оба ROI с помощью функции XOR из раскрывающегося меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта операция позволит измерить предметы на желаемом расстоянии от сосудистой системы, исключая саму сосудистую систему. Этот комбинированный подход ROI затем может быть использован для измерения множества параметров, таких как интенсивность, количество ячеек или миграция.

8. Сегментация изображения опухолевого гнезда

  1. Откройте изображение NADH из сканирования с высокой интенсивностью разрешения или коллекции FLIM в ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано на отдельных z-срезах, полных стеках или применено к z-проекциям нескольких срезов.
  2. Перейдите в раздел Плагины > сегментация. Выберите обучаемый плагин сегментации WEKA.
  3. Как только откроется окно WEKA, используйте настройки по умолчанию и начните обучать программное обеспечение двум классам областей NADH high и NADH low regions. Области с высоким содержанием NADH будут иметь очень различимый рисунок клеток с ядрами, и программное обеспечение легко идентифицирует его.
  4. Продолжайте переключаться взад и вперед с наложением, чтобы уточнить алгоритм с дополнительной подготовкой, пока он не распознает все области опухоли, определенные глазом и предварительными знаниями морфологии опухоли. Это итеративный процесс.
  5. Как только алгоритм распознает все области опухоли, нажмите кнопку Создать результат . Это создаст новый образ. Продублируйте это изображение.
  6. Выберите первое дублированное изображение и преобразуйте его в 8-битное изображение, выбрав Image > Type > 8 Bit. Пороговое значение этого изображения для создания двоичной маски. Затем создайте выборку и передайте ее менеджеру ROI. Эти ROI будут определять строму.
  7. Выберите второе дублированное изображение и преобразуйте его в 8-битное изображение. Инвертируйте это изображение, выбрав Image > Edit > Invert, а затем пороговое значение этого изображения, чтобы создать двоичную маску. Еще раз создайте выборку и передайте ее менеджеру ROI. Этот ROI будет определять опухолевое гнездо.

9. Сегментация изображения по организации или выравниванию волокон

  1. Для начала откройте изображения SHG, подготовьте любую z-проекцию и оцените необходимость любой предварительной обработки. Для хороших результатов требуются высококачественные изображения с различимыми волокнами и низким уровнем шума.
  2. Дополнительно: для предварительной обработки в ImageJ для увеличения сигнал-шум (SNR) канала SHG вычтите фон с помощью вычитания катящегося шара. Для большинства приложений используйте вычитание скользящего шара между 20 и 50 пикселями. Затем сгладьте изображение и сохраните его.
  3. Откройте плагин OrientationJ и задайте параметры обработки. В окне OrientationJ определите размер локального тензорного окна. Для 20-кратного изображения с такой плотностью волокна установите в качестве отправной точки 10 пикселей значение 15 пикселей.
  4. Выберите кубический сплайн в качестве модели градиента и установите флажок Цветовая съемка. Определите цветовую съемку. Установите оттенки и насыщенность в качестве когерентности, а затем определите яркость как исходное изображение, нажмите Выполнить.
  5. Выходным файлом плагина является цветовая карта RGB. Отрегулируйте значение локального тензорного окна до тех пор, пока выровненные области, определенные глазом, не будут правильно выделены синими и пурпурными оттенками.
  6. Как только выходное изображение будет удовлетворительным, разделите это RGB-изображение на 3 канала. Выберите Изображение > Цвет > Разделенный канал.
  7. Чтобы улучшить внешний вид выровненных областей с целью маскировки, используйте калькулятор изображений, выбрав Обработать > Калькулятор изображений. С помощью этого оператора вычтите зеленое изображение из синего. Для более ограничительной маски вычтите зеленое изображение из красного. Для случайных областей вычтите синий канал из зеленого.
  8. Пороговое значение результирующего изображения с помощью алгоритма Moments . В большинстве случаев это не должно нуждаться в дальнейших корректировках. Однако при необходимости отрегулируйте. Это создаст двоичное изображение.
  9. После создания двоичного изображения заполните отверстия, выбрав Обработать > Двоичные > Заполнить отверстия между волокнами и закруглить границы маски с помощью медианного фильтра. Медианный фильтр 10 является хорошей отправной точкой, отрегулируйте его, чтобы он хорошо соответствовал данным. Вручную проверьте маску на соответствие и удалите все ошибочные ROI.
  10. Как только маска станет удовлетворительной, создайте выделенную область, выбрав «Редактировать > выделение» > «Создать выделение». Передайте этот выбор менеджеру ROI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Установка MIW и базовое экспериментальное планирование являются первыми шагами в этом процессе. Эта конкретная конструкция и протокол MIW более поддаются продольным исследованиям19 и успешно используются как с вертикальными, так и с инвертированными микроскопами. В этом случае был использован перевернутый микроскоп, так как это привело к большей стабильности изображения молочной железы с меньшим количеством дыхательных артефактов. На рисунке 1A мы приводим размеры жесткого MIW и графический обзор процесса имплантации.

Типичное поле зрения в безметочной опухоли молочной железы MMTV-PyMT39 (рисунок 1B-E, рисунок 3A) очень неоднородно, состоит из коллагеновых волокон, многочисленных стромальных клеток, масс опухолевых клеток и сосудистой системы (рисунок 3A). В целом, коллагеновые волокна более обильны вблизи окна и уменьшаются в изобилии глубже в опухоль (рисунок 1B-E) Организация волокон, окружающих опухолевые массы, также может быть довольно разнообразной, часто с областями более случайной организации в том же поле зрения, что и области более высокого выравнивания (рисунок 2D, H и рисунок 3I).

Чтобы разработать конвейер анализа, который может сегментировать прижизненные данные на периваскулярные области, опухоль и строму, этот протокол был сосредоточен на использовании сигнала от эндогенных NAD(P)H и SHG. В то время как идентификация опухоли и стромы может быть простой, идентификация периваскулярных областей в микроокружении опухоли может быть сложной задачей. Сосудистая система часто находится в узких лентах восстановленного сигнала NAD(P)H между яркими массами раковых клеток NAD(P)H+. Важно отметить, что не все темные границы таят в себе сосудистую систему; скорее, некоторые темные области представляют собой просто опухолевые складки или стыковку соседних опухолевых долей (желтая стрелка, рисунок 2G). Более того, в то время как опытный глаз может извлечь кровеносные сосуды большего диаметра из опухоли, поскольку они имеют отличительный внешний вид, это различие не всегда тривиально. Это особенно верно для сосудов меньшего диаметра, где их внешний вид может быть более тонким и изменчивым. В этом случае использование срока службы флуоресценции NAD(P)H может помочь в положительной идентификации сосудистой системы (рисунок 2B, F). Время жизни флуоресценции (FLIM) измеряет не обилие или интенсивность фотонов в определенном месте, а время, необходимое этим возбужденным молекулам, чтобы испускать фотон и распадаться до их основного состояния. Было показано, что эритроциты (эритроциты) и плазма крови имеют характерно короткое и характерное время флуоресценции 32,37, которое может быть использовано для идентификации и сегментации сосудов в тканях.

Чтобы определить, насколько хорошо время жизни флуоресценции NAD(P)H идентифицирует сосудистую прижизненно, болюс 100 мкл декстрана, меченого родамином, был введен в хвостовую вену после сбора изображения FLIM. Сравнения проекций максимальной интенсивности NAD(P)H FLIM близко отражают те сосуды, которые помечены флуоресцентно меченым декстраном (рисунок 2I-J). Повторение этого подхода на нескольких мышах показало, что средняя площадь маски из изображения FLIM над площадью маски декстрана составляла 78,6% ± 12,3% (рисунок 2l). Хотя наложение не было 100%, этот метод точно отображал всю сосудистую сеть. Различия, наблюдаемые в указанных районах, часто могут быть связаны с проблемами прижизненного дрейфа или регистрации, более тонким диаметром сосудов из-за подгонки модели или потерей тонких сосудов из-за исключения RBC давлением растущей массы. Важно отметить, что этот метод одинаково хорошо работает в присутствии как генетически закодированных флуорофоров, таких как GFP, так и моделей опухолей без меток (рисунок 2D, H), тем самым обеспечивая очень надежные и широко применимые средства идентификации сосудистой системы для сегментации изображения.

Для очерчивания границ безметочных опухолевых масс использовали автофлуоресценцию NAD(P)H (рисунок 1С). Это может быть получено путем независимого сбора изображения NAD(P)H или суммирования данных NAD(P)H FLIM для создания изображения интенсивности. Любой из этих путей позволит провести подходящую сегментацию микроокружения опухоли. В качестве общего наблюдения, двухфотонное возбуждение NAD(P)H в раковых клетках вызывает яркую автофлуоресценцию, производя изображение, которое показывает четкие отдельные клетки с затемненными ядрами (рисунок 2E, G). Эта закономерность может быть использована для определения протяженности растущей массы. В то время как простое пороговое значение NAD(P)H на основе интенсивности можно определить границу опухолевого отсека, обучаемый инструмент сегментации часто работает лучше (рисунок 3B, E). Некоторые другие распространенные показания, такие как миграция клеток или клеточный протрузивный анализ, могут извлечь выгоду из генетически закодированной экзогенной флуоресценции в мышиной модели или имплантации флуоресцентно меченых клеточных линий (рисунок 2A). В этих случаях задача демаркации границы массы может быть выполнена с помощью простого порогового значения флуоресцентного белка. Иногда экспрессия флуорофора может стать довольно неоднородной после имплантации. Это не должно вызывать проблем с сегментацией. Кроме того, часто наблюдалось, что опухоли, созданные флуоресцентными аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами, имеют менее разделенные области коллагеновых волокон, чем опухоли, созданные генетическими моделями опухолей, такими как MMTV-PyMT16.

Стромальный компартмент охватывает области за пределами растущей массы или между растущими массами, а маску для стромы получают путем инвертирования ROI опухоли (рисунок 3B-F). Затем стромальный компартмент может быть дополнительно разделен на суб-ROI на основе архитектуры коллагенового волокна. Коллагеновые волокна являются важной особенностью в строме и имеют большое разнообразие волоконных организаций, которые, как известно, модулируют поведение клеток40,41. Часто многочисленные локальные (<100 мкм) области выровненных или случайных волокон существуют в изображении16. Поэтому области относительно выровненной (красные/синие оттенки) или случайной (зеленые оттенки) волоконной организации (рисунок 3I) были идентифицированы с помощью плагина OrientationJ. С помощью цветовой карты когерентности OrientationJ можно создавать маски на основе локальной волоконной организации для целей сегментации (рисунок 3J). Затем эти маски могут быть наложены для анализа дифференциального динамического поведения стромальных клеток (рисунок 3K) из-за эффектов специфической организации волокон (рисунок 3H, I).

Теперь, когда ROI для различных компартментов микроокружения опухоли определены, они могут быть применены к отдельным кадрам или каналам прижизненного таймлапс-фильма. На этом этапе важно подчеркнуть, что все сигналы, показанные на рисунке 3А, полностью получены из эндогенных источников. Это изображение демонстрирует богатый потенциал пространственных и контекстуальных сигналов, которые могут исходить из чисто эндогенных, вездесущих и свободных от меток источников. Здесь мы использовали модель опухоли MMTV-PyMT в качестве примера, чтобы проиллюстрировать применимость метода количественной оценки количества и характеристик макрофагов в определенных местах микроокружения опухоли (TME). Предыдущее прижизненное исследование42 показало, что клетки, испускающие высокие уровни аутофлуоресценции FAD (рисунок 3A, пурпурные клетки, желтые стрелки), положительно окрашиваются антителами F4/80 и представляют собой популяцию макрофагов в TME. Используя этот рабочий процесс для сегментации изображения, можно эффективно и точно исследовать число, отслеживать взаимодействия клетки с клетками с течением времени или даже наблюдать метаболические характеристики этого подмножества макрофагов (пурпурный) в разных компартментах TME (рисунок 3A, желтые стрелки). Например, можно охарактеризовать поведение макрофагов с высоким содержанием FAD, которые конкретно находятся в опухолевом гнезде NAD(P)H-high (рисунок 3E). Аналогично можно исследовать поведение макрофагов по отношению к локальной организации волокон в области стромы. Некоторые недавние отчеты показали, что макрофаги и другие мигрирующие клетки в строме реагируют на механические сигналы из их местного микроокружения 16,43,44. Используя маски выравнивания волокон, полученные этим методом, можно исследовать их дифференциальное поведение между областями случайных и выровненных коллагеновых организаций. Наконец, этот же сфокусированный анализ может быть также применен для определения количества и поведения макрофагов, локализованных в пределах определенной близости к сосудистой системе. На рисунке 3G сосудистую систему можно увидеть красным цветом, а макрофаги снова можно увидеть в пурпурном цвете. Была создана маска для сосудистой системы с использованием NAD(P)H FLIM, а затем расширена за счет расширения на 10 пикселей. Выбранное расстояние было произвольным для демонстрационных целей, но может быть оптимизировано для конкретных потребностей отдельного эксперимента. Важно отметить, что, хотя это изображение представляет собой один z-срез, эту процедуру можно легко экстраполировать на 3D-стеки, чтобы наблюдать за поведением вокруг всего объема сосуда.

Figure 1
Рисунок 1: Графическая аннотация имплантации окна молочной железы и основная организация опухоли MMTV-PyMT. (A) Размеры окна визуализации молочной железы и схема для общего процесса имплантации. (Б-Е) Это монтаж от немаркированного представителя опухоли MMTV-PyMT, начиная с 50 мкм под поверхностью MIW и продолжая до глубины 80 мкм. Значения глубины указаны под каждым изображением. Коллагеновые волокна (серый) более распространены на поверхности опухоли (NAD(P)H, синий), чем на больших глубинах. Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативное прижизненное изображение опухоли PyMT, меченной GFP и не содержащей меток, и валидация NAD(P)H FLIM в качестве маркера сосудистой системы. Составное изображение (A) типичного аллотрансплантата клеток GFP-4T1 в жировую прокладку молочной железы и репрезентативную опухоль молочной железы из модели опухоли MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM отображает сосудистую систему в обеих моделях (B,F). Флуоресценция GFP (C) и автофлуоресценция NAD(P)H (G) использовались для идентификации опухоли. Коллаген был визуализирован SHG (D,H). Составное изображение с использованием NAD(P)H FLIM для идентификации сосудистой системы было проверено путем сравнения проекций максимальной интенсивности прижизненного стека до и после инъекции флуоресцентного декстрана (I,J,K) в хвостовую вену. Количественная оценка соотношения площади, определяемой NAD(P)H FLIM, над областью, идентифицированной инъекцией декстрана у четырех мышей (цвет идентифицирует отдельных мышей) и несколькими полями зрения (отдельные точки на графике), показана в (L). Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативная сегментация изображения с использованием эндогенной флуоресценции в опухоли PyMT без меток. Составное изображение (A) одного z-среза из типичной опухоли молочной железы PyMT было собрано с использованием только внутренних сигналов. SHG (серый) визуализирует коллагеновые волокна опухоли. Флуоресцентная пожизненная визуализация автофлуоресценции NAD(P)H (среднее значение Tau (τ)) сообщает метаболические сигнатуры клеток (от зеленого до оранжевого оттенков) и расположение кровеносных сосудов (красный). Автофлуоресценция FAD (пурпурная) идентифицирует макрофаги. Используя схему сегментации, описанную в этом протоколе, опухоль без метки сегментировали на компартменты для опухолевого гнезда (B,E), стромы (C,F) и сосудистой системы (D,G) с использованием только автофлуоресценции SHG и NAD(P)H. Волокна стромы и коллагена (H) также могут быть классифицированы на локальные области выровненных волокон ((показаны пурпурным / синим), J, K). Шкала 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные данные 1: Репрезентативный набор данных A1% от NAD(P)H FLIM. Это проекция максимальной интенсивности установленного A1% от типичного набора данных. Он является представителем качества идентификации и типичного уровня фона перед использованием обучаемого классификатора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная модель: Репрезентативный классификатор, используемый на установленном A1% для идентификации сосудистой системы. Это пример модели классификатора для использования в обучаемом плагине сегментации WEKA в ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D-прижизненная визуализация является мощным инструментом для исследования динамических физиологических взаимодействий в пространственном и временном контексте микроокружения нативной опухоли. Эта рукопись обеспечивает очень простую и адаптируемую операционную структуру для разделения динамических клеточных взаимодействий в опухолевой массе, соседней строме или в непосредственной близости от сосудистой сети, используя только эндогенные сигналы от генерации второй гармоники или автофлуоресценции NAD(P)H. Этот протокол обеспечивает комплексный, пошаговый метод от имплантации окна визуализации до получения, анализа и сегментации изображения. Мы считаем, что этот метод будет способствовать созданию необходимой аналитической структуры для сегментации и количественной оценки 4D-прижизненных данных.

Этот протокол был разработан для широкой совместимости с многочисленными моделями прижизненных мышей, включая немаркированные модели PDX. PDX являются невероятно информативной моделью45, но представляют собой проблему для прижизненной визуализации, потому что природа модели PDX не очень хорошо подходит для генетических манипуляций. Поэтому было бы весьма выгодно иметь метод, который может визуализировать и разделять динамические взаимодействия в их немаркированной физиологической среде, используя исключительно эндогенные метаболиты, такие как NAD(P)H и генерация второй гармоники (SHG). В дополнение к тому, что этот многомерный подход является выгодным для моделей PDX, он теоретически может быть применен к любому прижизненному исследованию в раковой или нормальной ткани, которое нуждается в пространственном и структурном контексте для решения физиологического вопроса. Автофлуоресценция NAD(P)H и SHG из коллагеновых волокон повсеместно распространены во всех тканях и представляют собой универсальный и бесплатный ресурс в прижизненных коллекциях. Этот подход FLIM также надежен, поскольку он может идентифицировать сосудистую систему в присутствии флуоресценции из экзогенных источников, таких как GFP. Этот подход также выгоден, поскольку излучение SHG и NAD(P)H может быть визуализировано в синем спектре, тем самым находясь в длине волны, которая обычно не используется при визуализации флуоресцентных конструкций синтеза, которые в противном случае могут потребоваться для исследования.

Аспект этого подхода, который является новым и имеет особую добавленную стоимость, - это идентификация сосудистой системы без маркировки. В то время как другие подходы могут работать, использование срока службы флуоресценции NAD(P)H легко обеспечивает четкую сигнатуру без необходимости дополнительной маркировки. Данные показывают, что сосуды, определенные в течение жизни, отражают сосудистую систему, помеченную от инъекции флуоресцентного декстрана в хвостовую вену, золотой стандарт для визуализации сосудов. Наша техника преуспевает в визуализации меньших кровеносных сосудов по сравнению с простым двухфотонным или трехфотонным возбуждением, где более крупные сосуды легко визуализируются, но более мелкие требуют большего опыта для идентификации. Пожизненная подпись однозначна для всех судов, независимо от размера. Кроме того, это дополнительное приобретение NAD(P)H FLIM может быть легко объединено с другими маркерами сегментации микроокружения опухоли. Благодаря одному приобретению FLIM NAD(P)H, требования к определению сосудистой системы, опухолевого гнезда и стромы достижимы. Коллекция FLIM может быть включена в существующий экспериментальный дизайн путем сбора одного приобретения в конце или начале временного ряда или чередования коллекций на протяжении всего 4D-приобретения. Определение соответствующего количества изображений FLIM будет зависеть от конкретных экспериментальных потребностей и ограничений, таких как интервалы сбора, экспериментальная продолжительность или стабильность изображения, но, как минимум, для этого метода потребуется одна коллекция FLIM на серию 4D.

Этот процесс использования NAD(P)H FLIM для идентификации сосудистой системы требует математической подгонки данных FLIM к экспоненциальной функции формы

Equation 1

с A1+A2+A3=1. В то время как большинство изображений NAD(P)H, о которых сообщается в литературе, подходят как биэкспоненциальные, в этом приложении NAD(P)H был установлен как триэкспоненциальный, где τ1 и τ2 установлены на сообщаемые значения RBC, а τ3 разрешено плавать. Важно отметить, что цель состоит не в том, чтобы достичь наиболее точного значения срока службы, а в том, чтобы обеспечить оптимальное изображение для сегментации. Когда значения τ1 и τ2 первоначально зафиксированы на зарегистрированных значенияхRBC 32,46 и матрица рассчитана, кровеносные сосуды будут выделяться значениями A 1%, превышающими 60% в кровеносных сосудах и значениями A1%, как правило, менее 40% в соседней опухоли. Следующим шагом является попытка максимизировать A1% в кровеносных сосудах при минимизации A1% в соседней опухоли. Это итеративный процесс, и к концу его значения А1% кровеносных сосудов будут больше 90%, а значения А1% опухоли менее 10%. Как только значения A1% кровеносных сосудов станут равномерно высокими, а фон равномерно низким, экспортируйте эти файлы A1% в обучаемый инструмент сегментации. Это быстро удалит все оставшиеся шумы и определит рентабельность инвестиций для сосудистой системы.

Поскольку жировая подушка молочной железы расположена вне полости тела, операция является минимально инвазивной, и наилучшие результаты получаются при имплантации MIW над4-й паховой молочной железой. Сроки имплантации окна и время проведения эксперимента имеют решающее значение. Лучше всего предусмотреть 24 - 48 ч заживления после операции до физиологической временной точки, которая будет исследована. В то время как сама процедура требует только небольшого разреза (≈ 10 мм) для вставки окна (рисунок 1A), послеоперационное время заживления позволит очистить любое воспаление и жидкости, которые накопились в результате процесса имплантации. Более того, это также позволит опухоли продолжать расти в окно. Оба фактора улучшат общее качество изображения за счет уменьшения непрозрачности/рассеяния и повышения стабильности изображения. Следующее, что следует учитывать, это запланированная общая продолжительность эксперимента. Хотя эти окна были разработаны для продольных исследований, жесткий характер окна требует ограничения по времени от 2 до 3 недель. После этого промежутка времени окно имеет тенденцию выбиваться из кожного слоя, тем самым загрязняя и завершая эксперимент. Если продольное исследование молочной железы не требуется, другие прижизненные методы, такие как терминальная процедура22 , которая устраняет хирургическую имплантацию MIW, могут быть лучшим вариантом. Процедура кожного лоскута обеспечивает лучший доступ ко всей железе, поскольку она не ограничена размещением и размерами MIW, и она может обеспечить большую стабильность изображения, поскольку железа оттягивается от полости тела. Независимо от подхода к прижизненной визуализации, сегментация микросреды с использованием эндогенной флуоресценции по-прежнему широко применима для последующего анализа изображений. Последнее, что нужно учитывать, это продолжительность индивидуального эксперимента по визуализации. Небезосновательно приобретать фильмы продолжительностью 6-8 ч. Однако во время более длительных сборов гидратация становится проблемой, и требуется тщательный мониторинг состояния здоровья мыши.

Одним из существенных преимуществ данного метода является то, что различные изображения эндогенной флуоресценции, необходимые для сегментации микроокружения опухоли, могут быть собраны с относительной легкостью и без дополнительных манипуляций с мышью. С помощью комбинации фильтр/дихроик, описанной здесь (Таблица материалов), изображения SHG и NADH могут быть получены с помощью одного и того же фильтра, установленного путем переключения длин волн от 890 нм до 750 нм. Хотя это создает задержку получения, это не влияет на последующую сегментацию изображения. Также важно помнить, что этот метод представляет собой простую отправную точку для метода сегментации с использованием эндогенной флуоресценции, и более продвинутые оптические конфигурации могут допускать одновременные приобретения, если это необходимо.

Существуют ограничения использования FLIM для идентификации сосудистой системы. Подход FLIM требует специализированной электроники, приборов и опыта для сбора. Однако все эти требования все больше интегрируются в современные микроскопы и становятся все более доступными благодаря использованию основных средств визуализации. FLIM стала зрелой технологией, и получение хороших данных не требует большой подготовки. Второе ограничение заключается в том, что приобретения FLIM отнимают много времени. В то время как частота кадров для изображения, собранного с помощью флуоресцентного декстрана, составляет около секунды или меньше, средняя коллекция FLIM может варьироваться от 60 с до 120 с, что может быть непомерно высоким, если физиологические временные точки короче. FLIM идентификация сосудистой системы не предназначена для замены всей хвостовой вены вводимого флуоресцентного декстрана или многофотонного возбуждения сосудистой системы; скорее, это еще один подход в растущем наборе инструментов для прижизненной визуализации. Кроме того, мы ожидаем, что в ближайшие годы более длительные сроки приобретения будут значительно сокращены. Детекторы и электроника быстро совершенствуются, уменьшая мертвое время детектора и, таким образом, требуя более коротких периодов сбора для захвата того же количества фотонов. Еще одной причиной для оптимизма в отношении более короткого времени получения является появление программного обеспечения машинного обучения или алгоритма восстановления изображений, такого как CSBDeep47. Эти алгоритмы потенциально могут быть обучены работе с более коротким временем экспозиции, тем самым уменьшая количество фотонов, необходимых для точной идентификации структур для целей сегментации. В совокупности это может быстро сократить сроки, необходимые для этих многомерных приобретений.

Использование прижизненной визуализации станет только более важным, поскольку исследователи пытаются разгадать многие сложные взаимодействия клетка-клетка и клеточная матрица, которые происходят в физиологической микроокружении опухоли. Поэтому необходимы дальнейшие разработки в области приобретения, сегментации и анализа. С этой целью важно не упускать из виду потенциал эндогенной флуоресценции для сегментации микросреды. В этом протоколе эндогенный сигнал от SHG и флуоресцентных метаболитов, включая интенсивность NAD(P)H и FLIM, использовался для целей сегментации во время прижизненной визуализации ТМЭ молочной железы. Другие эндогенные метаболиты или внутренние свойства могут предоставлять дополнительные сигналы для выявления динамической взаимности опухолевых клеток и микросреды. Например, FAD может быть использован для мониторинга движения иммунных популяций42, генерация 3P может выделять структурные особенности, такие как плазматические мембраны или жировая кислота36, а флуоресценция эластина может быть использована для отделения артерий от вен46. Таким образом, эндогенная флуоресценция будет по-прежнему обеспечивать богатую многомерную платформу, которая должна использоваться в полной мере, поскольку исследовательское сообщество продолжает создавать набор инструментов для сегментации и анализа прижизненной микросреды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить гранты NCI R01 CA216248, CA206458 и CA179556 для финансирования этой работы. Мы также хотели бы поблагодарить доктора Кевина Элисейри и его группу визуализации за их технический опыт в ранней разработке нашей прижизненной программы. Мы также благодарим д-ра Бена Кокса и других членов Eliceiri Fabrication Group в Научно-исследовательском институте Моргриджа за их важный технический дизайн на ранних этапах MIW. Д-р Эллен Добсон помогла провести полезные беседы об обучаемом инструменте сегментации WEKA ImageJ. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить доктора Мелиссу Скалу и доктора Алексу Баррес-Хитон за своевременное использование их микроскопа. Наконец, мы хотели бы поблагодарить д-ра Брижит Раабе, D.V.M., за все вдумчивые обсуждения и советы по обращению с нашими мышами и уходу за ними.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

Исследование рака выпуск 183
Подход к сегментации без меток для прижизненной визуализации микроокружения опухоли молочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter