Summary
本文描述的活体成像方法利用来自代谢辅助因子NAD（P）H的胶原二次谐波和内源性荧光，将未标记的肿瘤微环境非侵入性地分割成肿瘤，基质和血管室，以深入分析4D活体内图像。
Abstract
可视化活肿瘤微环境中多种细胞类型与细胞外基质（ECM）之间复杂和动态生理相互作用的能力是了解调节肿瘤进展机制的重要一步。虽然这可以通过当前的活体成像技术来实现，但由于组织的异质性以及实验观察中对空间背景的需求，它仍然具有挑战性。为此，我们开发了一种活体内成像工作流程，将胶原蛋白二次谐波生成成像，来自代谢共因子NAD（P）H的内源性荧光和荧光寿命成像显微镜（FLIM）配对，作为将肿瘤微环境非侵入性地划分为肿瘤巢，周围基质或ECM以及脉管系统的基本结构域的手段。这种非侵入性方案详细介绍了从采集乳腺肿瘤模型的延时图像到后处理分析和图像分割的分步过程。该工作流程的主要优点是，它利用代谢特征来将动态变化的活肿瘤微环境置于情境中，而无需使用外源性荧光标记，这使其有利于人类患者来源的异种移植物（PDX）模型和未来的临床使用，其中外在荧光团不易适用。
Introduction
已知肿瘤微环境中的细胞外基质（ECM）被多种细胞类型动态沉积和重塑，以进一步促进疾病进展1，2，3。这些基质改变提供了改变细胞行为的机械和生物学线索，并且通常导致基质重塑的持续循环4。对肿瘤细胞和细胞外基质之间动态，相互相互作用的研究通常使用三维（3D）体外培养或微流体系统进行。虽然这些自下而上的方法已经证明了ECM重塑5，6，7，增殖增加8，上皮到间充质转变9，10，11，12以及肿瘤细胞迁移和侵袭的机制7，13，14，15，16，他们的重点主要集中在均匀的3D基质中的几种细胞类型（例如，肿瘤细胞或成纤维细胞）上，与生理组织内存在的相互作用的多样性和异质性相比。除了体外系统外，离体肿瘤组织学还可以提供一些关于这些细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的见解17。免疫组织化学的优点是能够分析与ECM的空间异质组成和结构相关的多种细胞类型，但是固定组织的静态终点不能捕获细胞与微环境之间相互作用的动态性质。活体成像为在原生肿瘤微环境的生理环境中询问各种动态相互作用打开了大门。
活体肿瘤成像的能力正在迅速提高。影像学窗口设计的改进和植入视窗的手术技术使得在各种解剖位置（即原发性肿瘤，淋巴结，转移部位18，19，20）进行长期纵向肿瘤成像。此外，光学仪器在多个维度（即光谱、空间荧光强度和寿命）以及高分辨率和高速（视频速率）下可视化和收集数据的能力正在变得广泛应用。改进的技术为探索生理环境中细胞信号传导和表型动力学的快速变化提供了机会。最后，光遗传学工具的扩增和广泛的遗传荧光构建体允许标记特定细胞类型以捕获肿瘤微环境中的细胞迁移或发育或疾病进展期间的细胞谱系示踪21，22。将这些工具与CRISPR / Cas9技术结合使用，为研究人员提供了及时生成独特动物模型的机会。
虽然所有这些进展使活体成像成为探索动态和生理细胞相互作用的日益强大的方法，但仍然需要制定在组织水平上为这些生物相互作用提供空间，时间和结构背景的策略。目前，许多活体成像研究通过将荧光染料注射到脉管系统中或采用外源性表达荧光蛋白以描绘物理特征的小鼠模型来弥补视觉特征（例如血管）的缺乏。可注射染料和底物如荧光葡聚糖被广泛用于成功标记活体内的脉管系统19， 23， 24。但是，这种方法并非没有限制。首先，它需要额外的鼠标操作，其效用仅限于短期实验。对于纵向研究，荧光葡聚糖可能会有问题，因为我们观察到葡聚糖在吞噬细胞中的积累或随着时间的推移扩散到周围组织中25。外源性荧光蛋白掺入小鼠模型已被提出为荧光葡聚糖的替代品，但存在其自身的局限性。小鼠模型中外源性荧光团的可用性和多样性仍然有限且创建成本高昂。此外，在特定的模型中，例如PDX模型，遗传操作是不可取的或不可能的。还已经表明，细胞内荧光或生物发光蛋白的存在被识别为小鼠内的外来物，并且在免疫功能正常的小鼠模型中，这减少了由于宿主免疫系统的反应而引起的转移量26，27。最后，用于空间背景或分割后续数据的外源荧光蛋白或荧光染料通常占据光谱的素数范围，否则可用于研究感兴趣的生理相互作用。
使用来自ECM的内在信号或来自组织内细胞的内源性荧光代表了一种潜在的通用无标记方法，用于分割活体内数据以进行更深入的细胞和空间分析。二次谐波产生（SHG）长期以来一直用于可视化ECM28。随着随后开发有助于表征纤维组织29，30，31的重要工具，可以表征相对于局部ECM结构的细胞行为。此外，来自内源性代谢物NAD（P）H的自发荧光提供了另一种无标记的工具，用于划分 体内肿瘤微环境。NAD（P）H在肿瘤细胞中发出明亮的荧光，可用于区分生长中的肿瘤巢的边界与其周围的基质21，32。最后，脉管系统是肿瘤微环境中的重要生理结构，也是关键细胞类型特异性相互作用的位点33，34，35。红细胞（RBC）或血浆的激发已被用于可视化肿瘤脉管系统，并且使用双光子或三光子激发（2P; 3P）的血流速率的测量已被证明是可能的36。然而，虽然较大的血管很容易通过其内源性荧光特征来识别，但识别细微的，可变的和荧光较少的小血管需要更多的专业知识。这些固有的困难阻碍了最佳图像分割。幸运的是，这些内源性荧光源（即红细胞和血浆）也可以通过荧光寿命成像37来测量，其利用了脉管系统独特的光物理特性，并代表了对不断增长的活体内工具箱的有益补充。
在该协议中，描述了从采集到分析的四维（4D）活体内成像的工作流程，明确使用内源性荧光和SHG等内在信号进行分割。该协议对于通过乳腺成像窗口进行的纵向研究特别相关，其中外源性荧光可能不实用或不可能，就像PDX模型一样。然而，这里概述的分割原理广泛适用于研究肿瘤生物学，组织发育甚至正常组织生理学的活体内用户。所报告的分析方法套件将允许用户区分排列或随机胶原纤维配置区域之间的细胞行为，比较驻留在肿瘤微环境特定区域的细胞的数量或行为，并仅使用无标记或内在信号将脉管系统映射到肿瘤微环境。这些方法共同创建了一个操作框架，用于最大化从乳腺4D活体内成像中获得的信息深度，同时最大限度地减少对其他外源性标记的需求。
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Protocol
所描述的所有实验都得到了威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会的批准。所有动物实验中的福祉和疼痛管理都至关重要。因此，尽一切努力确保动物在手术的每一步都感到舒适和照顾。
1. 乳腺成像窗口 （MIW） 的生成
- 要构建乳腺成像窗口，请用手术级不锈钢制造14毫米的环。
- 使用5%清洁剂的热溶液清洁机加工的窗框，在流动的去离子水（DI）下冲洗10分钟，在100%乙醇中浸泡10分钟，然后在加热灯下干燥。高压灭菌干燥的MIW框架并储存以备后用。
- 准备MIW盖板玻璃如下：将#1.5 12 mm圆形盖板玻璃浸泡在100%乙醇中10分钟，在加热灯下干燥，然后使用氰基丙烯酸酯粘合剂固定在金属MIW框架上。在一夜之间固化粘合剂。
- 使用丙酮浸泡的拭子清洁组装的过量粘合剂的MIW，并通过将其浸没在70%乙醇中10分钟进行清洁。让清洁的窗户干燥。提前准备MIW，并在手术植入前将其储存在无菌培养皿中。
2. 手术植入 MIW
- 在开始手术之前，高压灭菌手术工具并用70%乙醇消毒表面。
- 使用覆盖着无菌区域的保暖毯在经过消毒的桌面上进行手术。设置加热毯，使得在无菌场顶部测量的温度为40°C。
- 使用辅助冷照明，以帮助防止纸巾干燥。使用放大镜来方便外科手术。按照外科最佳实践的建议，穿戴由无菌一次性实验室外套、手术套、手套、护目镜和口罩组成的PPE。
- 使用麻醉汽化机麻醉小鼠，异氟醚设置为2.0%，氧气流速为2.0 L / min。通过皮下注射给予镇痛药（10mg / kg美洛昔康）。
注意：在前24小时内提供额外的剂量，最好在手术后的前2天每8-12小时一次。 - 一旦麻醉（确认对脚趾捏没有反应），涂抹保湿眼部凝胶以防止眼睛干燥。使用脱毛膏去除手术部位（第4个 腹股沟乳腺）的皮毛，然后用无菌水浸泡的纱布冲洗。
- 通过用3个交替的betadine和乙醇磨砂膏消毒皮肤表面来准备脱毛的手术部位进行手术。
- 要开始手术，使用镊子轻轻地将皮肤抬起到第4个乳腺4号上。一旦皮肤从体壁上拉开，用手术微剪刀去除镊子尖端的约1毫米真皮层部分。如果发生出血，用无菌纱布轻轻按压，直到出血停止。
注意：一般来说，较大的肿瘤比较小的肿瘤或正常组织具有更大的出血潜力。 - 在手术开口处轻轻移动镊子，将乳腺从真皮层中分离出来，以避免切割下面的腺体。
- 创建一个10毫米的切口，并将乳腺从外围的真皮层中释放出来，以便可以在不穿透乳腺的情况下放置缝合线。添加PBS以覆盖暴露的腺体/肿瘤并防止干燥。
- 使用5-0丝编织缝线沿开口的外围创建钱包线缝合线。插入MIW的边缘，以便真皮层啮合到MIW的接收凹口中。
- 轻轻拉伸MIW另一侧的上皮，并将金属MIW推入到位，使真皮层完全啮合整个MIW圆周周围的接收凹口。紧紧抓住钱包绳子，将真皮层拉入缺口，然后将其绑起来以完全固定MIW。
- 在MIW的真皮层中加入局部抗生素，并持续监测小鼠，直到它恢复足够的意识以维持胸骨斜倚。将MIW植入的小鼠单独放在柔软的床上用品上，将冰屋放置在笼子中，并允许小鼠在成像前恢复48小时。
3.在显微镜载物台上定位和维护小鼠进行成像
- 在显微镜载物台上设置加热室。使用设置为30°C的强制通风系统或任何其他类似系统。使用物镜加热器以避免z轴焦点漂移。在成像前让系统达到平衡至少1小时。
注意：麻醉小鼠无法正确维持体温，因此，有必要为任何延时采集提供加热环境 。物镜加热器有助于对抗热膨胀的影响，这种现象会导致z焦点漂移，因为物镜和成像的组织达到热平衡。 - 一旦显微镜上的加热室稳定在30°C，用麻醉机设置2%异氟醚和2 L / min的氧气流速麻醉受体小鼠。
- 小鼠镇静后（通过对脚趾捏合无反应确认），用棉质涂抹器和玻璃清洁剂清洁MIW玻璃的外部，添加眼药膏以防止干燥，并在必要时插入尾静脉导管。
- 为了保持适当的水合作用，首次皮下注射 0.5 mL PBS 或通过尾静脉导管注射 100 μL。在成像过程中每2小时重复一次。
- 一旦小鼠准备好了，设置显微镜进行成像。为了减少延时测量过程中的蒸发，使用水基凝胶代替水浸渍介质。这应该在将鼠标放在舞台上之前完成。有关光学元件的详细信息，请参阅材料表。
- 将鼠标放在显微镜载物台上，安装异氟醚软管并将MIW的环压入载物台插件中的14 mm接收孔中以稳定图像。使用显微镜目镜聚焦成像场，并使用明场照明观察血流脉管系统。
- 检查视野的稳定性。如果存在呼吸运动伪影，请用小泡沫块和类似铍子的胶带轻轻按压压腺的背面。施加按压后，验证整个视野中的血流是否保持。
- 在成像过程中以0.25%的增量定期调整异氟醚水平，通过手动计数动物呼吸来维持适当的镇静水平。
- 保持每分钟36-40次呼吸（rpm）的速率，以提高动物寿命和光学成像。较低的呼吸速率可能导致小鼠无法在实验中存活，而超过60 rpm的呼吸速率可能导致镇静不良，这会增加图像数据中的呼吸和运动伪影。
4. 设置动态细胞行为的 4D、基于强度、无标记的活体成像
- 一旦小鼠被镇静并牢固地定位在倒置的显微镜载物台上，开始定位感兴趣的区域。
- 使用指向MIW的光源，使用显微镜的目镜来确定潜在的研究区域。在软件中添加并保存 x， y 位置以返回到这些位置。
注意：这种类型的照明不会轻易看到肿瘤的精细细节。目标只是确定需要进一步调查的区域。重点是观察脉管系统和血液流动。 - 在软件中保存多个位置后，使用890 nm激发和FAD/SHG滤光片立方体预览所选视野。使用4 μs的最大停留时间，具有更低的功率和高PMT设置。目标是预览视野，而不会将组织过度暴露在过多的激光下。
- 设置适当的功率级别后，设置 z 堆栈。观察MIW玻璃表面下方20-50μm处丰富的胶原纤维（SHG）的外观。随着显微镜进入肿瘤深处，胶原蛋白将变得不那么普遍（图1B）。SHG中的空隙揭示了肿瘤肿块的位置。
- 设置顶部的z切片，在孤独的细胞层下方，其中第一个胶原纤维出现在〜50-100μm处。将底部z切片设置为~250μm，其中纤维淡出并且信号较差占主导地位。对所有保存的 x-y 位置重复此操作。
- 设置 z 轴堆栈范围后，增加停留时间（最多 8 μs）并优化功率和检波器设置。根据需要优化功率水平，以激发每个实验的组织。在物镜后孔径下使用高达90 mW的功率，在750 nm处使用高达70 mW的功率在890 nm处，在可接受的范围内。
注意：成像深度、组织内的散射量、物镜特性和检测器灵敏度都将显著影响获得图像所需的功率。 - 根据实验目标调整时间间隔。从大多数活体内迁移影片的收集点之间 10 分钟的间隔开始。
- 尽管2P激发对细胞和组织温和，但要注意光毒性的迹象，如细胞漂白或快速增加的自身荧光，以及过度的光漂白。根据条件指示降低激光功率或增加延时间隔。
5. NAD（P）H的荧光寿命成像（FLIM）
- 在保留延时拍摄采集中的 x-y 位置的同时，设置显微镜以收集 FLIM 堆栈。将440/80滤波器插入GaAsP检测器前面的滤波器支架中，并在软件中将GaAsP检测器电压设置为800。当探测器打开时，关闭房间灯。
- 在软件中，从基于振镜的强度成像切换到FLIM成像模式。
- 为了识别和遮罩脉管系统，请将分辨率设置为512 x 512像素。要收集互补代谢信息，请将分辨率设置为 256 x 256 像素，以提高终生特征的时间分辨率。将停留时间设置为4 μs，并将激光器调谐至750 nm。
- 开始预览扫描并开始调整激光功率。调整激光功率，直到恒定分数鉴别器（CFD）的读数在1 x 105 和1 x 106之间。不要超过1 x 106 ，因为这会导致光子堆积和整体结果不佳。
- 设置功率水平后，将积分时间设置在90 s和120 s之间，然后启动FLIM收集。它将在分配的时间内从视野中获取光子。
- 可选：在完成所有必要的收集并且鼠标已从载物台上移除后，收集仪器响应函数（IRF）。通过对具有相同参数的玻璃底培养皿中市售尿素晶体的表面进行成像来测量IRF，并进行用于组织成像的设置。
注：IRF考虑了由于电子或光学设置而导致的任何延迟或反射。IRF在所有FLIM采集中都是卷积的，从数据中解卷积可以提高计算的荧光衰减曲线的准确性。话虽如此，计算出的IRF通常可以从测量的IRF中合理地复制荧光衰变曲线的质量。在确定计算的IRF将产生衰减曲线的等效拟合并充分接近测量的IRF的结果之前，最好测量IRF。
6. NADH寿命图像的分析
- 打开 FLIM 软件并从数据集导入 NAD（P）H 生存期图像。有关如何正确使用该软件的更多详细信息，请参阅荧光灯寿命手册（参见材料表）。
- 首先，在软件中定义模型参数。在菜单栏中，单击 “选项”>模型”。选中以下框： 设置>多指数衰减、MLE>拟合方法、空间分档>平方、阈值>峰值，然后选中 计算影像前固定平移。
- 在菜单栏中，单击下拉菜单 中的颜色> A1% 。在窗口的右侧，将其定义为三分量拟合。将 条柱大小设置为 3 >。
- 调整 阈值> ~10。首次计算衰减矩阵后，重新评估阈值精度。
- 修复 τ1 到 200 ps。这代表了红细胞的短寿命。尝试找到与较大血管中的多个斑点最匹配的值，该值可以在强度图像中看到。将τ2修复到1200 ps。这代表了红细胞的长寿命。
注意：设定值只是起点。需要优化这些值以更多地带出脉管系统。在大多数情况下（但并非总是如此），这些值会减小。 - 在菜单栏中的“ 计算 ”下，选择“ 衰减矩阵”。这将生成初始A1%寿命图像，脉管系统具有高值。使用光标（十字准线）将鼠标悬停在脉管系统上。系统地一次一个地浮动（取消选中 “修复 ”框）τ1 和 τ2。记录这些值，因为它们将有助于优化固定参数。
注意：目标不一定是获得图像中最准确的值，而是最大化脉管系统与组织之间的差异，而不会显着减少识别为脉管系统的面积。 - 确定 τ1 和 τ2 的相应参数后，在菜单栏中选择“ 计算>批处理”。确保 z 切片之间的大多数设置相似。
- 确保验证没有一个设置与其他设置有明显不同。如果是这样，请先调整班次，然后重试。如果问题仍然存在，请使用新参数进行重新修饰。不正确的位移可能是拟合中噪声的一大原因，并且可以使相邻肿瘤区域的A值增加1%。
- 在菜单选项卡中，保存文件，然后导出 A1% 文件。在 ImageJ 中上传这些文件以进行遮罩和分割。
7. 脉管系统的图像分割
- 打开 ImageJ 并将 A1% 图像作为文本图像导入。对堆栈中的所有图像重复此操作。
- 打开所有 A1% 图像后，选择“ 图像>堆栈> Z 项目”。使用 最大强度投影 并保存图像。有关代表性图像 ，请参阅补充数据 1 。
- 转到 插件>分段。选择可训练的 WEKA分割插件38。
- WEKA窗口打开后，使用默认设置并开始训练软件，方法是创建两个类，并在脉管系统（高A1%区域）和非脉管系统（低A1%区域）上跟踪线。
- 继续向这两类添加新的迹线，直到软件始终如一地识别脉管系统的高A1%区域，同时消除任何较高的背景噪声区域。有关代表性分类 器模型 ，请参阅补充模型。
- 生成分类图像后，单击“ 图像>类型> 8 位”。对图像设置阈值并创建蒙版。如果阈值图像仍需要进一步清理，请使用 分析粒子 功能。
- 调整大小和圆度，直到排除阈值图像的任何较小和圆形区域。获得只有脉管系统和很少背景的干净面罩。
- 单击 编辑>选择>创建选择。通过单击“ 分析>工具”> ROI 管理器，将所选内容传输到 ROI 管理器。
- 复制已分类影像。继续 处理二进制>。要展开蒙版并定义与将包含在图像分割中的脉管系统的距离，请选择“ 扩张”。重复此步骤，直到蒙版扩展到所需范围。在 ROI 管理器中记录此感兴趣区域 （ROI）。
注意：此步骤的目标是量化血管一定距离内的量或行为（例如，血管Xμm内存在的细胞数量）。所需的扩张量完全由科学问题决定。 - 要量化限制区域内的单元格数量，请选择感兴趣的窗口（图像/通道）。这可以是与血管面罩共享相同视野的任何窗口。使用下拉菜单中的 XOR 函数应用这两个 ROI。
注意：此操作将测量距脉管系统所需距离内的物品，不包括脉管系统本身。然后，这种组合的ROI方法可用于测量多种参数，例如强度，细胞数量或迁移。
8. 肿瘤巢的图像分割
- 从 ImageJ 中的高分辨率强度扫描或 FLIM 集合中打开 NADH 图像。
注意：这可以在单个 z 切片、完整堆栈上完成，也可以应用于几个切片的 z 投影。 - 转到 插件>分段。选择可训练的 WEKA分割插件。
- WEKA窗口打开后，使用默认设置并开始将软件训练为两类NADH高区和NADH低区。NADH高区域将具有非常可识别的细胞核模式，软件将很容易识别它。
- 继续使用叠加层来回切换，以通过额外的训练来完善算法，直到它识别出由眼睛和肿瘤形态学的先验知识确定的肿瘤的所有区域。这是一个迭代过程。
- 一旦算法识别出肿瘤的所有区域，选择“ 创建结果 ”按钮。这将生成一个新映像。复制此图像。
- 选择第一个复制的图像，并通过选择“ 图像>类型> 8 位”将其转换为 8 位图像。阈值此图像以创建二进制掩码。然后创建一个选择并将其传输到ROI管理器。这些ROI将定义基质。
- 选择复制图像中的第二个，并将其转换为 8 位图像。通过选择“ 图像”>“编辑”>“反转”来反转此图像，然后阈值此图像以创建二进制掩码。再次创建一个选择并将其传输到ROI管理器。这种ROI将定义肿瘤巢穴。
9. 按光纤组织或对齐进行图像分割
- 首先，打开 SHG 图像，准备任何 z 投影，并评估是否需要进行任何预处理。为了获得良好的效果，需要具有可识别光纤和低噪声的高质量图像。
- 可选：要在 ImageJ 中进行预处理以增加 SHG 通道的信噪比 （SNR），请使用滚动球减法减去背景。对于大多数应用程序，请使用 20 像素到 50 像素之间的滚动球减法。然后平滑图像并保存。
- 打开定向J插件并设置处理参数。在“方向 J”窗口中，定义局部张量窗口的大小。对于此光纤密度的 20 倍图像，请将 10 像素设置为 15 像素作为起点。
- 选择 三次样条 作为渐变模型，然后选中 颜色测量框。定义颜色测量。将 “色相 ”和 “饱和度 ”都设置为 “一致性”，然后将 “亮度 ”定义为 “原始图像”，单击“ 运行”。
- 插件的输出文件是RGB色彩映射表。调整局部张量窗口的值，直到由眼睛确定的对齐区域以蓝色和洋红色色调正确突出显示。
- 一旦输出图像令人满意，请将此RGB图像分成3个通道。选择 图像>颜色>拆分通道。
- 要增强对齐区域的外观以用于遮罩，请通过选择“处理”>图像计算器“来使用 图像计算器。使用此运算符，从蓝色图像中减去绿色图像。对于限制性更强的蒙版，请从红色图像中减去绿色图像。对于随机区域，从绿色通道中减去蓝色通道。
- 使用 时刻 算法阈值生成的图像。在大多数情况下，这应该不需要进一步调整。但是，如果需要，请进行调整。这将生成一个二进制图像。
- 制作二进制图像后，通过选择“ 处理>二进制>填充光纤之间的孔来填充孔 ，并使用中值滤波器圆整蒙版的边界。中位数筛选器 10 是一个很好的起点，请对其进行调整以使其适合数据。手动检查掩码是否一致，并删除任何错误的 ROI。
- 蒙版满意后，通过选择“ 编辑”>“选择”>“创建选择”来创建选择。将此选择转移到 ROI 经理。
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Representative Results
MIW的安装和基本的实验规划是这一过程的第一步。这种特殊的MIW设计和方案更适合纵向研究19 ，并且已成功用于直立和倒置显微镜。在这种情况下，使用了倒置显微镜，因为它使乳腺的图像稳定性更高，呼吸伪影更少。在 图1A中，我们提供了刚性MIW的尺寸和植入过程的图形概述。
无标记MMTV-PyMT39乳腺肿瘤（图1B-E，图3A）中的典型视野是非常异质的，由胶原纤维，大量基质细胞，肿瘤细胞团和脉管系统组成（图3A）。通常，胶原纤维在窗口附近更丰富，并且在肿瘤深处丰度降低（图1B-E）肿瘤肿块周围的纤维的组织也可以非常多样化，通常具有与更高排列区域相同的视野中具有更随机的组织区域（图2D，H和图3I）。
为了开发一种可以将活体内数据分割成血管周围区域，肿瘤和基质的分析管道，该协议侧重于使用来自内源性NAD（P）H和SHG的信号。虽然肿瘤和基质的鉴定可能很简单，但肿瘤微环境中血管周围区域的鉴定可能具有挑战性。脉管系统通常位于明亮的NAD（P）H +癌细胞团之间的减少的NAD（P）H信号的狭窄带内。重要的是要注意，并非所有黑暗边界都含有脉管系统;相反，一些黑暗区域只是肿瘤褶皱或相邻肿瘤叶的对接（黄色箭头， 图2G）。此外，虽然经验丰富的眼睛可以从肿瘤中提取更大直径的血管，因为它们具有独特的外观，但这种区别并不总是微不足道的。对于直径较小的容器尤其如此，因为它们的外观可能更加微妙和多变。在这种情况下，使用NAD（P）H的荧光寿命可以帮助脉管系统的阳性鉴定（图2B，F）。荧光寿命（FLIM）不测量某个位置的光子的丰度或强度，而是测量这些激发分子发射光子并衰变到基态所需的时间。红细胞（RBC）和血浆已被证明具有特征性短而独特的荧光寿命32，37 ，可用于识别和分割组织中的血管。
为了确定NAD（P）H的荧光寿命如何识别活体内脉管系统，在收集FLIM图像后，将100μL罗丹明标记的葡聚糖注入尾静脉。NAD（P）H FLIM的最大强度投射的比较密切反映了那些用荧光标记的葡聚糖标记的血管（图2I-J）。在多只小鼠中重复这种方法表明，来自FLEM图像的葡聚糖掩模区域的平均掩模面积为78.6%±12.3%（图2L）。虽然覆盖不是100%，但这种技术准确地映射了整个血管网络。在报告区域观察到的差异通常可归因于活体内漂移或配准问题，由于模型拟合而导致的容器直径变薄，或者由于增加的质量的压力而排除RBC而导致的细血管损失。重要的是，该技术在存在遗传编码的荧光团（如GFP）或无标记肿瘤模型（图2D，H）的情况下同样有效，从而为识别用于图像分割的脉管系统提供了一种非常强大且广泛适用的方法。
为了描绘无标记肿瘤肿块的边界，使用NAD（P）H自发荧光（图1C）。这可以通过独立收集NAD（P）H图像或对NAD（P）H FLIM数据求和以生成强度图像来捕获。任何一种途径都将允许对肿瘤微环境进行适当的分割。作为一般观察，癌细胞中NAD（P）H的双光子激发引发明亮的自发荧光，产生图像，显示具有深色细胞核的清晰单个细胞（图2E，G）。此模式可用于定义不断增长的质量的范围。虽然基于NAD（P）H的简单强度阈值可以定义肿瘤区室的边界，但可训练的分割工具通常效果更好（图3B，E）。其他一些常见的读数，如细胞迁移或细胞突起分析，可能受益于小鼠模型中遗传编码的外源荧光或荧光标记细胞系的植入（图2A）。在这些情况下，可以通过荧光蛋白的简单阈值来完成标定质量边界的任务。有时荧光团的表达在植入后会变得非常异质。这应该不会导致分段问题。此外，人们经常观察到，由荧光同种异体移植物或异种移植物产生的肿瘤比由MMTV-PyMT16等遗传肿瘤模型产生的肿瘤具有更少的胶原纤维区室化区域。
基质区室包括生长肿块外或生长肿块之间的区域，并且通过倒置肿瘤ROI获得基质的掩模（图3B-F）。然后，基质区室可以基于胶原纤维结构进一步划分为亚ROI。胶原纤维是基质中的一个重要特征，并且具有大量多样性的纤维组织，已知其调节细胞行为40，41。图像16中通常存在许多局部（<100μm）区域的对齐或随机纤维。因此，使用 OrientationJ 插件识别相对对齐（红色/蓝色色调）或随机（绿色色调）纤维组织（图 3I）的区域。使用 OrientationJ 一致性色彩映射表，可以创建基于局部纤维组织的掩码以进行分割（图 3J）。然后可以覆盖这些掩模以分析由于特定纤维组织的影响而导致的差异动态基质细胞行为（图3K）（图3H，I）。
现在已经定义了肿瘤微环境各个区室的投资回报率，它们可以应用于活体内延时短片的单个帧或通道。在这一点上，重要的是要强调图3A所示的所有信号完全来自内源性来源。这张图片展示了空间和上下文线索的丰富潜力，这些线索可能来自纯粹的内源性，无处不在和无标签的来源。在这里，我们以MMTV-PyMT肿瘤模型为例，说明了该方法在肿瘤微环境（TME）特定位置内量化巨噬细胞数量和特征的适用性。先前的一项活体注射研究42表明，释放出高水平的FAD自发荧光的细胞（图3A，洋红色细胞，黄色箭头）用F4 / 80抗体阳性染色，并代表TME内的巨噬细胞群。使用这种工作流程分割图像，可以有效，准确地检查数量，监测细胞 - 细胞相互作用随时间的变化，甚至观察TME不同区室内巨噬细胞亚群（洋红色）的代谢特征（图3A，黄色箭头）。例如，可以表征特异性存在于NAD（P）H-高肿瘤巢中的FAD高巨噬细胞的行为（图3E）。同样，可以检查巨噬细胞相对于基质区域纤维局部组织的行为。最近的一些报告表明，基质中的巨噬细胞和其他迁移细胞对来自其局部微环境16，43，44的机械线索有反应。使用这种方法产生的纤维对准面膜，可以检查它们在随机和排列的胶原组织区域之间的差异行为。最后，这种相同的聚焦分析也可以应用于确定定距离脉管系统的确定的邻近范围内的巨噬细胞的数量和行为。在图3G中，可以看到红色的脉管系统，而洋红色中可以再次看到巨噬细胞。使用NAD（P）H FLIM创建脉管系统的蒙版，然后通过10像素的扩张进行扩展。出于演示目的，选择的距离是任意的，但可以根据单个实验的特定需求进行优化。重要的是，虽然此图像是单个z切片，但该过程可以很容易地外推到3D堆栈中，以观察整个容器体积周围的行为。
图1：乳腺窗口植入的图形摘要和MMTV-PyMT肿瘤的潜在组织。（A）乳房成像窗口的尺寸和一般植入过程的示意图。（B-E）这是一个来自未标记的MMTV-PyMT肿瘤代表的蒙太奇，从MIW表面以下50μm开始，一直持续到80μm的深度。深度值在每个图像下方提供。胶原纤维（灰色）在肿瘤表面（NAD（P）H，蓝色）比在更深的深度更普遍。比例尺 100 μm。请点击此处查看此图的大图。
图2：GFP标记和无标记PyMT肿瘤的代表性活体内图像以及NAD（P）H FLIM作为脉管系统标志物的验证。GFP-4T1细胞的典型同种异体移植到乳腺脂肪垫和来自MMTV-PyMT肿瘤模型（E）的代表性乳腺肿瘤的复合图像（A）。NAD（P）H FLIM映射两个模型（B，F）中的脉管系统。采用GFP荧光（C）和NAD（P）H自发荧光（G）鉴定肿瘤。胶原蛋白由SHG（D，H）可视化。通过比较尾静脉注射荧光葡聚糖（I，J，K）之前和之后的活体内堆栈的最大强度投影，验证了使用NAD（P）H FLIM鉴定脉管系统的复合图像。NAD（P）H FLIM确定的面积与四只小鼠中葡聚糖注射物鉴定的区域（颜色识别单个小鼠）和多个视场（图中的单个点）的比率的量化显示在（L）中。比例尺 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在无标记的PyMT肿瘤内使用内源性荧光进行代表性图像分割。 仅使用内在信号收集来自典型PyMT乳腺肿瘤的单个z切片的复合图像（A）。SHG（灰色）可视化肿瘤的胶原纤维。NAD（P）H自发荧光的荧光寿命成像（Tau（τ）平均值）报告细胞的代谢特征（绿色至橙色色调）和血管的位置（红色）。FAD 自发荧光（洋红色）可识别巨噬细胞。使用该方案中概述的分割方案，仅使用SHG和NAD（P）H自发荧光将无标记肿瘤分割成肿瘤巢（B，E），基质（C，F）和脉管系统（D，G）的区室。基质和胶原纤维（H）也可以分为排列纤维的局部区域（（以洋红色/蓝色显示）， J，K）。比例尺 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充数据1：来自NAD（P）H FLIM的拟合A1%的代表性数据集。 这是典型数据集中拟合 A1% 的最大强度投影。它是使用可训练分类器之前可能的识别质量和典型背景水平的代表。 请点击此处下载此文件。
补充模型：在拟合A上使用代表性分类器1%用于识别脉管系统。 这是一个示例分类器模型，用于ImageJ中的可训练WEKA分割插件。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
4D活体成像是研究天然肿瘤微环境的空间和时间背景下动态生理相互作用的强大工具。该手稿提供了一个非常基本且适应性强的操作框架，仅使用来自二次谐波产生或NAD（P）H自发荧光的内源性信号来划分肿瘤肿块内，相邻基质或靠近血管网络的动态细胞相互作用。该协议提供了一种全面的分步方法，从植入成像窗口到图像采集，分析和分割。我们相信这种技术将有助于建立一个必要的分析框架，以分割和量化4D活体内数据。
该协议被开发为与许多活体内小鼠模型广泛兼容，包括未标记的PDX模型。PDX是一个信息丰富的模型45，但对活体成像提出了挑战，因为PDX模型的性质不适合遗传操作。因此，拥有一种方法，仅使用NAD（P）H和二次谐波产生（SHG）等内源性代谢物，可以可视化和划分其未标记的生理环境中的动态相互作用，这将是非常有利的。除了对PDX模型有利之外，这种多维方法在理论上可以应用于癌症或正常组织的任何活体内研究，这些研究需要空间和结构背景来解决生理问题。来自胶原纤维的NAD（P）H自发荧光和SHG在所有组织中无处不在，是活体内收集的通用和免费资源。这种FLIM方法也很稳健，因为它可以在来自GFP等外源源的荧光存在下识别脉管系统。这种方法也是有利的，因为SHG和NAD（P）H发射可以在蓝色光谱中可视化，从而驻留在通常不用于荧光融合结构成像的波长中，否则可能是研究所需的。
这种方法新颖且具有特殊附加值的方面是脉管系统的无标记识别。虽然其他方法可以工作，但使用NAD（P）H的荧光寿命很容易提供清晰的特征，而无需额外的标记。数据显示，寿命定义的血管反映了尾静脉注射荧光葡聚糖（脉管系统成像的金标准）标记的脉管系统。与简单的双光子或三光子激发相比，我们的技术擅长可视化较小的血管，其中较大的血管很容易可视化，但较小的血管需要更多的专业知识来识别。无论尺寸大小，所有船舶的生命周期签名都是明确的。此外，这种额外的NAD（P）H FLIM采集可以很容易地与其他标记物结合，用于分割肿瘤微环境。通过NAD（P）H的单次FLIM采集，可以实现定义脉管系统，肿瘤巢和基质的要求。FLIM集合可以通过在时间序列的末尾或开始时收集单个采集或在整个4D采集过程中交错收集来合并到现有的实验设计中。确定适当数量的FLIM图像将取决于特定的实验需求和限制，例如采集间隔，实验持续时间或图像稳定性，但这种方法至少需要每个4D系列一个FLIM集合。
利用NAD（P）H FLIM识别脉管系统的这一过程需要以数学方式将FLIM数据拟合到以下形式的指数函数：
A1+A2+A3=1。虽然文献中报道的大多数NAD（P）H的寿命图像都拟合为双指数，但在此应用中，NAD（P）H被拟合为三指数，其中τ1和τ2设置为RBC的报告值，并且允许τ3浮动。重要的是，目标不是实现最准确的生命周期值，而是为分割提供最佳图像。当τ1和τ2值最初固定在RBC的32，46的报告值并计算基质时，血管中A1%的值在血管中大于60%，A1%的值在邻近肿瘤中通常小于40%时会突出。下一步是尝试最大化血管中的A1%，同时最小化相邻肿瘤中的A1%。这是一个迭代过程，到最后，血管的A1%值将大于90%，肿瘤的A1%值小于10%。一旦血管的A1%值均匀地高并且背景均匀地低，请将这些A1%文件导出到可训练的分割工具中。这将快速消除任何剩余的噪音，并确定脉管系统的投资回报率。
由于乳腺脂肪垫位于体腔外，因此手术是微创的，通过将MIW植入第 4个腹股沟乳腺上获得最佳效果。窗口植入的时间和进行实验的时间至关重要。最好在将要研究的生理时间点之前允许手术后24-48小时的愈合。虽然手术本身只需要一个小切口（≈10毫米）来插入窗口（图1A），但术后愈合时间将允许由于植入过程而积聚的任何炎症和液体清除。此外，它还将允许肿瘤继续生长到窗口。这两个因素都将通过减少不透明度/散射和提高图像稳定性来提高整体图像质量。接下来要考虑的是实验的计划总持续时间。虽然这些窗口是为纵向研究而设计的，但窗口的刚性导致2至3周的时间限制。在该时间跨度之后，窗口具有从真皮层中移出的趋势，从而污染并终止实验。如果不需要对乳腺进行纵向研究，则其他活体内方法（如消除MIW手术植入的终末皮瓣手术22 ）可能是更好的选择。皮瓣手术可以更好地接近整个腺体，因为它不受MIW的位置和尺寸的限制，并且当腺体被拉离体腔时，它可以产生更大的图像稳定性。无论使用何种活体成像方法，使用内源性荧光分割微环境仍然广泛适用于随后的图像分析。最后要考虑的是单个成像实验的持续时间。获取持续6-8小时的电影并非不合理。然而，在较长的收集过程中，水合作用成为一个问题，需要密切监测小鼠的健康状况。
该方法的一个显着优点是，可以相对容易地收集分割肿瘤微环境所需的各种内源性荧光图像，而无需对小鼠进行额外操作。使用此处报告的滤光片/二向色性组合（材料表），通过将波长从890 nm切换到750 nm，可以使用相同的滤光片集获取SHG和NADH图像。虽然这会产生采集延迟，但不会影响后续的图像分割。同样重要的是要记住，这种方法只是使用内源性荧光的分割技术的起点，如果需要，更先进的光学配置可能允许同时采集。
使用 FLIM 识别脉管系统存在局限性。FLIM 方法需要专门的电子设备、仪器和专业知识来收集。然而，所有这些要求越来越多地集成到现代显微镜中，并且通过使用成像核心设施可以获得更多。FLIM已经成为一种成熟的技术，获取良好的数据不需要太多的培训。第二个限制是FLIM收购非常耗时。虽然用荧光葡聚糖收集的图像的帧速率约为一秒或更短，但平均FLIM收集的范围可以从60秒到120秒，如果生理时间点短于此时间点，这可能是令人望而却步的。FLIM识别脉管系统不旨在取代所有尾静脉注射的荧光葡聚糖或血管系统的多光子激发;相反，它是不断增长的活体成像工具箱中的另一种方法。此外，我们预计未来几年将大大缩短收购时间。探测器和电子设备正在迅速改进，减少了探测器的死区时间，因此需要更短的采集周期来捕获相同数量的光子。对更短的采集时间持乐观态度的另一个原因是机器学习软件或图像恢复算法（如CSBDeep47）的出现。这些算法可能会被训练成以更短的曝光时间工作，从而减少准确识别结构以进行分割所需的光子数量。总之，这可以迅速减少这些多维收购所需的时间框架。
随着研究人员试图解开生理肿瘤微环境中发生的许多复杂的细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用，活体内成像的使用只会变得更加重要。因此，需要继续发展采集、细分和分析能力。为此，重要的是不要忽视内源性荧光在微环境分割中的潜力。在该方案中，来自SHG和荧光代谢物的内源性信号（包括NAD（P）H强度和FLIM）用于乳腺TME的活体内成像期间的分割目的。其他内源性代谢物或内在特性可以提供额外的信号来揭示肿瘤细胞和微环境的动态互惠性。例如，FAD可用于监测免疫群体42的运动，3P生成可以突出质膜或脂肪36等结构特征，而弹性蛋白荧光可用于将动脉与静脉46分离。因此，内源性荧光将继续提供丰富的多维平台，随着研究界继续构建用于活中微环境分割和分析的工具箱，应充分利用该平台。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者希望感谢NCI R01 CA216248，CA206458和CA179556资助这项工作。我们还要感谢Kevin Eliceiri博士及其成像小组在早期开发我们活体内计划方面的技术专长。我们还感谢Ben Cox博士和Morgridge研究所Eliceiri制造小组的其他成员，他们在MIW的早期阶段进行了必要的技术设计。Ellen Dobson博士协助进行了有关ImageJ可训练WEKA分割工具的有用对话。此外，我们要感谢Melissa Skala博士和Alexa Barres-Heaton博士及时使用他们的显微镜。最后，我们要感谢 Brigitte Raabe 博士，D.V.M.，感谢他就我们的鼠标处理和护理所做的所有深思熟虑的讨论和建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
References
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