Summary
Trombosit lizatları, oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde ortaya çıkan bir araçtır. Burada, trombosit donörlerinden toplanan trombosit lizatının hazırlanması, dağıtılması, depolanması ve karakterizasyonu için bir yöntem öneriyoruz.
Abstract
Çeşitli oküler yüzey hastalıkları kan kaynaklı göz damlaları ile tedavi edilir. Göz yüzeyi yenilenmesini destekleyen metabolit ve büyüme faktörü içeriği nedeniyle kullanımları klinik pratikte tanıtılmıştır. Kan bazlı göz damlaları, farklı kaynaklardan (yani, tam kan veya trombosit aferez bağışı) ve farklı protokollerle (örneğin, farklı seyreltmeler ve donma / çözülme döngüleri) hazırlanabilir. Bu değişkenlik, klinik protokollerin standardizasyonunu ve dolayısıyla klinik etkinliklerinin değerlendirilmesini engellemektedir. Metodolojik prosedürlerin detaylandırılması ve paylaşılması, ortak kılavuzların tanımlanmasına katkıda bulunabilir. Son yıllarda, allojenik ürünler, daha yüksek etkinlik standartlarını garanti ettikleri için otolog tedavilere alternatif olarak yayılmaktadır; Bunlar arasında, trombositten zengin plazma lizat (PRP-L) göz damlaları basit üretim prosedürleri ile hazırlanır. İtalya'nın AUSL-IRCCS di Reggio Emilia kentindeki transfüzyon tıbbı ünitesinde PRP-L, trombosit-aferez bağışından elde edilir. Bu ürün başlangıçta% 0.9 NaCl'de 0.3 x 10 9 trombosit / mL'ye (ortalama 1 x 109 trombosit / mL konsantrasyonundan başlayarak) seyreltilir. Seyreltilmiş trombositler dondurulur / çözülür ve daha sonra kalıntıları gidermek için santrifüj edilir. Son hacim 1.45 mL alikotlara bölünür ve -80 ° C'de saklanır. Hastalara dağıtılmadan önce, göz damlaları sterilite açısından test edilir. Hastalar trombosit lizatlarını 1 aya kadar -15 ° C'de saklayabilirler. Büyüme faktörü bileşimi rastgele seçilmiş alikotlardan da değerlendirilir ve ortalama değerler burada bildirilir.
Introduction
Kan türevi ürünler yara bakımı1, maksillofasiyal ve ortopedik cerrahide ve kuru göz hastalığı (DED)3 gibi farklı oküler yüzey hastalıklarının2 tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. DED'de, gözyaşı filmi homeostazı, gözyaşı üretimi ve oküler yüzey bütünlüğünde rol oynayan farklı faktörlerin anormal işleyişinin bir sonucu olarak bozulur 4,5.
DED, nedenler ve şiddet 6,7,8'de heterojenlik ile karakterizedir ve yaşlanma, cinsiyet9, kontakt lensler, topikal veya sistemik ilaçlar 10 veya Sjögrensendromu 10 gibi önceden var olan durumlar gibi farklı faktörlerin bir sonucu olabilir. Hafif semptomlara sahip olmasına rağmen, DED dünya çapında milyonlarca insanı etkileyerek yaşam kalitelerini ve sağlık sistemlerini de etkilemektedir6.
Bu patoloji için birçok tedavi bildirilmiştir, ancak en etkili çözüm12 üzerinde hala bir fikir birliği yoktur. Bugüne kadar, yapay gözyaşları, gözyaşı filminin sulu bileşimini restore etmeyi amaçlayan ilk tedavi hattıdır, ancak bu ikameler, doğal gözyaşlarının ana biyolojik olarak aktif solutlarını içermez 6,11. Trombosit bazlı ürünler suni gözyaşlarına12,13 oranında geçerli bir alternatif olarak kabul edilir, ancak klinik etkinlikleri, kullanım önerileri ve preparat yöntemleri hala tartışma konusudur3.
Kan bazlı ürünler, metabolitler14, proteinler, lipitler, vitaminler, iyonlar, büyüme faktörleri (GF'ler), antioksidan bileşikler11 ve ozmolarite (300 mOsm / L) 11 açısından gözyaşları ile benzer bir bileşimi paylaşır. Bileşenlerinin sinerjik aktivitesi sayesinde, kornea epitelinin yenilenmesini teşvik eder, enflamatuar sitokinlerin salınımını inhibe eder ve kadeh hücrelerinin sayısını ve konjonktiva 2,3'teki müsinlerin ekspresyonunu arttırır.
Şimdiye kadar, oftalmik kan bazlı ürünlerdeki heterojenlik literatürde belgelenmiştir; Bu ürünler kan bağışçılarının kökenine, yani otolog veya allojenik olana ve ayrıca kan kaynağına, yani periferik kan, kordon kanı, serum veya trombositlere göre sınıflandırılabilir.
Otolog ürünler en yaygın3 olmasına rağmen, allojenik ürünler artık tercih edilen seçenek haline gelmektedir, çünkü daha yüksek etkinlik ve güvenlik standartları 15 ve maliyetlerde önemli bir azalma sağlamaktadır16,17. Önceki çalışmalar, otoimmün ve / veya sistemik hastalıkları olan hastalardan elde edilen kan bazlı ürünlerin değişmiş kalite ve işlevsellik gösterebileceğini kanıtlamıştır 6,16,17. Serum bazlı göz damlalarının en yaygın olmasına rağmen, trombosit bazlı ürünler son zamanlarda geçerli bir alternatif olarak onaylanmaktadır, çünkü önemli etkinlik seviyelerini korurken kolayca hazırlanabilirler 3,11. Şu anda mevcut trombosit bazlı ürünler, trombositten zengin plazma (PRP), trombositten zengin plazma lizatı (PRP-L) ve büyüme faktörleri bakımından zengin plazma (PRGF)3 olarak ayrılabilir.
Bunlar arasında PRP-L, uzun ömürlü dondurulmuş bir ürün olma avantajına sahiptir. PRP-L, aferez, kabarık paltolar ve hatta süresi dolan trombositlerden (PLT'ler)18,19 hazırlanabilir ve bu da israflarını değerli bir şekilde azaltır. Alikotlar, -80 ° C'de kan transfüzyon merkezlerinde veya hatta hastaların evlerinde -15 ° C'de daha kısa süreler için aylarca saklanabilir.
PRP-L, göz yüzeyi rejenerasyonunu uyardığı kanıtlanmış GF'lerde oldukça zenginleştirilmiştir12,20,21. Bununla birlikte, bu alanda bildirilen çok az sayıda klinik çalışma vardır ve hepsinde otolog kaynaklarkullanılmıştır 3,22. PRP-L, göz yüzeyi hastalıklarının tedavisinde rutin olarak kullanılmadan önce hala daha fazla doğrulama ve karakterizasyona ihtiyaç duymaktadır, çünkü hazırlanması, dağıtılması ve depolanması için standartlaştırılmış bir kılavuz yoktur3.
Burada, İtalya'nın AUSL-IRCCS di Reggio Emilia kentindeki Transfüzyon Tıbbı Ünitesinde kullanılan PRP-L'nin üretimi ve DED'li hastalara dağıtılması için ayrıntılı bir protokol paylaşılmaktadır. Bilimsel topluluğun, dünya çapındaki çalışmalarda ve klinik yaklaşımlarda homojenliği ve tutarlılığı artırabilecek standart hazırlama yöntemleri geliştirmesine yardımcı olmayı amaçlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Büyüme faktörlerinin nicel değerlendirmesi için kullanılan PRP-L, AUSL-IRCCS di Reggio Emilia'da yürütülen ve 10 Ocak 2019 tarihinde Vasta Emilia Nord Etik Komitesi tarafından onaylanan PRP ürünlerinin rejeneratif amaçlar için karakterizasyonu üzerine daha geniş bir çalışmada toplanmıştır (protokol numarası 2019/0003319). Bağışçılar, Helsinki Deklarasyonu'na göre bilgilendirilmiş onaylarını verdiler. Klinisyenler tarafından kuru göz sendromu semptomlarını izlemek için rutin olarak kullanılan Oküler Yüzey Hastalığı İndeksi (OSDI) anketinin toplu, anonim verilerinin toplanması için etik onay gerekli değildi. Şekil 1A , izlenen protokolün bir taslağını gösterirken, Şekil 1B'deki resimler prosedürün ana adımlarını göstermektedir.
1. Trombositten zengin plazma (PRP) toplama
- PRP aferezi
- Bu protokol için, İtalyan yasalarına göre trombosit donörlerini seçin: trombosit donörleri, normal basınç ve kan sayımı parametreleri ve trombosit sayısı 180 x 109 trombosit / L23'ten az olmayan 18-65 yaşları arasında olmalıdır. Uygun donörler, bağıştan önceki 1 hafta içinde antiplatelet veya antikoagülan ilaçlar alamazlar.
- 1 birim tek donörlü trombositten zengin plazma (PRP) elde etmek için üreticilerin talimatlarına ve ulusal yasalaragöre 23 numaralı otomatik bir kan toplama sistemi kullanarak plazma-trombosit-aferez gerçekleştirin. PRP'yi Adenin Sitrat Dekstroz Çözeltisi A (ACD-A) antikoagülan çözeltisinde toplayın.
NOT: Trombosit-aferez sürekli bir prosedürle gerçekleştirilir; toplama süresi 40 dakika ile 90 dakika arasında değişmektedir. Donörlere verilen ACD miktarı ve prosedürlerin zamanı, hematokrit ve iğne göstergesi gibi donör özelliklerine bağlıdır.
- PRP ünitelerinin özellikleri
NOT: Aşağıdaki adım genellikle plazma-trombosit-aferez prosedürü sırasında otomatik kan toplama sistemi tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir. Lütfen üreticinin kullanım kılavuzuna bakın.- Aferez tarafından toplanan PRP ünitelerini, tüm depolama süresi boyunca pH > 6.4'ü korumak için gerekli olan minimum miktarda artık plazma ile yeterli miktarda koruyucu çözelti içinde, antikoagülan çözeltinin ortalama 180 mL'lik net nihai hacmine (yaklaşık 40 mL) kadar askıya alın.
NOT: İtalyan yasalarına göre, kalite kontrolleri trombosit (PLT) sayısının en az 2.0 x 10 11 PLT / birim olduğunu, artık lökositlerin ise 1 x10 6 hücre/birimden az olması gerektiğini değerlendirmelidir. - Lökodelenmiş ve ışınlanmış PRP'yi, daha fazla manipülasyon yapmadan önce bir trombosit çalkalayıcıda 22 °C ± 2 °C'de maksimum 5 gün saklayın23.
- Aferez tarafından toplanan PRP ünitelerini, tüm depolama süresi boyunca pH > 6.4'ü korumak için gerekli olan minimum miktarda artık plazma ile yeterli miktarda koruyucu çözelti içinde, antikoagülan çözeltinin ortalama 180 mL'lik net nihai hacmine (yaklaşık 40 mL) kadar askıya alın.
- PRP seyreltme
- PRP seyreltmeye başlamadan hemen önce, delici bir başak yoluyla ana torbadan toplanan numuneyi kullanarak hemositometre ile bir PLT sayımı yapın.
NOT: Sterilitede sonraki adımları sınıf II biyolojik tehlike başlığı altında gerçekleştirin. İşlem sırasında kişisel koruma ekipmanı (laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlük) giyin. - PRP'yi, periferik kandaki ortalama PLT konsantrasyonunu simüle eden 0.32 x 109 ± 0.03 x 10 9 PLT/mL nihai konsantrasyona kadar yeterli miktarda steril%0.9 NaCl ile seyreltin.
- Kan torbaları için delici bir ani artıştan yararlanarak, seyreltilmiş PRP'yi 300 mL boş toplama torbalarına bölerek net 190 mL/torba hacmine ulaşın.
- Olası mikrobiyal kontaminasyonları değerlendiren kalite kontrolleri yapmak için artık seyreltilmiş PRP'nin (genellikle 1 mL) bir aliquotunu kullanın. Bir mikrobiyoloji laboratuvarında üreticinin talimatlarını izleyerek bir sterilite testi yapın (bkz.
NOT: Küçük hacimli kan örneklerinden aerobik mikroorganizmaların (esas olarak bakteri ve maya) kalitatif kültürünü ve geri kazanımını gerçekleştirebilen aerobik kan kültürlerine özgü kültür şişelerini kullanın. - Seyreltilmiş PRP torbalarını çözülmeden önce en fazla 2 ay boyunca -80 ° C'de saklayın.
- PRP seyreltmeye başlamadan hemen önce, delici bir başak yoluyla ana torbadan toplanan numuneyi kullanarak hemositometre ile bir PLT sayımı yapın.
2. Trombositten zengin plazma lizat (PRP-L) preparatı
- Çözdürme
- Çözme prosedürüne başlamadan önce, ılık bir banyonun 37 ° C'ye ayarlandığından emin olun. PRP torbalarını ılık banyoya koyun ve tamamen çözülene kadar bekleyin.
- PRP-L koleksiyonu
- PRP torbalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj yapın.
NOT: Sonraki adımlar, sınıf II biyolojik tehlike başlığı altında sterilitede gerçekleştirilmelidir. - Transfer torbasının delici çivisinden yararlanarak, santrifüjlü torbayı boş steril 300 mL transfer torbasına bağlayın. PRP-L süpernatını dikkatli bir şekilde, döküntülerden kaçınırken yeni torbaya aktarın. Mümkün olduğunda, bir torba presi kullanın.
- PRP-L ünitesinin bağlantı borusunu bir torba sızdırmazlık elemanı ile kapatın.
- PRP torbalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj yapın.
- PRP-L aliquotetion
NOT: 190 mL PRP içeren bir başlangıç ünitesi (bkz. adım 1.3.3.) iki göz damlası kitini doldurmak için yeterlidir (göz damlalarının kan bileşenlerinden uygulanması ve korunması için kullanılan spesifik tıbbi cihazlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Göz damlası kitleri, anti-bakteriyel filtreyi dışlamak için önceden bağlanmış şırınganın üzerine yerleştirilmiş tüm ip şişeleri ve stopcock'un merkezi oku sola dönük olarak sınıf II bir başlık altında açılmalıdır.- Steril bir şırınga ile 30-60 mL PRP-L toplayın ve şırıngayı dolum hattındaki Luer/lock bağlantısına bağlayın.
- Üreticinin talimatlarına göre, PRP-L içeren şırınga ile önceden bağlanmış şırınga arasındaki çizgiyi açmak için stopcock'u bir dönüşün yarısı kadar çevirin. Önceden bağlanmış şırıngayı PRP-L ile doldurun.
- PRP-L şırıngasının bağlantısını kesin, luer/lock bağlantısının tüp kapağını kapatın ve stopcock'u orijinal konumuna döndürün. Şişeleri PRP-L ile doldurmak için göz damlası kiti şırıngasını kullanın.
- 2.3.1.-2.3.3 arasındaki adımları izleyin. tüm aplikatör şişeleri dolana kadar. Her aplikatörün uygun şekilde doldurulduğundan emin olun, ardından bunları ayrı ayrı bir torba kapatıcı ile kapatın.
- Prosedürü yeni bir göz damlası kiti ile tekrarlayın.
- Olası mikrobiyal kontaminasyonu değerlendirmek için küçük bir artık seyreltilmiş PRP-L aliquot kullanın (bkz. adım 1.3.4.).
NOT: Sıvı yanlışlıkla ipin sonundaki anti-bakteriyel filtreye ulaşırsa, emme şırıngası dirence karşı çıkabilir ve dolguyu engelleyebilir. Doldurma döngüsüne devam etmek için, dizenin sonundaki anti-bakteriyel hidrofobik filtreden yaklaşık 5/6 alikot için dizenin uç bölümünü kaldırın. Bu pozisyonda, zaten hava ile doldurulmuş yeni bir steril şırınga (30 mL hacimli) kullanın. Anti-bakteriyel filtrenin dişi luer'ini / kilidini bağlayın ve kan bileşeninin tüm kalıntılarını gidermek ve anti-bakteriyel filtrenin zarını sıvıdan arındırmak için şırınganın pistonuna sert ve tekrar tekrar bastırın. Şırıngayı çıkarın ve kalan şişeleri doldurun.
- PRP-L depolama
- Her aplikatörü uygun şekilde etiketleyin ve plastik bir torbaya koyun. Plastik torbayı da etiketleyin, donörün kan grubunu vurgulamaya özen gösterin.
- İtalyan yasaları23 ve kılavuz 24'e göre, hasta atanmasından en fazla 24 ay önce −80 ° C'de saklayın.
3. PRP-L dağıtımı
- Hasta atamasını tercihen PRP-L kan grubunu eşleştirerek gerçekleştirin. PRP-L aplikatör şişelerini serin bir kutu kullanarak teslim edin ve her aplikatör şişesinin yaklaşık 45 damlaya karşılık gelen 1,45 mL PRP-L içerdiğinden emin olun. Hastaya, aplikatör şişelerinin hastaların evlerinde -15 ° C'de 1 aya kadar saklanabileceğini söyleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Serum kaynaklı göz damlalarının (göz yüzeyi hastalıklarının tedavisinde en sık kullanılan kan bazlı üründür) kullanımının mantığı, neredeyse tamamen dolaşımdaki trombositlerden elde edilen GF'lerin içeriğinde yatmaktadır. PRP, periferik kan serumuna kıyasla 0.15 x 10 9-0.45 x 109 PLT / mL arasında değişen anlamlı derecede daha fazla trombosit (ve sonuç olarak trombosit kaynaklı GF'ler) içerir. İtalyan yasalarına göre, PRP ünitelerindeki trombosit sayısı en az 0,9 x 10 9-1 x 109 PLT / mL olmalıdır. Bu nedenle, serum göz damlalarının etkinliğini simüle eden bir ürün elde etmek için, PRP, lizat preparasyonundan önce fizyolojik trombosit içeriğine seyreltilmelidir.
Bununla birlikte, doku onarımı esas olarak trombosit kaynaklı GF'ler tarafından yönlendirildiğinden, tek başına PLT sayımı, göz yüzeyi hastalıklarının etkili bir tedavisi için yanıltıcı olabilir. En sık kan kaynaklı göz damlası ile tedavi edilen göz hastalığı olan DED'de gözyaşı filmi üretimi ve homeostazı bozulur. Bu nedenle, DED tedavisi için trombosit bazlı ürünler, gözyaşlarının fizyolojik içeriğini de taklit etmelidir.
Adım 1.3.2'de açıklanan göz yüzeyi hastalıklarının tedavisi için en uygun PRP-L'yi belirlemek. Mevcut protokolde, PLT içeriğine göre (0.7 x 10 9 / mL ile 0.3 x 109 / mL arasında) farklı PRP seyreltmelerini ve göz dokusu onarımında rol oynadığı bilinen bazı temsili GF'leri12,20,21 olarak önceden değerlendirdik.
Trombosit sayımı hemositometre ile yapılırken, GF'ler multipleks protein nicelleştirme testi ile değerlendirildi. Tahlil, üreticinin talimatlarına göre daha önce açıklandığı gibi25 olarak gerçekleştirildi. Bu makalede gösterilen GF'ler, PRP lizatı üzerinde yarı kantitatif bir protein dizisi ile yapılan 36 GF ve GFR'nin ön taramasından sonra nicelleştirme için seçilmiştir. Lumineks miktarı, taranan 36 GF'den 3'ünde gerçekleştirildi: EGF ve PDGF (PRP lizatlarımızda en bol bulunanlar olduğu ortaya çıktı) ve TGFβ-1,2,3 izoformları (içeriğin göz yüzey işlemi için önemli olduğu21). PRP-L22'nin etkinliğini etkileyebilecekleri için EGF ve PDGF içeriği ölçülürken, TGFβ izoformları immün sinyal regualsiyonu21'deki bilinen rolleri için seçildi.
Protein dizileri, farklı PRP26'nın karakterizasyonu üzerine yapılan başka bir in vitro çalışmanın parçası olduğundan, bu veriler bu makalede sunulmamıştır.
İki farklı donörden (D1 ve D2) PRP lizatlarında EGF, PDGF ve TGFβ'yi kantitatif olarak değerlendirdik, daha önce %0.9 NaCl'de 0.7 x 10 9-0.3 x 109 PLT/mL arasında seyreltildi. Şekil 2, gözyaşı bileşimine en çok benzediği ortaya çıkan 0.3 x 109 PLT / mL seyreltmenin sonuçlarını göstermektedir.
0.3 x 109 PLT/mL seyreltme, gözyaşı kompozisyonu ile ilgili literatür verilerine dayanarak seçildi. EGF değerleri ortalama gözyaşı değerine göre oldukça düşük, ancak yine de normallik27 aralığında bulundu. PDGF bile, düşünülen iki donör arasında oldukça değişken olmasına rağmen, normal gözyaşlarında bulunan konsantrasyonla her zaman karşılaştırılabilirdi20. Son olarak, TGFβ-1'in PRP-L'de gözyaşı21'e benzer şekilde en bol izoform olduğu bulunmuştur.
Aferez PRP-L hazırlamak için en uygun PLT seyreltmesi belirlendikten sonra, Transfüzyon Tıp Ünitesi bu ürünleri 2015 yılında göz yüzeyi bozukluklarından etkilenen hastalara dağıtmaya başlamıştır. Göz doktorları, DED semptomlarını izlemek için OSDI anketlerini rutin olarak topladılar; OSDI testi, oküler tahriş algısı ve görme ile ilgili işleyişi nasıl etkilediği gibi yaşam kalitesi ölçümlerini değerlendirir. 1995 yılında Allergan Inc.'deki Outcomes Research Group tarafından oluşturulan ve şimdi DED'i izlemek için geçerli bir araç olarak kabul edilen anket, hastalara sunulmakta ve daha önce tarif edildiği gibi analiz edilmektedir28,29.
Burada, Ocak 2020 ile Ocak 2021 arasında tedavi edilen DED hastalarının OSDI testlerinin toplam sonuçlarını gösteriyoruz (n = 27). PRP-L ile 6 aylık bir tedaviden sonra, OSDI skorları 56 ± 21'den 45 ± 21'e düşerek hastaların yaşam kalitesinde iyileşme olduğunu göstermiştir (Şekil 3).
Bu veriler hala ciddi aralıkta olmasına ve etkinliğin klinik sonuçlarıyla ilgili olmamasına rağmen, DED hastalarının PRP-L'yi oküler rahatsızlığı iyileştiren yararlı bir ürün olarak gördüklerini öne sürmektedirler; Bu husus, oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde etkinliğini değerlendirmeyi amaçlayan prospektif klinik çalışmalarda daha fazla araştırılmalıdır.
Tablo 1'de, mevcut üretim yönteminin, göz damlası30 ve diğer amaçlar için allojenik PRP-L hazırlamak için başka bir yöntemle karşılaştırılması22 sunulmuştur. Bildiğimiz kadarıyla, Zhang'ın30 protokolü ve mevcut protokolü, göz yüzeyi için PRP-L üretmek için yayınlanmış tek yöntemlerdir. Her ikisinde de PRP-L aferezden elde edilir; PRP-L üretimini iyileştirmek için esas olarak donma ve çözülme döngülerinin sayısı ve santrifüjleme adımları ile ilgili iki protokol arasındaki farklar karşılaştırılmalıdır. Bununla birlikte, bu metodolojik farklılıkların diğer dokular üzerinde test edilen PRP-L'nin rejeneratif kapasitesine zararlı olduğu kanıtlanmamıştır22.
Şekil 1: PRP-L'nin hazırlanması için protokolün ana adımları. (A) PRP toplanmasından PRP-L'nin hazırlanmasına ve dağıtılmasına kadar protokolün şeması. (B) Protokollerin ana adımlarının temsili resimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PRP-L'nin 0.3 x 109/mL seyreltilmesi için trombosit kaynaklı büyüme faktörlerinin Luminex miktarının belirlenmesi (A) Epidermal büyüme faktörü (EGF); (B) trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF); (C) dönüştürücü büyüme faktörü-beta izoform 1 (TGFβ1); (D) dönüştürücü büyüme faktörü-beta izoform 2 (TGFβ2); (E) dönüştürücü büyüme faktörü-beta izoform 3 (TGFβ3). Değerler, üç bağımsız ölçümün standart sapması ± ortalama olan pg/mL olarak ifade edilir. D1 ve D2 iki farklı trombosit donörüdür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AUSL-IRCCS di Reggio Emilia'nın Oftalmoloji Ünitesinde Ocak 2020 ile Ocak 2021 arasında PRP-L ile tedavi edilen DED hastalarının toplam OSDI skorları. N = 27 hasta. OSDI skoru toplam sonuçları ortalama ± standart hata olarak temsil edilir, p-değeri veri analiz yazılımı ile eşleştirilmiş bir t-testi ile hesaplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bu makale | Göz için PRP-L (in vitro çalışma)29 | Diğer amaçlar için PRP-L21 | |
| Kaynak | PLT aferezi | PLT aferezi | Aferez ve tam kan |
| Donma ve çözülme döngüleri | 1 (-80 °C'de) | 2 (-80 °C'de) | 1-3 (-20 °C ve -80 °C'de) |
| Depolama sıcaklığı | -80 °C'de | -80 °C'de | -20 °C ve -80 °C'de |
| Depolama öncesi santrifüj hızı | 3000 x g/30 dk | 3500 x g/30 dk | 400-3000 x g/6 dk -30 dk |
| Depolama öncesi filtreleme | Hayır | Evet | Hayır/Evet |
Tablo 1: Aferez ile toplanan trombosit bazlı ürünlerden allojenik PRP-L hazırlama protokollerinin karşılaştırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, trombosit bazlı ürünlerin oküler yüzey patolojileri için klinik kullanımı artmıştır, ancak bilimsel sağlamlık eksikliği nedeniyle difüzyonları engellenmektedir. Bunun temel nedeni, donör kaynaklarındaki ve hazırlama protokollerindeki geniş heterojenliktir, bunlar genellikle tam olarak açıklanmayan veya dağıtıldıkları amaç için özel olarak tasarlanmamıştır. Özellikle aferez tarafından toplanan trombosit bazlı ürünler hakkında bilgi halen eksiktir. Bu nedenle bu çalışmanın amacı, ader ile elde edilen trombositten zengin plazma lizatlarının (PRP-L) DED tedavisi için adım adım işlenmesini tanımlamaktır.
PRP-L, diğer kan bazlı ürünlerden daha fazla GF içerdiğinden22 göz damlası üretimi için en uygun kaynaktır ve serum veya PRP ile karşılaştırıldığında, üretimi veya depolanması ucuz ve basittir. PRP-L'yi elde etmek için, trombositler içeriklerini serbest bırakmak için lizise (genellikle bir veya daha fazla donma ve çözülme döngüsü yoluyla) maruz bırakılır. Bu işlem, doku yenilenmesini uyaran aktif moleküllerle zenginleştirilmiş bir çözeltiyi garanti eder22,26. PRP-L 22 ile giderek artan sayıda hastalık tedavi edilmekle birlikte, trombosit toplama ve PRP-Lüretimindeki düşük standardizasyon kriterleri 3,22 nedeniyle oftalmolojide kullanım endikasyonu hala zayıftır.
Allojenik trombosit bazlı ürünler, otolog olanlara göre hem donör özellikleri hem de hazırlama yöntemi açısından daha standartlaştırılabilir olduklarından tercih edilmelidir. Hastanın sağlık durumu ürünün kalitesini etkileyebilir 6,16,17, transfüzyon hizmetleri doğrudan mevcut olmadığında tam kandan otolog trombositleri toplamak için kurum içi kitler transfüzyon tıbbında istenen standart kaliteyi karşılamamaktadır31.
Bildiğimiz kadarıyla, oftalmolojide allojenik PRP-L'nin kullanımını karakterize eden hiçbir klinik çalışma yoktur 3, otolog PRP-L göz damlası3 ile ilgili az sayıda rapor ve göz yüzeyi hastalıkları olan hastaları tedavi etmek için kordon kanından elde edilen allojenik PRP-L'nin kullanıldığı sadece bir çalışma32. Her ne kadar allojenik PRP-L klinik kılavuz24'te listelenmiş ve kullanımı 3,30 önerilmiş olsa da, diğer tedavilere ve diğer kan bazlı ürünlere (örneğin, serum) kıyasla etkinliği konusunda hala kanıt eksikliği vardır. Burada sunulan protokol, bilim camiasının ortak üretim yöntemleri geliştirmesine yardımcı olmayı ve metodolojik farklılıklara ışık tutmayı amaçlamaktadır.
Burada aferez ile toplanan allojenik PRP'den başlayan PRP-L üretimini anlattık. Trombosit lizatları elde etmek için trombosit bazlı allojenik ürünler de buffy-coat'lardan (BC'ler) toplanabilir ve her iki kaynak da eşit olarak bildirilmiştir31. BC'ler havuzlanmış donörlerden (genellikle dört veya beş) elde edilir, böylece bireyler arası farklılıkları en aza indirir. Tersine, havuzlama, enfeksiyöz ajanları veya prionları iletme veya allojenik bir yanıtı uyarma riskini arttırır31,33. Aferez karmaşık ve invaziv bir prosedürdür ve bağışçıların sadece küçük bir kısmı buna uygun veya uyumludur34. Bununla birlikte, aferez ile elde edilen trombosit bazlı ürünler, diğer artık dolaşımdaki kan hücrelerinden arındırılmıştır ve daha yüksek miktarda PLT içerir35. Bu nedenlerden dolayı, mevcut çalışma PRP-L'yi bu iki farklı kaynaktan karşılaştırmak için klinik çalışmalar geliştirmeye odaklanmıştır.
Bu protokolde, aferez tarafından toplanan PRP ünitelerindeki PLT'lerin başlangıç konsantrasyonu ortalama 1 x 109 / mL idi, bu da diğer trombosit bazlı ürünler için bildirilen konsantrasyonlarla tutarlıdır22. Bu yöntemde, PLT'ler daha sonra% 0.9 NaCl çözeltisi ile 0.3 x 109 / mL'ye seyreltilir. Diğer protokoller seyreltme için plazma kullanımını bildirmektedir22.
PRP-L'nin oftalmolojide kullanımını az sayıda çalışma bildirmiştir; Bu olgularda otolog göz damlaları 0.5 x 10 9/mL-1 x 109/mL36,37,38 arasında değişen PLT konsantrasyonlarında hazırlandı. Daha önce de tartışıldığı gibi, standardizasyon belirteçleri arzu edilir ve ayrıca uygun seyreltmenin belirlenmesinde yardımcı olur. Burada, örneğin, PRP-L'deki bazı önemli GF'lerin konsantrasyonunu bildiriyoruz. EGF ve PDGF içeriği PRP-L22'nin etkinliğini etkilerken, TGFβ izoformları immün sinyal 21,39'un düzenlenmesinde rol oynar ve konsantrasyonları ince bir şekilde düzenlenir. Bu nedenle, trombosit bazlı göz damlalarındaki TGFβ konsantrasyonu sadece etkinliği etkilemekle kalmaz, aynı zamanda potansiyel zararlı etkileri de ortaya çıkarabilir39; Bu nedenle, uygun seyreltmeyi tanımlamadan önce dikkatlice araştırılmalıdır. Bununla birlikte, seçilen seyreltme -0.3 x 109 PLT/mL-,gözyaşı 21,25'teki GFs içeriğine dayanıyordu. Zhang ve ark. daha önce hem otolog hem de allojenik serum bazlı göz damlalarını ve trombosit bazlı lizatları GF'lerdeki içerikleri ve kornea hücrelerinin in vitro30 rejenerasyonunu teşvik etme yetenekleri açısından karşılaştırdılar. Çalışma, bu ürünlerin PRP-L'nin daha yüksek EGF konsantrasyonuna sahip ancak daha düşük fibronektin ile karşılaştırılabilir özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Protokollerinde, dondurma / çözülme işlemi iki kez tekrarlandı, santrifüj 30 dakika boyunca 3500 x g'de gerçekleştirildi ve trombosit lizatı -80 ° C30'da saklandı.
Donma ve çözülme gerçekten kritik bir adımdır; protokollerin çoğu (bu da dahil olmak üzere) -80 ° C dondurma ve 37 ° C çözülme ile geliştirilmiştir, ancak donma da -24 ° C, -196 ° C ve -150 ° C 22,33 arasında bildirilmiştir. Sınırlı sayıda çalışma da trombosit lizatları elde etmek için sonikasyon veya çözücü / deterjan tedavisi bildirmiştir22,33. PRP-L'nin hazırlanmasında daha önce bildirilen diğer metodolojik değişkenler, 300 x g ile 10000 x g arasında, 2 dakikadan 60 dakikaya kadar santrifüjleme adımı ve benzer ürünlerin doğrudan -20 ° C22'de depolanmış olmasına rağmen, çoğu durumda -80 ° C'de olan uzun süreli depolama ile ilgilidir. Özellikle depolama koşulları, lizatlarda bulunan GF'lerin mevcudiyetini ve aktivitesini etkileyebileceğinden dikkatle izlenmelidir. Bu son derece heterojen bağlamda, biyojenik faktörlerin salınımı ve terapötik etkideki farklılıklar dikkate alınarak kalite kontrolleri ve klinik çalışmalar acilen değerlendirilmelidir.
Son olarak, burada bu yöntemin 6 ay boyunca PRP-L alan kuru göz hastalığı olan hastaların toplu analizinden elde edilen olumlu bir sonuçla nasıl anlamlı bir şekilde değerlendirildiğini gösteriyoruz (OSDI anketi3). Umut verici olmakla birlikte, OSDI tek başına DED ve diğer oküler yüzey hastalıklarının tedavisinde PRP-L'nin etkinliğini belirlemek için yeterli değildir ve allojenik PRP-L'nin kullanımı ile ilgili klinik çalışmalar gereklidir. Ayrıca, metodolojik prosedürü optimize etmek için alternatif metodolojik adımlardan (örneğin, dondurma ve çözme, santrifüjleme, depolama) kaynaklanan olası ürün bileşimi farklılıkları karşılaştırılmalıdır.
Sonuç olarak, kan kaynaklarının ve protokollerin yüksek heterojenliği, kan bazlı ürünlerin oküler yüzey hastalıklarının klinik tedavisine kesin olarak çevrilmesini hala engellemektedir. PRP-L, bazı avantajlı özelliklere sahip gelişmekte olan bir ürün olmasına rağmen, kullanımını doğrulamak ve ortak kılavuzlar geliştirmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Hazırlık protokolünün paylaşılması ve detaylandırılması, kullanılabilirliği artırabilir ve kritik adımlara ışık tutabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, donör kaynaklı trombosit konsantreleri sağladığı için "Casa del Dono di Reggio Emilia" ya teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CompoSeal Mobilea II | Fresenius Kabi, Germany | bag sealer | |
| HeraSafe hood | Heraeus Instruments, Germany | Class II biohazard hood | |
| MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System | Haemonetics, Italy | automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components | |
| Platelet shaker, PF396i | Helmer, USA | Platelet shaker | |
| Raycell X-ray Blood Irradiator | MDS Nordion, Canada | X-ray Blood Irradiator | |
| ROTIXA 50RS | Hettich Zentrifugen, Germany | High speed entrifuge | |
| Sysmex XS-1000i | Sysmex Europe GMBH, Germany | haemocytometer for platelet count | |
| Warm bath, WB-M15 | Falc Instruments, Italy | Warm bath | |
| Materials | |||
| ACD-A anticoagulant solution A | Fenwal Inc., USA | DIN 00788139 | anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml) |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | BD 442020 | Sterility assay |
| BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials | BD Biosciences, USA | 442020 | At least 2 vials for sterility assay |
| BD Luer Lok Syringe | BD Plastipack, USA | 300865 | At least 4 sterile syringes (50 ml) |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 1 | BioRad Laboratories, USA | 171AC500M | Standard panel for PDGF isoforms assessment |
| Bio-Plex Human Cancer Panel 2 | BioRad Laboratories, USA | 171AC600M | Standard panel for EGF assessment |
| Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad Laboratories, USA | Magpix | This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads. |
| Bio-Plex Pro TGF-b Assay | BioRad Laboratories, USA | 10024984 | Set and standards for TGFb isoforms assessment |
| BioRet | ARIES s.r.l., Italy | A2DH0020 | At least 4 piercing spike for blood bags |
| Blood collection tube | BD Vacutainer, USA | 367835 | 1 tube, necessary to perform platelet counts |
| Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents | Biomed Device s.r.l., Italy | COLC50 | Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected |
| Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC511 | Set for PDGF isoforms assessment |
| Human Cancer2 EGF Set 1x96well | BioRad Laboratories, USA | 171BC603M | Set for EGF assessment |
| NaCl 0.9% sterile solution | Baxter S.p.A., Italy | B05BB01 | 1000 ml |
| OSDI Questionnaire | Allergan Inc., USA | OSDI | Ocular Surface Disease Index Questionnaire |
| Piercing spike | BioRet ARIES s.r.l., Italy | BS051004 | Spike |
| Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ | TERUMO BCT Inc., Italy | 40842 | preservative solution for platelet concentrates (1000 ml) |
| Software Excel | Microsoft, USA | Excel | Data analysis software |
| Teruflex Transfer bag 1000 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*T100BM | 1 for PRP dilution |
| Teruflex Transfer bag 300 ml | TERUMO BCT Inc., Italy | BB*030CM | At least 6 for each PRP unit collected |
References
- Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
- Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
- Clayton, J. A.
- Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
- Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
- Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
- Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
- Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
- Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
- Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
- Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
- Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
- Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
- Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
- Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
- Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
- Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
- Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
- Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
- Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
- Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
- Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
- Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
- Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
- Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
- Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
- Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
- Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
- Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
- Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
- Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
- Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
- Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
- Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
- Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
- De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).
