Summary
Los lisados plaquetarios representan una herramienta emergente para el tratamiento de las enfermedades de la superficie ocular. Aquí, proponemos un método para la preparación, dispensación, almacenamiento y caracterización del lisado plaquetario recolectado de donantes de plaquetas.
Abstract
Varias enfermedades de la superficie ocular se tratan con gotas oculares derivadas de la sangre. Su uso se ha introducido en la práctica clínica debido a su contenido de metabolitos y factores de crecimiento, lo que promueve la regeneración de la superficie ocular. Las gotas oftálmicas a base de sangre se pueden preparar a partir de diferentes fuentes (es decir, donación de sangre total o aféresis plaquetaria), así como con diferentes protocolos (por ejemplo, diferentes diluciones y ciclos de congelación / descongelación). Esta variabilidad dificulta la estandarización de los protocolos clínicos y, en consecuencia, la evaluación de su eficacia clínica. Detallar y compartir los procedimientos metodológicos puede contribuir a definir directrices comunes. En los últimos años, los productos alogénicos se han ido difundiendo como alternativa a los tratamientos autólogos, ya que garantizan mayores estándares de eficacia; entre ellos, las gotas oftálmicas de lisado de plasma rico en plaquetas (PRP-L) se preparan con procedimientos de fabricación simples. En la unidad de medicina transfusional de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, el PRP-L se obtiene de la donación de aféresis plaquetaria. Este producto se diluye inicialmente a 0,3 x 10 9 plaquetas/ml (a partir de una concentración media de 1 x 10 9 plaquetas/ml) en NaCl al0,9%. Las plaquetas diluidas se congelan/descongelan y, posteriormente, se centrifugan para eliminar los residuos. El volumen final se divide en alícuotas de 1,45 ml y se almacena a −80 °C. Antes de ser dispensado a los pacientes, las gotas para los ojos se prueban para determinar su esterilidad. Los pacientes pueden almacenar lisados plaquetarios a -15 °C durante un máximo de 1 mes. La composición del factor de crecimiento también se evalúa a partir de alícuotas seleccionadas al azar, y los valores medios se informan aquí.
Introduction
Los productos derivados de la sangre son ampliamente utilizados en el cuidado de heridas1, cirugía maxilofacial y ortopédica, y para el tratamiento de diferentes enfermedades de la superficie ocular2 como la enfermedad del ojo seco (DED)3. En la DED, la homeostasis de la película lagrimal se ve afectada como consecuencia del funcionamiento anormal de diferentes factores involucrados en la producción de lágrimas y la integridad de la superficie ocular 4,5.
La DED se caracteriza por heterogeneidad en las causas y la gravedad 6,7,8 y puede ser consecuencia de diferentes factores como el envejecimiento, el sexo9, las lentes de contacto, los medicamentos tópicos o sistémicos 10, o condiciones preexistentes como el síndrome de Sjögren10. A pesar de tener síntomas leves, el DED afecta a millones de personas en todo el mundo, afectando su calidad de vida y también el sistema de salud6.
Muchos tratamientos han sido reportados para esta patología, pero aún no hay consenso sobre la solución más efectiva12. Hasta la fecha, las lágrimas artificiales son la primera línea de terapia dirigida a restaurar la composición acuosa de la película lagrimal, aunque estos sustitutos no contienen los principales solutos biológicamente activos de las lágrimas naturales 6,11. Los productos a base de plaquetas se consideran una alternativa válida12,13 a las lágrimas artificiales, aunque su eficacia clínica, recomendaciones de uso y métodos de preparación siguen siendo un tema de debate3.
Los productos derivados de la sangre comparten con las lágrimas una composición similar en términos de metabolitos14, proteínas, lípidos, vitaminas, iones, factores de crecimiento (GF), compuestos antioxidantes 11 y osmolaridad (300 mOsm/L)11. A través de la actividad sinérgica de sus componentes, promueven la regeneración del epitelio corneal, inhiben la liberación de citoquinas inflamatorias y aumentan el número de células caliciformes y la expresión de mucinas en la conjuntiva 2,3.
Hasta ahora, la heterogeneidad en los productos oftálmicos a base de sangre se ha documentado en la literatura; Estos productos se pueden clasificar según el origen de los donantes de sangre, es decir, autólogos o alogénicos, así como la fuente de sangre, es decir, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, suero o plaquetas.
A pesar de que los productos autólogos fueron los más extendidos3, los alogénicos se están convirtiendo en la opción preferida, ya que garantizan mayores estándares de eficacia y seguridad 15, junto con una reducción significativa de los costos16,17. Estudios previos, de hecho, demostraron que los productos sanguíneos obtenidos de pacientes con enfermedades autoinmunes y/o sistémicas pueden mostrar una calidad y funcionalidad alteradas 6,16,17. A pesar de que los colirios a base de suero son los más extendidos, los productos a base de plaquetas se están afirmando recientemente como una alternativa válida, ya que pueden ser fácilmente preparados manteniendo niveles significativos de eficacia 3,11. Los productos a base de plaquetas actualmente disponibles se pueden dividir en plasma rico en plaquetas (PRP), lisado plasmático rico en plaquetas (PRP-L) y plasma rico en factores de crecimiento (PRGF)3.
Entre ellos, el PRP-L tiene la ventaja de ser un producto congelado de larga duración. El PRP-L se puede preparar a partir de aféresis, capas leucocitarias o incluso de plaquetas expirantes (PLTs)18,19, reduciendo preciosamente su desperdicio. Las alícuotas pueden almacenarse durante meses en los centros de transfusiones de sangre a -80 °C o incluso en los hogares de los pacientes a -15 °C durante períodos más cortos.
Los PRP-L están altamente enriquecidos en GFs, que han demostrado estimular la regeneración de la superficie ocular 12,20,21. Sin embargo, existen pocos estudios clínicos reportados en esta área, y todos ellos utilizaron fuentes autólogas 3,22. El PRP-L aún necesita una mayor validación y caracterización antes de que pueda ser utilizado rutinariamente para el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular, ya que no existen pautas estandarizadas para su preparación, dispensación y almacenamiento3.
En este documento, se comparte un protocolo detallado para la producción de PRP-L utilizado en la Unidad de Medicina Transfusional en AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Italia, y la dispensación a pacientes con DED. Nuestro objetivo es ayudar a la comunidad científica a desarrollar métodos estándar de preparación, que pueden aumentar la homogeneidad y la consistencia en los estudios y enfoques clínicos en todo el mundo.
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Protocol
El PRP-L utilizado para la evaluación cuantitativa de los factores de crecimiento se recogió en un estudio más amplio sobre la caracterización de productos de PRP con fines regenerativos, llevado a cabo en el AUSL-IRCCS di Reggio Emilia y aprobado por el Comité de Ética del Área Vasta Emilia Nord el 10 de enero de 2019 (número de protocolo 2019/0003319). Los donantes dieron su consentimiento informado de conformidad con la Declaración de Helsinki. No fue necesaria la aprobación ética para recopilar los datos agregados y anónimos del cuestionario Ocular Surface Disease Index (OSDI), que los médicos utilizan habitualmente para controlar los síntomas del síndrome del ojo seco. La Figura 1A muestra un esquema del protocolo seguido, mientras que las imágenes de la Figura 1B muestran los pasos principales del procedimiento.
1. Recolección de plasma rico en plaquetas (PRP)
- aféresis PRP
- Para este protocolo, seleccione donantes de plaquetas de acuerdo con las leyes italianas: los donantes de plaquetas deben tener entre 18 y 65 años, con parámetros normales de presión y recuento sanguíneo y un recuento de plaquetas no inferior a 180 x 109 plaquetas / L23. Los donantes elegibles no pueden tomar medicamentos antiplaquetarios o anticoagulantes dentro de 1 semana antes de la donación.
- Realizar aféresis plaquetaria plasmática utilizando un sistema automatizado de recolección de sangre, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las leyes nacionales23, para obtener 1 unidad de plasma rico en plaquetas (PRP) de un solo donante. Recolecte PRP en una solución anticoagulante de adenina citrato dextrosa A (ACD-A).
NOTA: La aféresis plaquetaria se realiza con un procedimiento continuo; El tiempo de recogida está en un rango entre 40 min y 90 min. La cantidad de ACD administrada a los donantes y el tiempo de los procedimientos dependen de las características del donante, por ejemplo, hematocrito y calibre de aguja.
- Características de las unidades PRP
NOTA: El siguiente paso generalmente se realiza automáticamente por el sistema automatizado de recolección de sangre durante el procedimiento de aféresis plasmática-plaquetaria. Consulte el manual de instrucciones del fabricante.- Resuspender las unidades de PRP recogidas por aféresis en una cantidad adecuada de solución conservante con la cantidad mínima de plasma residual, necesaria para mantener un pH > 6,4 durante todo el tiempo de conservación, hasta un volumen final medio de 180 ml netos de la solución anticoagulante (alrededor de 40 ml).
NOTA: De acuerdo con la ley italiana, los controles de calidad deben evaluar que el recuento de plaquetas (PLT) sea de al menos 2,0 x 1011 PLTs/unidad, mientras que los leucocitos residuales tienen que ser inferiores a 1 x 106 células/unidad. - Conservar el PRP leucodepleto e irradiado durante un máximo de 5 días a 22 °C ± 2 °C en un agitador de plaquetas antes de su posterior manipulación23.
- Resuspender las unidades de PRP recogidas por aféresis en una cantidad adecuada de solución conservante con la cantidad mínima de plasma residual, necesaria para mantener un pH > 6,4 durante todo el tiempo de conservación, hasta un volumen final medio de 180 ml netos de la solución anticoagulante (alrededor de 40 ml).
- Dilución de PRP
- Inmediatamente antes de comenzar la dilución de PRP, realice un recuento de PLT con un hemocitómetro utilizando la muestra recolectada de la bolsa principal a través de un pico perforante.
NOTA: Realice los siguientes pasos en esterilidad bajo una campana de riesgo biológico de clase II. Use equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y gafas) durante el procedimiento. - Diluir PRP con una cantidad adecuada de NaCl estéril al 0,9% hasta una concentración final de 0,32 x 10 9 ± 0,03 x 109 PLTs/mL, que simula la concentración media de PLT en sangre periférica.
- Aprovechando un pico penetrante para bolsas de sangre, divida el PRP diluido en bolsas de recolección vacías de 300 ml para alcanzar un volumen neto de 190 ml / bolsa.
- Utilizar una alícuota de PRP diluido residual (generalmente 1 mL) para realizar controles de calidad evaluando posibles contaminaciones microbianas. Realice un ensayo de esterilidad siguiendo las instrucciones del fabricante en un laboratorio de microbiología (ver Tabla de materiales).
NOTA: Utilice viales de cultivo específicos para hemocultivos aeróbicos, que son capaces de realizar el cultivo cualitativo y la recuperación de microorganismos aeróbicos (principalmente bacterias y levaduras) a partir de muestras de sangre de pequeño volumen. - Guarde las bolsas de PRP diluidas a -80 °C durante un máximo de 2 meses antes de descongelarlas.
- Inmediatamente antes de comenzar la dilución de PRP, realice un recuento de PLT con un hemocitómetro utilizando la muestra recolectada de la bolsa principal a través de un pico perforante.
2. Preparación de lisado de plasma rico en plaquetas (PRP-L)
- Descongelación
- Antes de iniciar el procedimiento de descongelación, asegúrese de que el baño caliente esté a 37 °C. Coloque las bolsas de PRP en el baño caliente y espere hasta que se descongelen por completo.
- Colección PRP-L
- Centrifugar las bolsas de PRP a 3000 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en esterilidad bajo una campana de riesgo biológico de clase II. - Aprovechando la punta perforante de la bolsa de transferencia, conecte la bolsa centrifugada con una bolsa de transferencia estéril vacía de 300 ml. Con cuidado, transfiera el sobrenadante PRP-L, evitando residuos, a la nueva bolsa. Cuando sea posible, use una prensa de bolsas.
- Selle el tubo de conexión de la unidad PRP-L con un sellador de bolsas.
- Centrifugar las bolsas de PRP a 3000 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
- Alícuota PRP-L
NOTA: Una unidad inicial que contenga 190 ml de PRP (ver paso 1.3.3.) es suficiente para llenar dos kits de gotas para los ojos (para obtener detalles sobre los dispositivos médicos específicos utilizados para la aplicación y preservación de gotas para los ojos de los componentes sanguíneos, consulte la Tabla de materiales). Los kits de gotas para los ojos deben abrirse debajo de una campana de clase II con todos los viales de cuerda colocados sobre la jeringa preconectada y la flecha central de la llave de paso apuntando hacia la izquierda para excluir el filtro antibacteriano.- Recoja 30-60 ml de PRP-L con una jeringa estéril y conecte la jeringa a la conexión Luer/lock en la línea de llenado.
- De acuerdo con las instrucciones del fabricante, gire la llave de paso a la mitad de una vuelta para abrir la línea entre la jeringa que contiene PRP-L y la jeringa preconectada. Llene la jeringa preconectada con PRP-L.
- Desconecte la jeringa PRP-L, cierre la tapa del tubo de la conexión luer/lock y gire la llave de paso a la posición original. Utilice la jeringa del kit de gotas para los ojos para llenar los viales con PRP-L.
- Repita el procedimiento de los pasos 2.3.1.-2.3.3. hasta que se llenen todos los viales aplicadores. Asegúrese de que cada aplicador esté debidamente lleno, luego séllelos individualmente con un sellador de bolsas.
- Repita el procedimiento con un nuevo kit de gotas para los ojos.
- Utilice una pequeña alícuota de PRP-L diluido residual para evaluar la posible contaminación microbiana (ver paso 1.3.4.).
NOTA: Si el líquido alcanza accidentalmente el filtro antibacteriano al final de la cuerda, la jeringa de succión puede oponerse a la resistencia, dificultando el llenado. Para continuar el ciclo de llenado, levante la sección final de la cuerda durante aproximadamente 5/6 alícuotas del filtro hidrófobo antibacteriano al final de la cuerda. En esta posición, use una jeringa estéril nueva (de 30 ml de volumen) que ya haya sido llenada con aire. Conecte el luer/bloqueo hembra del filtro antibacteriano y presione fuerte y repetidamente sobre el émbolo de la jeringa para eliminar todos los residuos de componentes sanguíneos y liberar la membrana del filtro antibacteriano del líquido. Retire la jeringa y llene los viales restantes.
- Almacenamiento PRP-L
- Etiquete adecuadamente cada aplicador y póngalos en una bolsa de plástico. Etiquete también la bolsa de plástico, teniendo cuidado de resaltar el grupo sanguíneo del donante.
- Conservar a -80 °C durante un máximo de 24 meses antes de la asignación del paciente, de acuerdo con la ley italiana23 y las directrices24.
3. Dispensación PRP-L
- Realice la asignación del paciente preferiblemente haciendo coincidir el grupo sanguíneo PRP-L. Administre los viales del aplicador de PRP-L utilizando una caja fría y asegúrese de que cada vial del aplicador contenga 1,45 ml de PRP-L, lo que corresponde a aproximadamente 45 gotas. Indique al paciente que los viales aplicadores se pueden almacenar en los hogares de los pacientes hasta 1 mes a -15 °C.
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Representative Results
La justificación para el uso de gotas oftálmicas derivadas del suero (que es el producto a base de sangre más utilizado para el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular) radica en su contenido de GF, que se derivan casi por completo de las plaquetas circulantes. El PRP contiene un número significativamente mayor de plaquetas (y, en consecuencia, de GF derivados de plaquetas) en comparación con el suero de sangre periférica, que oscila entre 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLTs/mL. De acuerdo con las leyes italianas, el recuento de plaquetas en unidades de PRP debe ser de al menos 0,9 x 109-1 x 109 PLTs/mL. Por lo tanto, para obtener un producto que simule la eficacia de las gotas oftálmicas séricas, el PRP debe diluirse al contenido fisiológico de plaquetas antes de la preparación del lisado.
Sin embargo, dado que la reparación tisular es impulsada principalmente por GF derivados de plaquetas, el recuento de PLT por sí solo podría ser engañoso para una terapia efectiva de las enfermedades de la superficie ocular. En DED, que es la enfermedad ocular más comúnmente tratada con gotas oculares derivadas de la sangre, la producción de película lagrimal y la homeostasis se ven afectadas. Los productos a base de plaquetas para el tratamiento de DED, por lo tanto, también deben imitar el contenido fisiológico de las lágrimas.
Identificar el PRP-L más adecuado para tratar las enfermedades de la superficie ocular, descrito en el paso 1.3.2. del presente protocolo, evaluamos preliminarmente diferentes diluciones de PRP, de acuerdo con su contenido de PLTs (entre 0,7 x 10 9/mL y 0,3 x 109/mL), y algunas GFs representativas de aquellas que se sabe que están involucradas en la reparación del tejido ocular12,20,21.
El recuento de plaquetas se realizó con un hemocitómetro, mientras que los GF se evaluaron mediante un ensayo de cuantificación de proteínas múltiples. El ensayo se realizó como se describió anteriormente25 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las GF mostradas en este manuscrito fueron seleccionadas para la cuantificación después de un cribado preliminar de 36 GFs y GFRs realizadas en lisado de PRP con una matriz semicuantitativa de proteínas. La cuantificación de luminex se realizó en 3 de los 36 GF tamizados: EGF y PDGF (que resultaron ser los más abundantes en nuestros lisados de PRP) e isoformas TGFβ-1,2,3 (para las cuales el contenido es importante para el tratamiento de la superficie ocular21). Se midió el contenido de EGF y PDGF ya que pueden influir en la eficacia de PRP-L22, mientras que las isoformas de TGFβ se seleccionaron por su papel conocido en la regulación de la señalización inmune21.
Dado que las matrices de proteínas son parte de otro estudio in vitro sobre la caracterización de diferentes PRP26, esos datos no se presentan en este manuscrito.
Se evaluó cuantitativamente EGF, PDGF y TGFβ en lisados de PRP de dos donantes diferentes (D1 y D2), previamente diluidos entre 0,7 x 10 9-0,3 x 10 9 PLTs/mL en NaCl al0,9%. La Figura 2 muestra los resultados de la dilución de 0,3 x 109 PLTs/mL, que resultó ser muy similar a la composición del desgarro.
La dilución de 0,3 x 109 PLTs/ml se seleccionó sobre la base de los datos de la literatura sobre la composición de las lágrimas. Se constató que los valores del FEAG eran bastante bajos en comparación con el valor medio de desgarro, pero seguían estando en el rango de normalidad27. Incluso el PDGF, a pesar de ser muy variable entre los dos donantes considerados, siempre fue comparable a la concentración encontrada en lágrimas normales20. Finalmente, se encontró que TGFβ-1 es la isoforma más abundante en PRP-L, similar a las lágrimas21.
Una vez identificada la dilución PLT más adecuada para preparar aféresis PRP-L, la Unidad de Medicina Transfusional comenzó a distribuir estos productos a pacientes afectados por trastornos de la superficie ocular en 2015. Los oftalmólogos recolectaron rutinariamente los cuestionarios OSDI para monitorear los síntomas de DED; la prueba OSDI evalúa medidas de calidad de vida, como la percepción de irritación ocular y cómo afecta el funcionamiento relacionado con la visión. El cuestionario, creado por el Outcomes Research Group de Allergan Inc. en 1995 y ahora aceptado como un instrumento válido para monitorear el DED, es enviado a los pacientes y analizado como se describió anteriormente28,29.
Aquí, mostramos los resultados agregados de las pruebas OSDI de pacientes con DED tratados entre enero de 2020 y enero de 2021 (n = 27). Después de una terapia de 6 meses con PRP-L, las puntuaciones OSDI disminuyeron de 56 ± 21 a 45 ± 21, lo que indica una mejora en la calidad de vida de los pacientes (Figura 3).
A pesar de que estos datos aún están en el rango severo y no se relacionan con los resultados clínicos de eficacia, sugieren que los pacientes con DED consideran que el PRP-L es un producto útil que mejora el malestar ocular; Este aspecto debe investigarse más a fondo en ensayos clínicos prospectivos destinados a evaluar su eficacia en el tratamiento de enfermedades de la superficie ocular.
En la Tabla 1, presentamos una comparación del método actual de producción con otro método para preparar PRP-L alogénico para gotas oftálmicas30 y para otros fines22. Hasta donde sabemos, el protocolo30 de Zhang y el protocolo actual son los únicos métodos publicados para producir PRP-L para la superficie ocular. En ambos, el PRP-L se obtiene de la aféresis; Las diferencias entre los dos protocolos, principalmente en relación con el número de ciclos de congelación y descongelación y las etapas de centrifugación, deben compararse para mejorar la producción de PRP-L. Sin embargo, estas diferencias metodológicas no han demostrado ser perjudiciales para la capacidad regenerativa del PRP-L probado en otros tejidos22.
Figura 1: Pasos principales del protocolo para la preparación de PRP-L. (A) Esquema del protocolo, desde la recolección de PRP hasta la preparación y dispensación de PRP-L. B) Imágenes representativas de las principales etapas de los protocolos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación de luminex de factores de crecimiento derivados de plaquetas para la dilución de 0,3 x 109/ml de PRP-L. (A) Factor de crecimiento epidérmico (EGF); (B) factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); (C) isoforma 1 del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ1); (D) isoforma 2 del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ2); (E) isoforma 3 del factor de crecimiento transformante-beta (TGFβ3). Los valores se expresan como pg/ml, media ± desviación estándar de tres mediciones independientes. D1 y D2 son dos donantes de plaquetas diferentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Puntuaciones OSDI agregadas de pacientes con DED tratados con PRP-L entre enero de 2020 y enero de 2021 en la Unidad de Oftalmología de AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 pacientes. Los resultados agregados de la puntuación OSDI se representan como media ± error estándar, el valor p se calculó con una prueba t pareada con software de análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Este artículo | PRP-L para el ojo (estudio in vitro )29 | PRP-L para otros fines21 | |
| Fuente | Aféresis de PLTs | Aféresis de PLTs | Aféresis y sangre entera |
| Ciclos de congelación y descongelación | 1 (a -80 °C) | 2 (a -80 °C) | 1-3 (a -20 °C y -80 °C) |
| Temperatura de almacenamiento | a -80 °C | a -80 °C | a -20 °C y -80 °C |
| Velocidad de centrifugación antes del almacenamiento | 3000 x g/30 mín | 3500 x g/30 min | 400-3000 x g/6 min -30 min |
| Filtración antes del almacenamiento | No | Sí | No/Sí |
Tabla 1: Comparación de protocolos para preparar PRP-L alogénico a partir de productos a base de plaquetas recolectados por aféresis.
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Discussion
En los últimos años, el uso clínico de productos a base de plaquetas para patologías de la superficie ocular ha aumentado, pero su difusión se ve obstaculizada por la falta de robustez científica. Esto se debe principalmente a la gran heterogeneidad en las fuentes de donantes y los protocolos de preparación, que a menudo no se divulgan completamente o no están diseñados específicamente para el propósito para el que se dispensan. En particular, todavía falta información sobre los productos a base de plaquetas recopilados por aféresis. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue describir el procesamiento paso a paso de lisados plasmáticos ricos en plaquetas (PRP-L) obtenidos por aféresis para el tratamiento de DED.
El PRP-L es una fuente óptima para la producción de gotas para los ojos, ya que contiene más GF que los otros productos a base de sangre22 y, en comparación con el suero o el PRP, su producción o almacenamiento son baratos y simples. Para obtener PRP-L, las plaquetas se someten a lisis (generalmente a través de uno o más ciclos de congelación y descongelación) para liberar su contenido. Este proceso garantiza una solución enriquecida en moléculas activas que estimulan la regeneración tisular22,26. Un número creciente de enfermedades han sido tratadas con PRP-L 22, pero la indicación para su uso en oftalmología es todavía débil debido a los bajos criterios de estandarización en la recolección de plaquetas y la producción de PRP-L 3,22.
Se deben preferir los productos alogénicos a base de plaquetas, ya que son más estandarizables que los autólogos, tanto en términos de características del donante como de método de preparación. El estado de salud del paciente puede afectar la calidad del producto 6,16,17, mientras que los kits internos para recolectar plaquetas autólogas de sangre total cuando los servicios de transfusión no están directamente disponibles no cumplen con la calidad estándar requerida en medicina transfusional31.
Hasta donde sabemos, no existen estudios clínicos que caractericen el uso de PRP-L alogénico en oftalmología 3, mientras que hay pocos informes sobre gotas oculares autólogas de PRP-L3 y solo un estudio que utiliza PRP-L alogénico obtenido de la sangre del cordón umbilical para tratar pacientes con enfermedadesde la superficie ocular32. Aunque el PRP-L alogénico está incluido en las guías clínicas24 y su uso ha sido propuesto 3,30, todavía hay una falta de evidencia sobre su eficacia en comparación con otros tratamientos y con otros productos a base de sangre (p. ej., suero). Aquí, el protocolo presentado tiene como objetivo ayudar a la comunidad científica a desarrollar métodos comunes de producción y arrojar luz sobre las diferencias metodológicas.
Aquí, describimos la producción de PRP-L a partir de PRP alogénico recolectado por aféresis. Los productos alogénicos a base de plaquetas para obtener lisados plaquetarios también pueden recolectarse de capas leucocitarias (BC), y ambas fuentes han sido igualmente reportadas31. Los BC se obtienen de donantes agrupados (generalmente cuatro o cinco), minimizando así las diferencias interindividuales. Por el contrario, la agrupación aumenta el riesgo de transmitir agentes infecciosos o priones o estimular una respuesta alogénica31,33. La aféresis es un procedimiento complejo e invasivo, y sólo una minoría de donantes son elegibles o cumplen con ella34. Sin embargo, los productos a base de plaquetas obtenidos por aféresis están libres de otras células sanguíneas circulantes residuales y contienen una mayor cantidad de PLTs35. Por estas razones, el trabajo actual se centra en el desarrollo de estudios clínicos para comparar PRP-L de estas dos fuentes diferentes.
En este protocolo, la concentración inicial de PLTs en unidades de PRP recolectadas por aféresis fue en promedio de 1 x 109/mL, lo que es consistente con las concentraciones reportadas para otros productos a base de plaquetas22. En este método, los PLT se diluyen después con una solución de NaCl al 0,9% a 0,3 x 109/ml. Otros protocolos relatan el uso de plasma para la dilución22.
Pocos estudios han reportado el uso de PRP-L en oftalmología; en estos casos, se prepararon colirios autólogos a concentraciones de PLTs que oscilaban entre 0,5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38. Como se discutió anteriormente, los marcadores de estandarización son deseables y también ayudarían a determinar la dilución adecuada. Aquí, por ejemplo, informamos la concentración de algunos GF fundamentales en el PRP-L. El contenido de EGF y PDGF influye en la eficacia de PRP-L22, mientras que las isoformas de TGFβ están implicadas en la regulación de la señalización inmune21,39, y su concentración está finamente regulada. Por lo tanto, la concentración de TGFβ en gotas oculares a base de plaquetas puede influir no solo en la eficacia, sino también en posibles efectos perjudiciales39; Por lo tanto, debe investigarse cuidadosamente antes de definir la dilución adecuada. No obstante, la dilución seleccionada -0,3 x 109 PLTs/mL- se basó en el contenido de GFs en lágrimas21,25. Zhang et al. compararon previamente gotas oftálmicas a base de suero, tanto autólogas como alogénicas, y lisados a base de plaquetas por su contenido en GF y por su capacidad para promover la regeneración de células corneales in vitro30. El estudio mostró cómo estos productos tienen características comparables, con PRP-L con una mayor concentración de EGF pero una menor fibronectina. En su protocolo, el proceso de congelación/descongelación se repitió dos veces, la centrífuga se realizó a 3500 x g durante 30 min, y el lisado plaquetario se almacenó a -80 °C30.
La congelación y descongelación es, de hecho, un paso crítico; la mayoría de los protocolos (incluido este) se desarrollaron con -80 ° C de congelación y 37 ° C de descongelación, pero la congelación también se ha informado a -24 ° C, -196 ° C y -150 ° C 22,33 Incluso el número de ciclos de congelación / descongelación realizados son variables, variando de 1 a 522,33. Un número limitado de estudios también informó la sonicación o el tratamiento con disolvente/detergente para obtener lisados plaquetarios22,33. Otras variables metodológicas previamente reportadas en la preparación de PRP-L se refieren a la etapa de centrifugación -entre 300 x g y 10000 x g, de 2 min a 60 min- y el almacenamiento a largo plazo, que, en la mayoría de los casos, es a -80 °C, aunque también se han almacenado directamente productos similares a -20 °C22. Las condiciones de almacenamiento, en particular, deben controlarse cuidadosamente, ya que podrían afectar la disponibilidad y la actividad de los GF contenidos en los lisados. En este contexto altamente heterogéneo, los controles de calidad y los estudios clínicos que tengan en cuenta la liberación de factores biogénicos y las diferencias en el efecto terapéutico deben evaluarse urgentemente.
Finalmente, aquí mostramos cómo este método ha sido evaluado significativamente con un resultado positivo de un análisis agregado de pacientes con enfermedad de ojo seco que recibieron PRP-L durante 6 meses (cuestionario OSDI3). Aunque prometedor, la OSDI por sí sola no es suficiente para determinar la eficacia del PRP-L en el tratamiento del DED y otras enfermedades de la superficie ocular, y se justifican estudios clínicos sobre el uso de PRP-L alogénico. Además, deben compararse las posibles diferencias en la composición del producto debidas a pasos metodológicos alternativos (es decir, congelación y descongelación, centrifugación, almacenamiento) para optimizar el procedimiento metodológico.
En conclusión, la alta heterogeneidad de fuentes de sangre y protocolos aún dificulta la traducción definitiva de los productos sanguíneos al tratamiento clínico de las enfermedades de la superficie ocular. Aunque el PRP-L es un producto emergente con algunas características ventajosas, se necesitan más estudios para validar su uso y desarrollar pautas comunes. Compartir y detallar el protocolo de preparación puede ampliar la usabilidad y arrojar luz sobre los pasos críticos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a "Casa del Dono di Reggio Emilia" por proporcionar concentrados de plaquetas derivados de donantes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
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