Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isogen nyre glomerulus chip konstruert fra humant induserte pluripotente stamceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63821
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

Summary

Presentert her er en protokoll for å konstruere et personlig organ-on-a-chip-system som rekapitulerer strukturen og funksjonen til nyreglomerulær filtreringsbarriere ved å integrere genetisk matchede epitel- og vaskulære endotelceller differensiert fra humaninduserte pluripotente stamceller. Dette bioengineered systemet kan fremme nyre presisjon medisin og relaterte applikasjoner.

Abstract

Kronisk nyresykdom (CKD) påvirker 15% av den amerikanske voksne befolkningen, men etableringen av målrettede terapier har blitt begrenset av mangelen på funksjonelle modeller som nøyaktig kan forutsi menneskelige biologiske responser og nefrotoksisitet. Fremskritt i nyre presisjon medisin kan bidra til å overvinne disse begrensningene. Tidligere etablerte in vitro-modeller av humane nyreglomerulus - det primære stedet for blodfiltrering og et sentralt mål for mange sykdommer og narkotikatoksisiteter - bruker imidlertid heterogene cellepopulasjoner med begrensede funksjonelle egenskaper og uovertruffen genetisk bakgrunn. Disse egenskapene begrenser deres anvendelse betydelig for pasientspesifikk sykdomsmodellering og terapeutisk oppdagelse.

Dette papiret presenterer en protokoll som integrerer humant indusert pluripotent stamme (iPS) celleavledet glomerulært epitel (podocytter) og vaskulært endotel fra en enkelt pasient for å konstruere en isogen og vaskularisert mikrofluidisk nyreglomerulus-chip. Den resulterende glomerulus-brikken består av stamcelleavledede endotel- og epitelcellelag som uttrykker avstamningsspesifikke markører, produserer kjellermembranproteiner og danner et vev-vevsgrensesnitt som ligner nyrenes glomerulære filtreringsbarriere. Den konstruerte glomerulusbrikken filtrerer selektivt molekyler og rekapitulerer legemiddelindusert nyreskade. Evnen til å rekonstituere strukturen og funksjonen til nyreglomerulus ved hjelp av isogene celletyper skaper muligheten til å modellere nyresykdom med pasientspesifisitet og fremme bruken av organer-på-chips for nyrepresisjonsmedisin og relaterte applikasjoner.

Introduction

Organ-on-a-chip-enheter er dynamiske 3D in vitro-modeller som benytter molekylær og mekanisk stimulering, samt vaskularisering, for å danne vev-vevsgrensesnitt som modellerer strukturen og funksjonen til bestemte organer. Tidligere etablerte organ-on-a-chip-enheter som hadde som mål å rekapitulere nyrens glomerulus (glomerulus-chips) besto av dyrecellelinjer1 eller menneskelige primære og udødelige cellelinjer av heterogene kilder 2,3. Bruken av genetisk heterogene cellekilder presenterer variasjoner som signifikant begrenser studiene av pasientspesifikke responser og genetikk eller sykdomsmekanismer 4,5. Å adressere denne utfordringen avhenger av tilgjengeligheten av isogene cellelinjer som stammer fra spesifikke individer med bevarte molekylære og genetiske profiler for å gi et mer nøyaktig mikromiljø for engineering in vitro-modeller 2,3,6. Isogene cellelinjer av menneskelig opprinnelse kan nå enkelt genereres på grunn av fremskritt i human iPS-cellekultur. Fordi menneskelige iPS-celler vanligvis er ikke-invasivt hentet, kan fornye seg på ubestemt tid og differensiere til nesten hvilken som helst celletype, tjener de som en attraktiv kilde til celler for etablering av in vitro-modeller, for eksempel glomerulus-brikken 7,8. Den glomerulære filtreringsbarrieren er det primære stedet for blodfiltrering. Blod filtreres først gjennom vaskulært endotel, den glomerulære kjellermembranen, og til slutt gjennom spesialisert epitel kalt podocytter. Alle tre komponentene i filtreringsbarrieren bidrar til selektiv filtrering av molekyler. Presentert her er en protokoll for å etablere en organ-on-a-chip-enhet forbundet med vaskulært endotel og glomerulært epitel fra en enkelt human iPS-cellekilde. Selv om denne protokollen er spesielt nyttig for å konstruere en isogen og vaskularisert chip for å rekapitulere den glomerulære filtreringsbarrieren, gir den også en blåkopi for å utvikle andre typer personlige organer-på-chips og multiorganplattformer som et isogent 'body-on-a-chip' system.

Protokollen beskrevet her begynner med divergerende differensiering av humane iPS-celler i to separate linjer - laterale mesoderm- og mesodermceller, som deretter differensieres til henholdsvis vaskulært endotel og glomerulært epitel. For å generere laterale mesodermceller ble humane iPS-celler sådd på kjellermembranmatrise 1-belagte plater og dyrket i 3 dager (uten medieutveksling) i N2B27-medium supplert med Wnt-aktivatoren, CHIR 99021, og den potente mesoderminduktoren, beinmorfogenetisk 4 (BMP4). De resulterende laterale mesodermcellene ble tidligere preget av ekspresjon av brachyury (T), blandet parlignende homeobox (MIXL) og eomesodermin (EOMES)9. Deretter ble de laterale mesodermcellene dyrket i 4 dager i et medium supplert med VEGF165 og Forskolin for å indusere vaskulære endotelceller som ble sortert ut basert på VE-Cadherin og / eller PECAM-1-uttrykk ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS). De resulterende vaskulære endotelceller (viEC) ble utvidet ved å dyrke dem på kjellermembranmatrise 3-belagte kolber til de var klare til å frø i den mikrofluidiske enheten.

For å generere mesodermceller ble humane iPS-celler sådd på kjellermembranmatrise 2-belagte plater og dyrket i 2 dager i et medium som inneholder Activin A og CHIR99021. De resulterende mesodermcellene ble karakterisert ved ekspresjon av HAND1, goosecoid og brachury (T) som beskrevet tidligere 2,10,11. For å indusere intermediær mesoderm (IM) celledifferensiering ble mesodermcellene dyrket i 14 dager i et medium supplert med BMP-7 og CHIR99021. De resulterende IM-cellene uttrykker Wilms tumor 1 (WT1), parret boksgen 2 (PAX2) og odde-hoppet relatert protein 1 (OSR-1) 2,10,11.

En tokanals polydimetylsiloksan (PDMS)-basert mikrofluidisk chip ble designet for å rekapitulere strukturen til den glomerulære filtreringsbarrieren in vitro. Urinkanalen er 1,000 μm x 1,000 μm (w x h) og kapillærkanaldimensjonen er 1,000 μm x 200 μm (w x h). Sykliske strekk- og avslapningssykluser ble tilrettelagt av de hule kamrene som var tilstede på hver side av væskekanalene. Cellene ble sådd på en fleksibel PDMS-membran (50 μm tykk) som skiller urin- og kapillærkanalene. Membranen er utstyrt med sekskantede porer (7 μm diameter, 40 μm fra hverandre) for å bidra til å fremme intercellulær signalering (figur 1A) 2,12. To dager før IM-induksjonen var fullført, ble de mikrofluidiske brikkene belagt med kjellermembranmatrise 2. viECs ble sådd inn i kapillærkanalen til den mikrofluidiske brikken ved bruk av endotelvedlikeholdsmedium 1 dag før IM-induksjonen var fullført, og brikken ble snudd opp ned for å muliggjøre celleadhesjon på basalsiden av den ECM-belagte PDMS-membranen. På dagen IM-induksjonen ble fullført, ble cellene sådd inn i urinkanalen til den mikrofluidiske brikken ved hjelp av et medium supplert med BMP7, Activin A, CHIR99021, VEGF165 og all transretinsyre for å indusere podocytdifferensiering i brikken. Dagen etter ble mediereservoarene fylt med podocyttinduksjonsmedium og endotelvedlikeholdsmedium, og 10 % mekanisk belastning ved 0,4 Hz og væskestrøm (60 μL/t) ble påført brikkene.

De cellulariserte mikrofluidiske sjetongene ble dyrket i ytterligere 5 dager ved bruk av Podocyte Induction medium (i urinkanalen) og Endothelial Maintenance medium (i vaskulær kanal). De resulterende nyreglomeruluschipsene ble dyrket i opptil 7 ekstra dager i vedlikeholdsmedier for både podocytt- og endotelcellene. De differensierte podocyttene uttrykte positivt avstamningsspesifikke proteiner, inkludert podocin og nefin 13,14, mens viECs positivt uttrykte avstamningsidentifikasjonsproteinene PECAM-1 og VE-Cadherin, som alle er essensielle molekyler for å opprettholde integriteten til den glomerulære filtreringsbarrieren 15,16 . Podocytter og viECs ble begge funnet å utskille det mest omfattende glomerulære kjellermembranproteinet, kollagen IV, som også er viktig for vevsmodning og funksjon.

Trekomponentsystemet til filtreringsbarrieren - endotel, kjellermembran og epitel - i glomerulus-sjetongene ble funnet å selektivt filtrere molekyler og reagere på en kjemoterapeutisk, nefrotoksisk medikamentbehandling. Resultater fra legemiddelbehandlingen indikerte at glomerulusbrikken kan brukes til nefrotoksisitetsstudier og til sykdomsmodellering. Denne protokollen gir den generelle retningslinjen for prosjektering av en funksjonell mikrofluidisk nyreglomerulusbrikke fra isogene iPS-cellederivater. Nedstrømsanalyser av den konstruerte brikken kan utføres etter ønske fra forskeren. For mer informasjon om bruk av glomerulusbrikken til å modellere medikamentindusert glomerulær skade, se tidligere publikasjoner 2,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forbered kjellermembranmatriseløsninger og belagte underlag

  1. Tin kjellermembranmatrise 1 over natten på is ved 4 °C. Aliquot i henhold til produsentens forslag til fortynningsforhold. Bruk et 50 ml konisk rør og pipette, bland grundig en passende mengde kjellermembranmatrise 1 i 25 ml kald DMEM / F12 til den er helt tint og oppløst.
    1. For å oppløse en frossen aliquot, ta ~ 200 μL fra 25 ml kald DMEM / F12 og overfør den til det frosne aliquotrøret. Pipette opp og ned til matrisen er grundig tint og oppløst. Overfør hele rørinnholdet i kjellermembranmatrise 1 til resten av den kalde DMEM/F12.
  2. Pipette 1 ml kjellermembranmatrise 1 løsning i hver brønn i en 6-brønns plate. For å bruke de belagte platene samme dag, inkuber ved 37 °C i 2 timer.
    1. Alternativt kan de belagte platene pakkes inn med parafilm og oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker. Når du er klar til å bruke den lagrede platen, inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
  3. Fortynn kjellermembranmatrise 2 i 9 ml sterilt destillert vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 5 μg / ml. Pipette 700 μL kjellermembranmatrise 2-løsning i hver brønn i en 12-brønnsplate. Pakk kjellermembranmatrisen 2-belagte plater med parafilm og oppbevar ved 4 °C i opptil 2 uker.
  4. Rekonstituer lyofilisert kjellermembranmatrise 3 for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 mg / ml i fosfatbufret saltvann (PBS, Ca + 2 og Mg + 2-fri) som foreslått av produsenten. Fortynn en 250 μL aliquot til en endelig konsentrasjon på 25 μg/ml i 9,75 ml PBS (Ca+2 og Mg+2 fri). Bruk 6 ml av denne oppløsningen til å belegge en T75-kolbe (en endelig konsentrasjon på 2 μg/cm2). Oppbevar de matriksbelagte kolbene ved 4 °C i opptil 1 uke.

2. Menneskelig iPS-cellekultur

MERK: DU11-linjen som brukes i denne protokollen ble testet og funnet å være fri for mykoplasma og karyotype abnormiteter.

  1. Inkuber kjellermembranmatrise 1-belagte plater ved 37 ° C i 1-2 timer.
  2. Vask hver brønn på 6-brønnsplaten 3x med 1 ml varm (37 °C) DMEM/F12. Tilsett 2 ml humant iPS-cellekulturmedium (CCM) (tilleggstabell S1) til hver brønn i 6-brønnsplaten. Inkuber platene ved 37 °C mens cellene klargjøres for såing som beskrevet nedenfor.
  3. Vask hver brønn på 6-brønnsplaten som inneholder humane iPS-celler med 1 ml varm DMEM/F12.
  4. Aspirer DMEM/F12. Tilsett 1 ml varmcelle løsrivelsesbuffer til hver brønn i 6-brønnsplaten. Inkuber ved 37 °C i 1 min.
  5. Inspiser visuelt hver brønn under et mikroskop for dissosiasjon rundt cellekolonikantene. Aspirer forsiktig celleoppløsningsbufferen fra cellene. Vask hver brønn forsiktig med 1 ml varm DMEM/F12.
  6. Inspiser platene under mikroskopet for å sikre at cellene ikke har løsnet helt fra platen eller blitt aspirert ved et uhell.
  7. Tilsett 3 ml varm human iPS CCM til hver brønn i 6-brønnsplaten med celler. Bruk en celleløfter til å skrape koloniene forsiktig. Bruk en 5 ml serologisk pipette til å blande cellesuspensjonen forsiktig i hver brønn opp og ned én gang.
  8. Ta ut den nye kjellermembranmatrisen 1-belagt plate fra inkubatoren. Overfør 0,5 ml av cellesuspensjonen til hver brønn i den nye kjellermembranmatrisen 1-belagt plate. Flytt platen i en åttetallsbevegelse for å fordele cellene jevnt. Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator.
  9. Aspirer det brukte mediet og erstatt med 3 ml human iPS CCM hver kulturdag til cellene er 70% konfluente (ca. 4 dager etter passasje).

3. Dag 0-16: differensiering av humane iPSC-er i mellomliggende mesodermceller

  1. Dag 0-2: mesoderm induksjon
    1. Flytt kjellermembranmatrise 2-belagte plater fra 4 ° C til romtemperatur i 2 timer for å balansere etter lagring.
    2. Aspirer det brukte mediet fra hver brønn i 6-brønnsplaten som inneholder ca. 70% konfluente humane iPS-celler. Vask cellene forsiktig 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    3. Aspirer DMEM/F12. Tilsett 1 ml celleoppløsningsbuffer til hver brønn i 6-brønnsplaten av humane iPS-celler. Inkuber ved 37 °C i 5-7 min.
    4. Inspiser visuelt hver brønn under et mikroskop for dissosiasjon rundt cellekolonikantene. Bruk en celleløfter til å skrape koloniene forsiktig.
    5. Overfør cellesuspensjonene fra alle brønnene i 6-brønnsplaten til et 15 ml konisk rør og bruk en P1000 til pipette opp og ned flere ganger for å oppnå en encellet suspensjon av iPS-cellene.
    6. Fyll cellesuspensjonen i det koniske røret til 14 ml med DMEM/F12. Sentrifuge i 5 min ved 200 × g ved romtemperatur.
    7. Aspirer supernatanten. Resuspender cellepelleten i 14 ml varm DMEM/F12. Gjenta sentrifugering i 5 minutter ved 200 × g ved romtemperatur.
    8. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml Mesoderm Induksjonsmedium (tilleggstabell S1). Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn i Mesoderm Induksjonsmedium for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 × 105 celler/ml.
    9. Aspirer belegget fra kjellermembranmatrisen 2-belagt plate. Skyll hver brønn i kjellermembranmatrisen 2-belagt plate 2x med 1 ml varm DMEM/F12.
    10. Pipette cellesuspensjonen forsiktig opp og ned 2x. Overfør 1 ml av cellesuspensjonen til hver brønn i kjellermembranmatrisen 2-belagt plate. Beveg platen forsiktig i en åttetallsbevegelse for å fordele cellene jevnt.
    11. Inkuber tallerkenen ved 37 °C over natten. Neste dag (dag 1), aspirer det brukte mediet fra hver brønn i 12-brønnsplaten. Bytt ut med 1 ml varmt Mesoderm Induksjonsmedium. Inkuber ved 37 °C over natten.
  2. Dag 2-16: intermediær mesoderminduksjon
    1. Aspirer det brukte Mesoderm Induksjonsmediet. Bytt ut med 1m L varmt Intermediate Mesoderm Induksjonsmedium (tilleggstabell S1). Aspirer det brukte mediet og erstatt med 1 ml varmt mellomliggende mesoderm induksjonsmedium hver dag i 14 dager.

4. Dag 0-15: differensiering og utvidelse av humane iPSCs til vaskulære endotelceller

  1. Dag 0: human iPS-cellesåing
    1. Klargjør 15 ml human iPS CCM med ROCK-hemmer (supplerende tabell S1). Oppbevares ved 37 °C.
    2. Inkuber en kjellermembranmatrise 1-belagt plate i 1-2 timer ved 37 °C. Aspirer kjellermembranmatrisen 1. Vask 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    3. Aspirer DMEM/F12. Tilsett 2 ml human iPS CCM med ROCK Inhibitor til hver brønn i 6-brønnsplaten. Inkuber platene ved 37 °C mens cellene klargjøres for såing som beskrevet nedenfor.
    4. Aspirer det brukte mediet fra hver brønn i 6-brønnsplaten som inneholder ca. 70% konfluente humane iPS-celler. Vask cellene forsiktig 3x med 1 ml varm DMEM/F12.
    5. Aspirer DMEM/F12. Tilsett 1 ml celleoppløsningsbuffer til hver brønn i 6-brønnsplaten av humane iPS-celler. Inkuber ved 37 °C i 5-7 minutter for å dissosiere cellene i enkeltceller.
      MERK: På grunn av iboende forskjeller mellom iPS-cellelinjer, må brukeren visuelt inspisere cellene etter 5 minutter for å bestemme den optimale inkubasjonstiden.
    6. Overfør cellene til et 15 ml konisk rør. Bring cellesuspensjonen opp til 14 ml med varm DMEM/F12 for å nøytralisere løsrivelsesbufferen. Sentrifuge i 5 min ved 200× g ved romtemperatur.
    7. Aspirer supernatanten forsiktig. Resuspender cellene i 1 ml human iPS CCM med ROCK-hemmer. Tell totalt antall celler ved hjelp av et hemocytometer.
    8. Frø cellene mellom 37.000 til 47.000 celler / cm2 (355.200 til 451.200 celler / brønn av en 6-brønns plate). Inkuber ved 37 °C over natten.
      MERK: På grunn av iboende forskjeller mellom iPS-cellelinjer, må brukeren bestemme den optimale såtettheten.
  2. Dag 1-3: lateral mesoderminduksjon
    1. Neste dag (dag 1), aspirer det brukte mediet fra hver brønn i 6-brønnsplaten av humane iPS-celler. Bytt ut hver brønn i 6-brønnsplaten med 5 ml lateralt mesoderm induksjonsmedium (tilleggstabell S1). Når du skalerer opp kulturbeholderen (f.eks. Kolber), erstatt vanligvis med 3x arbeidsvolumet i kulturbeholderen.
    2. Ikke endre dette mediet i 3 dager.
      MERK: Lateral Mesoderm Induksjonsmedium i brønnene vil normalt skifte farge fra rødt til gult etter hvert som cellene bruker opp næringsstoffene. Grumsete medium eller medium med bakterievekst er imidlertid ikke normalt og bør dekontamineres og kastes som sådan.
  3. Dag 4-6: endotelcelleinduksjon
    1. Aspirer det brukte mediet fra hver brønn i 6-brønnsplaten. Bytt ut hver brønn i 6-brønnsplaten med 3 ml varmt endotelinduksjonsmedium (tilleggstabell S1). Inkuber tallerkenen ved 37 °C over natten.
    2. I de følgende 2 dagene (dag 5 og 6), samle det brukte mediet fra alle brønner i et 50 ml konisk rør. Oppbevar det koniske røret ved 4 °C. Fyll på cellene med 3 ml varmt endotelinduksjonsmedium. Inkuber platen ved 37 °C.
  4. Dag 7: sortering av endotelceller (viEC)
    1. Ta ut kjellermembranmatrise 3 kolber og la stå i romtemperatur i 1 time.
    2. Forbered 50 ml MACS-buffer (tilleggstabell S1).
    3. Plasser celleløsningsbuffer, MACS-buffer, endotelial CCM og PBS (Ca 2+ og Mg2+ fri) på is i vevskulturhetten.
    4. Plasser magneten på MACS-stativet. Plasser to 50 ml koniske rør og ett 15 ml konisk rør i en konisk rørholder.
    5. Plasser MACS-stativet (med magnet festet) og en LS-kolonne i vevskulturhetten. Sett opp den koniske rørholderen (med koniske rør inni) på MACS-stativet, under magneten (tilleggsfigur S1A).
    6. Samle det brukte mediet fra hver brønn i 6-brønnsplaten inn i 50 ml konisk rør fra trinn 4.3.2. Vask hver brønn på 6-brønnsplaten med PBS (fri for Ca 2+ og Mg2+).
    7. Aspirer PBS. Legg til 1 ml celleoppløsningsbuffer. Inkuber ved 37 °C i 5-7 minutter for å dissosiere cellene helt.
    8. Overfør cellene til et 50 ml konisk rør. Ta cellesuspensjonen til 15 ml med kald endotel-CCM. Sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
    9. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 1 ml kald MACS-buffer. Tell cellene med et hemocytometer.
    10. Tilsett 10 ml MACS-buffer i cellesuspensjonen. Sentrifuge i 5 min ved 200 × g ved romtemperatur.
    11. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 80 μL MACS-buffer per 10 millioner celler. Tilsett 20 μL per 10 millioner celler av FcR-blokkerende reagens, CD31 mikroperler og CD144 mikroperler. Inkuber i 15 minutter på is.
    12. Mens cellesuspensjonen inkuberes, sentrifugerer mediet samlet fra endotelinduksjon (trinn 4.3.2) ved 200 × g i 10 minutter.
    13. Samle supernatanten i et 500 ml 0,22 μm vakuumfilter. Klargjør endotelbetinget medium (tilleggstabell S1). Filtrer mediet under sterile forhold og hold mediet varmt ved 37 °C.
      MERK: Endotelcelleproliferasjonshastigheten vil begynne å synke etter passering 3. For å oppnå eksponentiell vekst etter passasje 3 kan endotelbetinget og vedlikeholdsmedium suppleres med 10 μM TGF-Beta-hemmer (SB431542) fra passasje 1.
    14. Etter inkubasjonen på 15 minutter i trinn 4.4.11, tilsett 10 ml MACS-buffer per 10 millioner celler (maksimalt 30 ml MACS-buffer) til cellesuspensjonen. Sentrifuge ved 200 × g i 5 min.
    15. Aspirer supernatanten. Resuspender i 1 ml MACS-buffer.
    16. Ta LS-kolonnen og trekk stempelet ut av sprøyten. Plasser stempelet tilbake i plasthylsen. Plasser søylen på magneten.
    17. Plasser det første 50 ml koniske røret under kolonnen. Legg til 1 ml MACS-buffer i kolonnen. Samle i 50 ml konisk rør under.
    18. La væsken strømme gjennom, men ikke helt for å forhindre at kolonnen tørker. Når væskedråpene begynner å sildre sakte, legg til cellesuspensjonen i kolonnen. Samle gjennomgangen i samme 50 ml koniske rør.
    19. Når væskedråpene begynner å sildre sakte, plasser det neste 50 ml koniske røret under kolonnen. Legg til den første gjennomgangen (trinn 4.4.18) i kolonnen. Samle i 50 ml konisk rør under.
    20. Når væskedråpene begynner å sildre sakte, tilsett 500 μL MACS-buffer 3x for å vaske kolonnen.
    21. Fjern kolonnen fra magneten. Plasser kolonnen på 15 ml konisk rør. Legg til 1 ml kald PBS i kolonnen.
    22. For å samle cellene, ta stempelet fra plasthylsen og skyv det godt inn i kolonnen.
    23. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Ta cellesuspensjonen til 5 ml med PBS. Sentrifuge i 5 min ved 200 × g.
    24. Mens cellene gjennomgår sentrifugering, vask kjellermembranmatrisen 3-belagt kolbe 3x med 5 ml PBS for å forberede seg på cellesåing. Aspirer PBS og tilsett 20 ml endotelbetinget medium til kjellermembranmatrisen 3-belagt kolbelagt.
    25. Fjern cellene fra sentrifugen og aspirer supernatanten. Resuspender cellene i endotelbetinget medium for å bli sådd ved 26 000 celler / cm2 (1,95 × 106 celler / T75 kolbe). Frø cellene.
    26. Hvis du vil beregne sorteringseffektivitet og celleutbytte, deler du celleantallet fra trinn 4.4.23 med celleantallet fra trinn 4.4.9.
  5. Dag 8-15: utvidelse av viECs
    1. Neste dag (dag 8), aspirer det brukte mediet fra kolben. Bytt ut med 10 ml endotelbetinget medium. Bytt ut det endotelkondisjonerte mediet annenhver dag til kolben er 90% sammenflytende eller til flasken med endotelbetinget medium er fullstendig brukt.
    2. Aspirer brukt medium og erstatt med 10 ml endotelvedlikeholdsmedium (tilleggstabell S1) annenhver dag for fortsatt ekspansjon.
    3. For å passere viECs, lag to kjellermembranmatrise 3-belagte T75-kolber. La kolbene stå i romtemperatur i 1 time. Vask de nytilberedte kolbene grundig 3x med 5 ml PBS.
    4. Aspirer PBS. Tilsett 10 ml varmt endotelvedlikeholdsmedium til hver nytilberedt kolbe. Inkuber platene ved 37 °C mens cellene klargjøres for såing som beskrevet nedenfor.
    5. Tilsett 5 ml celleoppløsningsbuffer til en 90% konfluent T75-kolbe med viECs. Inkuber ved 37 °C i 5-7 min. Overfør cellene til et 15 ml konisk rør. Tilsett 5 ml varm DMEM/F12. Sentrifuge ved 200 × g i 5 min.
    6. Aspirer supernatanten. Resuspenderes i 1 ml varmt endotelvedlikeholdsmedium. Tilsett 500 μL av cellesuspensjonen til hver av de nytilberedte T75-kolbene.
    7. Neste dag, aspirer det brukte mediet. Bytt ut med 10 ml endotelvedlikeholdsmedium. Aspirer det brukte mediet og erstatt med 10 ml endotelvedlikeholdsmedium annenhver dag til kolben er 90% sammenflytende.

5. Dag 14: Klargjøring av mikrofluidiske organbrikkeinnretninger for cellekultur

  1. Plasmabehandling og kjellermembranmatrise 2 belegg
    1. Forbered kjellermembranmatrise 2-løsning (trinn 1.3). Sett den til side.
    2. I en steril vevskulturhette pakker du ut den sterile 100 mm x 15 mm runde petriskålen. Plasser petriskåltoppen, vendt nedover, under petriskålbunnen (tilleggsfigur S1B).
    3. Bruk pinsett, ta ut de mikrofluidiske sjetongene fra pakken og legg dem i petriskålen. Lukk petriskålen med lokket fra under parabolen.
    4. På plasma asher, plasser petriskållokket under parabolen, øverst vendt nedover, og hold dem sammen som en enhet. Plasser petriskålenheten i plasma askekammeret. Start plasma asher med oksygen ved 100 W, 15 SCCM, 30 s.
    5. Tidssensitiv: Når behandlingen er fullført, ta ut petriskålenheten fra plasma-asher. Tørk petriskållokket raskt og lett med 70% etanol sprayet på en laboratorieserviett. Dekk petriskålen med lokket.
    6. Ta petriskålen til den sterile vevskulturhetten. Tilsett forsiktig 25 μL kjellermembranmatrise 2-løsning i urinkanalen (øverst) på brikken. Tilsett 20 μL kjellermembranmatrise 2-løsning i kapillærkanalen (bunnen) av brikken.
    7. Ta to sterile 15 ml koniske rørhetter og fyll dem med sterilt destillert vann (~ 500 μL). Plasser hetten i petriskålen for å forhindre at sponkanalene og membranen tørker ut. Legg lokket på tallerkenen. Inkuber ved 37 °C over natten.

6. Såing av viECs og mellomliggende mesodermceller i mikrofluidiske enheter

  1. Dag 15: viECs
    1. Aspirer mediet fra T75-kolber som inneholder 90% konfluente viECs. Tilsett 5 ml celleoppløsningsbuffer og inkuber ved 37 °C i 5-7 min.
    2. Overfør cellene til et 15 ml konisk rør. Tilsett 5 ml DMEM/F12. Sentrifuge ved 200 × g i 5 min.
      MERK: Hver T75-kolbe med omtrent 90% sammenflytende viECs vil gi ~ 3 millioner celler.
    3. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 300 μL endotelvedlikeholdsmedium for å oppnå ca. 2 millioner celler / 300 μL. Tell cellene med et hemocytometer. Sett cellesuspensjonen til side.
    4. Overfør petriskålen som inneholder de mikrofluidiske sjetongene til vevskulturhetten. Fest en P200 barrierespiss til tuppen av en aspirator.
    5. Skyll både topp- og bunnkanalene på den mikrofluidiske brikken med 200 μL DMEM/F12 samtidig som du aspirerer periferien av uttaket.
    6. Hold brikken fast med P200-barrierespissen festet til aspiratoren, vekk fra utløpet til bunnkanalen. Injiser fast 20 μL av viEC-suspensjonen med ca. 134 000 celler i kapillærkanalen (nederst) av brikken. Aspirer forsiktig medium fra periferien av uttaket.
    7. Sjekk under mikroskopet for bobler eller en ujevn viEC såtetthet.
    8. Vend brikken forsiktig over for å invertere den slik at viECs kan feste seg til basalsiden av den fleksible PDMS-membranen. Plasser brikken i holderpatronen. Tilsett 3 ml PBS i sponholderkassetten for å forhindre at membranen tørker. Inkuber brikken ved 37 °C i 3 timer.
    9. Kontroller bunnkanalen under mikroskopet for et sammenflytende lag av viECs festet til den fleksible PDMS-membranen. Slipp 200 μL endotelvedlikeholdsmedium på innløpet til bunnkanalen og la det strømme gjennom kanalen for å vaske kanalen til ufestede endotelceller mens du forsiktig aspirerer fra periferien av kapillærkanalen (nederst) kanalutløp.
    10. Sett brikken tilbake i holderkassetten. Inkuber ved 37 °C over natten.
  2. Dag 16: mellomliggende mesodermceller (IM)
    1. Skyll kapillærkanalen forsiktig med 200 μL endotelvedlikeholdsmedium mens du forsiktig aspirerer periferien av utløpsporten.
    2. Skyll urinkanalen (øverst) med 200 μL DMEM/F12 mens du forsiktig aspirerer periferien av utløpet. Slipp ~ 50 μL DMEM / F12 på innløps- og utløpsportene.
    3. Aspirer mellomliggende mesoderm induksjonsmedium fra hver brønn i 12-brønnsplaten.
      MERK: Hver brønn på slutten av differensieringen gir omtrent 1,5 millioner IM-celler.
    4. Tilsett 1 ml trypsin-EDTA til hver brønn i 12-brønnsplaten og inkuber ved 37 °C i 5 minutter.
    5. Skrap cellene forsiktig ved hjelp av en celleløfter, og pipetter opp og ned for å dissosiere cellene ved hjelp av en P1000. Tilsett 2 ml trypsinnøytraliseringsløsning (tilleggstabell S1) til hver brønn. Overfør cellene til et 50 ml konisk rør. Ta cellesuspensjonsvolumet til 50 ml med DMEM/F12 og sentrifuge ved 200 × g i 5 minutter.
    6. Aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 500 μL intermediært mesoderm induksjonsmedium for å oppnå ca. 3 millioner celler / 500 μL. Tell cellene med et hemocytometer.
    7. Hold brikken fast med P200-barrierespissen festet til aspiratoren, vekk fra utløpet til urinkanalen (øverst). Injiser fast 25 μL cellesuspensjon med ca. 112 500 IM-celler i urinkanalen (øverst) av brikken, og aspirer mediet forsiktig fra periferien av utløpet.
    8. Sjekk under mikroskopet for bobler eller en ujevn IM-celle seeding tetthet. Tilsett 3 ml PBS i chipholderkassetten. Inkuber ved 37 °C i 3 timer.
    9. Skyll begge kanalene med 200 μL av deres respektive cellekulturmedium mens du forsiktig aspirerer periferien av sponuttakene for å forhindre bakoverstrømning av det brukte mediet og celleavfall.
    10. Fest tomme P200 barrieretupper i begge utløpene i urin- og kapillærkanalene. Pipette 200 μL endotelvedlikeholdsmedium og injiser halvparten av det i kapillærkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet slik at både kanalens innløp og utløp nå er festet til pipettespisser fylt med medium.
    11. Pipette 200 μL IM vedlikeholdsmedium og injiser halvparten i urinkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet slik at både kanalens innløp og utløp nå er festet til pipettespisser fylt med medium. Inkuber sjetongene med spisser innebygd ved 37 °C over natten.
  3. Koble chips til Organ Chip Bioreactor for å bruke væskestrøm og mekanisk belastning.
    1. Fjern P200-spisser fra urin- og kapillærkanalene. Tilsett dråper av respektive medier til innløp og utløp av urin- og kapillærkanaler for å forhindre tørking.
    2. Tilsett 3 ml varmt Podocyte Induksjonsmedium (tilleggstabell S1) til urininntaksbeholderen. Tilsett 3 ml varmt endotelvedlikeholdsmedium til kapillærinnløpsreservoaret.
    3. Tilsett 300 μL varmt Podocyte Induksjonsmedium til urinkanalutløpsreservoaret rett over utløpsporten. Tilsett 300 μL varmt endotelvedlikeholdsmedium til kapillærkanalutløpsreservoaret rett over utløpsporten.
    4. Skyv belgene på brettet og inn i Organ Chip Bioreaktoren.
    5. Bruk dreiehjulet på Organ Chip Bioreactor for å velge og starte Prime Cycle (2 min). Inspiser visuelt undersiden av poden for små dråper ved alle fire fluidiske porter.
    6. For å oppnå væske-væskekontakt mellom Pod-undersiden og mikrofluidiske chipporter, skyv sponbæreren forsiktig inn i Pod. Trykk forsiktig på chipholderfanen inn og opp. Aspirer overflødig medium fra sponoverflaten.
    7. Sett plasmabrikkens bioreaktorstrømningshastighet til 60 μL/t. Sett den sykliske belastningen til 10% ved 0,4 Hz. Bruk dreiehjulet på Organ Chip Bioreactor for å velge Reguler syklus og kjøre i 2 timer.
    8. Inspiser visuelt utløpsreservoarene for en økning i nivået av medium.
    9. Bruk dreieskiven på Organ Chip Bioreactor for å velge Reguler-syklusen.

7. Dagene 17-21 og utover: podocytinduksjon og chipvedlikehold

  1. Aspirer mediet fra urinkanalutløpsreservoarene diagonalt vekk fra havnen, men hold noe medium i reservoaret hver kulturdag. Fyll på urinkanalinntaksbeholderen med opptil 3 ml Podocyte Induksjonsmedium hver 2. dag i 5 dager.
    1. Etter 5 dager, aspirer mediet fra urinkanalen, men hold noe medium i reservoaret. Fyll på urinkanalinntaksreservoaret daglig med 3 ml Podocyte vedlikeholdsmedium.
  2. Aspirer mediet fra kapillærkanalutløpsreservoarene diagonalt vekk fra havnen, men hold noe medium i reservoaret hver kulturdag. Fyll på kapillærkanalinntaksreservoaret daglig med opptil 3 ml endotelvedlikeholdsmedium.

8. Funksjonell analyse og immunfluorescensavbildning

MERK: Se tilleggsfil 1 for detaljer om flowcytometrianalyse, ELISA for chipavløp og mRNA-isolasjon.

  1. Funksjonell analyse (molekylær filtrering) ved bruk av inulin og albumin
    1. Aspirer mediet fra kapillærkanalutløpsreservoaret diagonalt vekk fra badet, men hold noe medium i reservoaret. Erstattes med 3 ml endotelvedlikeholdsmedium supplert med inulin og albumin (tilleggstabell S1) i 6 timer.
    2. Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette måler du volumet (i ml) av medium fra urinkanalen og overfører til et 15 ml konisk rør. Pakk røret i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys og minimere fotobleking av fluoroforkonjugert inulin og albumin. Fyll på reservoaret med 3 ml Podocyte vedlikeholdsmedium.
    3. Forbered en stamløsning av inulin i Podocyte Vedlikeholdsmedium. Fra 25 μg / ml Inulin, utarbeide åtte standarder for inulin via en 2x seriell fortynning i Podocyte vedlikeholdsmedium.
    4. På samme måte fremstilles en stamløsning av albumin i Podocyte Vedlikeholdsmedium. Fra 150 μg / ml albumin, utarbeide åtte standarder for albumin via en 2x seriell fortynning i Podocyte Vedlikeholdsmedium.
    5. Pipette i duplikat 100 μL av hver standard inulinkonsentrasjon i hver brønn i en svart plate med 96 brønner (eller 16 totale brønner av inulin). Pipette i duplikat 100 μL av hver standard albuminkonsentrasjon i hver brønn i samme 96-brønnplate (16 totale brønner av albumin). Pipette i duplisert 100 μL Podocyte Vedlikeholdsmedium for å tjene som blank (eller to totale brønner av Podocyte Maintenance medium).
    6. Pipette i duplikat 100 μL avløpsmedium fra urinkanalen inn i hver brønn i samme 96-brønnsplate. Pipette i duplikat 100 μL avløpsmedium fra kapillærkanalen.
    7. Sett platen inn i plateleseren og mål fluorescensen for albumin ved eksitasjon 550 nm og utslipp 615 nm. Mål samme plate for inulin ved eksitasjon 513 nm og utslipp 577 nm.
    8. Fra de genererte dataene beregner du duplikatmålingene (per brikke). Trekk den tomme verdien som tilsvarer plateavlesningen, fra resten av dataene på arket.
    9. Plott verdiene som tilsvarer albuminstandardene for å lage en standardkurve med konsentrasjon [μg / ml] på x-aksen og fluorescensen på y-aksen. Plott verdiene som tilsvarer inulinstandardene for å lage en standardkurve med konsentrasjon [μg / ml] på x-aksen og fluorescensen på y-aksen.
    10. Bruk en statistisk analyseprogramvarepakke og lineær interpolasjon for å bestemme urinkonsentrasjonen av henholdsvis inulin og albumin i avløpsmediet fra sjetongene.
    11. Bestem urinclearance av inulin/albumin fra sjetongene ved hjelp av ligning (1)2:
      Urinclearance = ([U] × UV) / [P] (1)
      Der [U] er urinkonsentrasjonen fra trinn 8.1.10, er UV volumet av oppsamlet urinkanalavløp fra trinn 8.1.2, og [P] er kapillærkonsentrasjonen av inulin eller albumin (10 μg/ml inulin eller 100 μg/ml albumin).
  2. Bildediagnostikk av immunfluorescens
    1. Injiser en tom P200-spiss i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. For å fikse cellene, pipetter 200 μL 4% formaldehyd og injiserer halvparten av det i bunnkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet.
    2. Pipette 200 μL 4% formaldehyd og injiser halvparten av det i urinkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet slik at både kanalens innløp og utløp nå er festet til pipettespisser fylt med fikseringsmiddel.
    3. Inkuber sjetongene ved romtemperatur i 20 minutter.
    4. Etter 20 minutter kaster du alle pipettespissene. Injiser rene, tomme P200-spisser i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. For å permeabilisere cellene, pipetter 200 μL på 0,125% Triton X-100 / PBS og injiserer halvparten av det i kapillærkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet.
    5. Pipette 200 μL på 0,125% Triton X-100 / PBS og injiser halvparten av det i urinkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet. Inkuber brikken ved romtemperatur i 5 minutter.
    6. Kast alle pipettespissene. Injiser rene, tomme P200-spisser i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. For å blokkere cellene, pipetter 200 μL 1% bovint serumalbumin (BSA) i 0,125% Triton X-100 / PBS og injiserer halvparten av det i kapillærkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet.
    7. Pipette 200 μL på 1% BSA i 0,125% Triton X-100 / PBS og injiser halvparten av det i urinkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
    8. Kast alle pipettespissene. Vask begge kanalene 3x ved pipettering av 200 μL på 0,125 % Triton X-100/PBS i hver kanal og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    9. Forbered 100 μL primært antistoff per kanal med fortynning anbefalt av produsenten i 0,125% Triton X-100 / PBS. Injiser rene, tomme P200-spisser i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. Pipette 100 μL primært antistoff og injiser halvparten i de respektive kanalene. Slipp pipettespissen inne i innløpet.
    10. Inkuber i 1 time ved romtemperatur eller, for bedre resultater, over natten ved 4 °C.
      MERK: Flere primære antistoffer kan påføres samtidig; Den primære antistoffoppløsningen må imidlertid fortynnes i henhold til produsentens instruksjoner.
    11. Vask kanalene 3 x 10 minutter som beskrevet i trinn 8.2.8.
    12. Forbered 100 μL sekundært antistoff per kanal med fortynningsfaktoren anbefalt av produsenten i 0,125% Triton X-100 / PBS. Injiser rene, tomme P200-spisser i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. Pipette 100 μL sekundært antistoff og injiser halvparten i de respektive kanalene. Slipp pipettespissene inne i innløpet. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
      MERK: Hvert sekundære antistoff må påføres separat. Vask minst 3 x 10 minutter mellom hver påføring i henhold til trinn 8.2.8.
    13. Vask kanalene 3 x 10 minutter som beskrevet i trinn 8.2.8.
    14. Skyll begge kanalene én gang med 200 μL destillert vann mens du aspirerer restvæsken fra periferien av sponutløpsportene.
    15. Injiser ren, tom P200 i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. For å motvirke cellene, pipetter 200 μL av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1,000 fortynning i destillert vann) og injiserer halvparten av det i kapillærkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet, og pipetter 200 μL DAPI og injiser halvparten av den i urinkanalinnløpet. Slipp pipettespissen inne i innløpet, og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
    16. Kast alle pipettespissene. Injiser rene, tomme P200-spisser i utløpsportene i urin- og kapillærkanalene. For å motvirke cellene, pipetter 200 μL phalloidin (1: 1000 fortynning i PBS uten Ca 2+ og Mg2 +) og injiserer halvparten av det i kapillærkanalinntaket og frigjør pipettespissen inne i innløpet. Pipetter 200 μL falloidin (1: 1000 fortynning i PBS uten Ca 2+ og Mg2 +) og injiser halvparten av det i urinkanalinnløpet og slipp pipettespissen inne i innløpet. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
    17. Skyll kanalene 3x med 200 μL PBS uten Ca 2+ og Mg2+, og aspirer overflødig væske fra periferien av utløpsportene.
    18. Visualiser sjetongene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi at en funksjonell 3D in vitro-modell av glomerulus kan vaskulariseres og epiteliseres fra en isogen kilde til humane iPS-celler. Spesielt gir denne protokollen instruksjoner om hvordan man bruker human iPS-celleteknologi, spesielt deres evne til å differensiere i spesialiserte celletyper, for å generere nyreglomerulært epitel (podocytter) og vaskulært endotel (viECs) som kan integreres med mikrofluidiske enheter for å modellere strukturen og funksjonen til den menneskelige nyren på pasientspesifikt nivå. En skjematisk oversikt over denne protokollen og tidslinjen (figur 1A) beskriver hvordan man dyrker mitotisk aktive humane iPS-celler (figur 1B) og deretter differensierer dem (parallelt) til mesoderm- og laterale mesodermcellelinjer (figur 1C, D). De resulterende mesodermcellene ble funnet å uttrykke brachyury (T), mens de laterale mesodermcellene uttrykte brachyury (T), MIXL og EOMES 2,9,10,11.

Senere differensiering av mesodermcellene ga mellomliggende mesodermceller (IM), mens differensiering av laterale mesodermceller ga viECs (figur 1D)2,10,11,17. Flowcytometrianalyse ble brukt til å undersøke ekspresjonen av CD144 i differensierte viECs (før og etter MAC-sortering) sammenlignet med negative kontroller (inkludert fargede og ufargede udifferensierte humane iPS-celler og ufarget endotel). En optimalisert endoteldifferensiering vil resultere i 50% eller større CD31/CD144-positive celler før MAC-sortering, noe som vil forbedre seg betydelig etter cellesortering sammenlignet med kontroller. Representative resultater viser 59% differensieringseffektivitet for CD144 før MAC-sortering, som økte til 77% eller flere CD144-positive celler (ikke inkludert CD31-positive celler) etter MAC-sortering (figur 1E).

På dag 14 av denne protokollen (før fullføring av IM-differensiering og viEC-utvidelse) ble organ-on-a-chip-enhetene fremstilt for cellesåing ved plasmabehandling og funksjonalisering med kjellermembranmatrise 2. Dagen etter (dag 15 av protokollen) ble viECs sådd inn i kapillærkanalen (nederst) av mikrofluidisk enhet med viEC-medium. Dagen etter viEC-såing (dag 16 i protokollen) ble IM-celler sådd inn i urinkanalen (øverst) på mikrofluidikken med podocytinduksjonsmedium. Dagen etter IM-cellesåing (dag 17 i denne protokollen) ble 60 μL/t væskestrømningshastighet og 10 % belastning ved 0,4 Hz påført glomerulusbrikkene. Disse brikkene opplever skjærspenning på 0,017dyn cm−2 og 0,0007dyn cm−2 i henholdsvis kapillær- og urinkanalene 2,12. Etter opptil 5 dager med podocyttinduksjon og 6 dager med vaskulær endotelutbredelse i brikken (dag 21 i denne protokollen) (figur 2A), uttrykte de resulterende cellene i glomerulus-sjetongene avstamningsidentifikasjonsmarkører.

Spesielt uttrykte podocyttene i urinkanalen podocin og nefrin (figur 2B, topppanel), og viECs i kapillærkanalen uttrykte PECAM-1 (CD31) og VE-Cadherin (CD144) (figur 2B, bunnpanel). I tillegg uttrykte både podocytt- og viEC-lagene kollagen IV, det mest tallrike GBM-proteinet (figur 2B) i nyreglomerulus. Mer kollagen IV uttrykkes i urinkanalen fordi podocytter er de dominerende produsentene av kollagen IV, inkludert α3α4α5 isoformen, som er den viktigste heterotrimerisoformen av kollagen i den modne glomerulus. I tillegg utviklet podocyttene forplantet i glomerulus-sjetongene fotprosesser og utskilte VEGF165, som begge er karakteristiske trekk ved funksjonelle modeller av nyreglomerulus 2,12. Denne protokollen gir også en vurdering av den selektive molekylære filtreringsfunksjonen til nyreglomerulus ved bruk av inulin og albumin, hvorfra glomerulus-sjetongene selektivt filtrerer små molekyler (inulin) fra kapillæren inn i urinkanalen, samtidig som store proteiner (albumin) forhindres i å forlate kapillærkanalen (figur 2C)2,10,12.

Siden hver human iPS-cellelinje viser iboende forskjeller i doblingstiden, er det viktig å merke seg at optimale cellesåtettheter for forskjellige cellelinjer kan variere og derfor må optimaliseres av forskeren. For endotelcelledifferensiering, hvis såingstettheten til humane iPS-celler er for lav, kan forskeren observere et lavere utbytte av differensierte endotelceller (<30% effektivitet). Hvis såtettheten til humane iPS-celler er for høy, kan forskeren observere rask celleovervekst, løsrivelse eller dårligere vedheft, økt celledød og lavt utbytte (<30% effektivitet). Under endotelinduksjon (dag 4-7 av differensiering) er en økning i celletallet som resulterer i et sekundært lag av celler normalt, men bør holdes på et minimum (figur 3A). For IM- og podocyttdifferensiering kan tilsyn med humane iPS-celler (>100 000 celler/brønn i en 12-brønnsplate) resultere i IM-celler som vokser i store klynger eller danner aggregater, noe som kan hindre differensiering og resultere i podocytter med en mindre moden morfologisk fenotype av aggregerte celler og mindre sekundære og/eller tertiære fotprosesser10, 11.

Under mikrofluidisk brikkekultur kan uventet væskekryssstrøm mellom urin- og kapillærkanaler (figur 3B) observeres hvis det er sprukket eller utilstrekkelig binding av PDMS-brikkekomponentene, eller hvis væskestrømmens bane er blokkert. Denne uønskede væskekryssstrømmen kan også skyldes en kompromittert filtreringsbarriere som vevsmodeller fra utilstrekkelig (lav) cellesåing eller skadede cellelag. For å forhindre dette problemet anbefales det at forskeren følger den anbefalte protokollen og cellesåtetthetene, samt visuelt inspiserer sjetongene for luftbobler i kanalene i alle stadier av prosessen. Hvis det observeres luftbobler i mediereservoarene til de mikrofluidiske sjetongene som er under væskestrøm, kan pumpen stoppes og mediet avgasses under sterile forhold.

Sammen beskriver denne protokollen og representative resultater utledningen av vaskulært endotel (viECs) og glomerulært epitel (podocytter) fra en isogen human iPS-cellelinje, og deres rekonstituering i en mikrofluidisk organ-on-a-chip-enhet for å rekapitulere strukturen og funksjonen til nyreglomerulær filtreringsbarriere på en pasientspesifikk måte.

Figure 1
Figur 1: Derivasjon av isogent glomerulært epitel og vaskulært endotel fra humane iPS-celler. (A) Skjematisk tidslinje for intermediær mesoderm- og viEC-induksjon, organ-on-a-chip-design og kjellermembranmatrisebelegg, cellesåing i brikken og podocytinduksjon i brikken. (B) Representative brightfield-bilder av PGP1 humane iPS-celler før dissosiasjon på dag 0 av protokollen. (C) Representative brightfield-bilder av PGP1-mesodermceller på dag 2 av differensiering (venstre) og mellomliggende mesodermceller på dag 8 av differensiering (høyre). (D) Representative brightfield-bilder av PGP1 laterale mesodermceller på dag 3 av differensiering (venstre) og PGP1 viECs på dag 9 av differensiering (2 dager med ekspansjon) (høyre). Skala barer = 275 μm (B-D). (E) Kvantifisering av viEC-differensiering via flowcytometrianalyse for CD144-positive celler på dag 7 av endotelcelledifferensiering før MACS (blå) og på dag 9 av endotelcelleutvidelse etter MACS (rosa) sammenlignet med CD144-fargede humane iPSC-er (svarte) og ufargede endotelceller (røde). Dette tallet er endret fra12. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; viEC = vaskulære endotelceller; BMP4/7 = benmorfogenetisk protein 4/7; RA = retinsyre; VEGF = vaskulær endotelial vekstfaktor; MACS = magnetisk aktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder av vaskulært endotel og glomerulært epitel (podocyttlag) dyrket i mikrofluidisk nyreglomeruluschip. Representative brightfield-bilder av viECs (venstre) og glomerulært epitel (podocytter) (høyre) forplantet i glomerulus-brikken. Skalastenger = 183 μm. (B) Representative immunfluorescerende bilder av glomerulært epitel (podocytter) og viEC som viser uttrykket for avstamningsspesifikke markører. Skala barer = 100 μm. (C) Representative data som viser selektiv molekylær filtrering i glomerulus chip. Feilfelt representerer SD. p < 0,0001. Dette tallet er gjengitt fra 12. Forkortelser: viECs = vaskulære endotelceller; VE-cadherin = CD144; PECAM-1 (= CD31) = blodplate endotelcelleadhesjonsmolekyl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Bilder av suboptimal endotelsåtetthet og ujevn væskestrøm i mikrofluidiske sjetonger . (A) Representative brightfield-bilder av optimale (venstre) og overvåkede (høyre) cellekulturer på dag 6 av viEC-differensiering. Skalastenger = 275 μm. (B) Representative bilder av utløpsreservoarer fra mikrofluidiske chips med jevn væskestrøm og en funksjonell barriere (venstre). Bilde fra en brikke med ujevn væskestrøm eller dysfunksjonell barriere (høyre). Piler angir væskenivåer i utløpsreservoarer for kapillær- og urinkanalene til sjetongene. Forkortelse: viECs = vaskulære endotelceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1: Flowcytometri, ELISA for chipavløp og mRNA-isolasjon. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S1: Materialoppsett i vevskultur hette. (A) Hettemateriale i vevskultur satt opp for MACS, inkludert isbøtte med media, magnet på magnetstativ og koniske rør under magneten. (B) In-tissue culture hette materiale oppsett av petriskål for chips, med toppen, vendt nedover, under petriskålbunnen. Forkortelse: MACS = magnetisk aktivert cellesortering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Medier og buffere som brukes i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne rapporten skisserer vi en protokoll for å utlede vaskulært endotel og glomerulært epitel (podocytter) fra en isogen human iPS-cellelinje og bruken av disse cellene til å konstruere et 3D-organ-on-a-chip-system som etterligner strukturen, vev-vevsgrensesnittet og molekylær filtreringsfunksjon av nyreglomerulus. Denne glomerulusbrikken er utstyrt med endotel og glomerulært epitel som sammen gir en barriere for selektiv filtrering av molekyler.

Forskere som er interessert i å tilpasse denne protokollen, bør gjøre følgende hensyn: For det første kan optimalisering være nødvendig for cellesåing, avhengig av de iboende vekstegenskapene til stamcellelinjene som brukes. Cellesåtetthet kan variere på grunn av iboende forskjeller i human iPS-celleproliferasjonshastighet. Det anbefales at forskere begynner med mesodermsåingstettheten som er foreslått av protokollen, og deretter justerer om nødvendig. På samme måte anbefales det at den laterale mesodermdifferensieringen starter med den foreslåtte cellesåtettheten før justering etter behov for å oppnå et viEC-utbytte og sorteringseffektivitet på 50% eller mer. Hvis tilstrekkelige celler ikke differensieres etter sortering, kan TGF-Beta-hemmer (SB431542) brukes til å forhindre hvile og bidra til å eksponentielt utvide viECs (tidligere passasje 3). Imidlertid er flere cellulære prosesser eller signalveier avhengige av TGF-Beta (f.eks. Patogenese av hyperglykemi / diabetes, immunhomeostase); Som sådan anbefales det at forskere vurderer effekten av TGF-Beta-hemming på nedstrømsanalyse eller sikrer tilstrekkelig testing for å unngå utilsiktede eksperimentelle resultater.

For det andre er det viktig å merke seg mulige variasjoner i reagenskvalitet og produsentspesifikasjoner, spesielt for komponenter anskaffet fra andre leverandører enn de som er spesifisert i protokollen. Det anbefales derfor at forskeren tester reagenser fra forskjellige partinumre, leverandører og leverandører for å sikre reproduserbarhet av eksperimenter og resultater. Generelt bør forskeren unngå overdreven eksponering av de menneskelige iPS-cellene for dissosiasjonsenzymer i løsrivelsesbufferne, da dette kan føre til redusert celle levedyktighet og endret molekylær profil av cellene. I tillegg må podocyttinduksjonsmediet beskyttes mot lys for å forhindre inaktivering av all transretinsyre . For det tredje, under organ-on-a-chip cellekultur, er det viktig å unngå luftbobler i kanalene til den mikrofluidiske enheten når du perfugerer sjetongene. Utseendet til luftbobler kan minimeres eller forhindres ved regelmessig inspeksjon av sjetongene under cellesåing, ved å opprettholde væske-væskekontakt på hvert trinn som involverer chipperfusjon, og ved ikke å skyve eller trekke luft inn i væskekanalene ved bruk av pipettespisser og / eller aspirasjon.

Tidligere forsøk på å konstruere nyreglomerulus-chips med genetisk matchet epitel og endotel har stolt på bruken av animalske avledede celler1. Selv om disse dyreavledede cellelinjene tradisjonelt har blitt brukt til prekliniske studier, klarer de ofte ikke å rekapitulere menneskelige fysiologiske responser, noe som bidrar til den høye feilfrekvensen (89,5%) av kliniske studier i mennesker18. For å bidra til å overvinne noen av disse problemene, er funksjonelle in vitro-modeller som nærmere rekapitulerer menneskelig biologi ønskelig. Det er gjort fremskritt for å utvikle flercellede modeller av den menneskelige nyre; Imidlertid benyttet glomerulus-sjetongene humane celler fra heterogene, ikke-isogene kilder. For eksempel har vi tidligere etablert en glomerulus-chip rekonstituert fra humane iPS-celleavledede podocytter og primærvevsavledet endotel10. Studier fra andre forskningsgrupper benyttet en blanding av primære celler4,9, immortaliserte celler 3 eller fostervannsavledede celler 3,6 som begrenser bruken av dem for å studere pasientspesifikke responser eller applikasjoner i personlig medisin.

Protokollen beskrevet her overvinner disse begrensningene ved å muliggjøre utledning av både vaskulært endotel (viECs) og glomerulært epitel (podocytter) fra samme humane iPS-cellelinje og integrere disse cellene i compartmentalized microfluidic organ-on-a-chip enheter for å modellere strukturen og funksjonen til nyre glomerulær kapillærvegg in vitro . Gitt ubegrenset selvfornyelse av humane iPS-celler, kombinert med deres evne til å differensiere til nesten hvilken som helst celletype, gir denne protokollen også en mulighet for kontinuerlig innkjøp av humane podocytter og viECs for vevsteknikk og andre biomedisinske applikasjoner. Denne tilnærmingen for avledninger av podocytter og viECs har blitt reprodusert i flere pasientspesifikke humane iPS-cellelinjer, inkludert PGP1- og DU11 2,10,12,17,19, og muliggjør dermed etablering av personlige nyreglomerulus-chips fra de ønskede pasientpopulasjonene.

Strategien for å differensiere podocytter i de mikrofluidiske sjetongene muliggjør mekanistisk studie av utviklingen av human nyreglomerulus og sykdomsmodellering. Studien av den utviklende humane nyreglomerulus er imidlertid begrenset av viECs som krever sortering for å berike for den ønskede befolkningen. Dette arbeidet kan med fordel etableres metoder for differensiering av viECs uten behov for utvelgelse av undergrupper. Denne studien er også begrenset av den tykke PDMS-membranen som skiller de vaskulære endotel- og podocytcellelagene. Fremtidig arbeid kan integrere nye biomaterialer for å erstatte den tykke PDMS for bedre å etterligne de molekylære og biofysiske egenskapene til den glomerulære kjellermembranen. For eksempel kan en alternativ membran konstrueres for å ha biologisk nedbrytbare egenskaper med justerbar porøsitet og være tynnere (mer GBM-lignende) enn den 50 μm tykke PDMS-membranen som brukes i denne protokollen.

Likevel kan glomerulusbrikken produsert av denne protokollen brukes til å studere mekanismene for svekkende nyresykdommer og tjene som en plattform for nefrotoksisitetstesting og narkotikaforskning. Fordi menneskelige iPS-celler opprettholder donorens genetiske profil og glomerulus-brikken er i stand til å modellere nyresykdom12, kan nye terapeutiske mål bli oppdaget i fremtiden til fordel for de som lider av arvelige former for nyresykdom. I tillegg kan pasientspesifikke biologiske responser på posttransplantasjonsmedikamenter evalueres mer nøyaktig ved hjelp av en isogen nyrebrikke som den som er beskrevet i denne studien. Endelig er denne glomerulus-brikken klar til å studere effekten av væskedynamikk og differensiell mekanisk belastning - som de som observeres hos nyresykdomspasienter med hypertensjon eller kardio-nyresyndrom - gitt den relative lettheten ved å modulere væskestrømmen, vevsstrekking eller mekanisk belastning. Det kan tenkes at denne protokollen kan fremme den nåværende forståelsen av menneskelig nyreutvikling og sykdomsmekanismer, samt legge til rette for utvikling av personlige terapier i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.M. er oppfinner på et patent relatert til podocytdifferensiering fra humane iPS-celler. Den andre forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Pratt School of Engineering ved Duke University, Division of Nephrology ved Duke Department of Medicine, et Whitehead-stipend i biomedisinsk forskning og en Genentech Research Award for S. Musah. Y. Roye er mottaker av Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship og William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship fra Duke University's Department of Biomedical Engineering. Den DU11 (Duke University klone # 11) iPS cellelinjen ble generert på Duke iPSC Core Facility og gitt til oss av Bursac Lab ved Duke University. Forfatterne takker N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya og Y. Zhou for teknisk assistanse og nyttige diskusjoner. Forfatterne vil også takke medlemmer av Musah Lab for nyttige kommentarer til manuskriptet. Forfatterne takker Segura Lab for gaven av et Acuri C6 flowcytometer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Alexa Fluor 488- and Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo/Life Technologies A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015
Collagen IV Thermo/Life Technologies 14-9871-82
Nephrin Progen GP-N2
PECAM-1 R&D Systems AF806
Podocin Abcam ab50339
VE-Cadherin Santa Cruz sc-9989
Basement membrane matrices
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 Basement membrane (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment Iwai North America N8922012 Basement membrane matrix (2)
Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix (1); may show lot-to-lot variation
Cells
DU11 human iPS cells The DU11 (Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. The line has been tested and found to be free of mycoplasma (last test in November 2021) and karyotype abnormalities (July 2019)
Culture medium growth factors and media supplements
0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
2-Mercaptoethanol Thermo/Life Technologies 21985023
Albumin from Bovine serum, Texas Red conjugate Thermo/Life Technologies A23017
All-trans retinoic acid (500 mg) Stem Cell Technologies 72262
B27 serum-free supplement Thermo/Life Technologies 17504044
B-27 supplement (50x) without Vitamin A Thermo/Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
CHIR99021 Stemgent 04-0004 May show lot-to-lot variation
Complete medium kit with CultureBoost-R Cell Systems 4Z0-500-R Podocyte maintenance media
DMEM/F12 Thermo/Life Technologies 12634028
DMEM/F12 with GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 10565042 DMEM/F12 with glutamine
Forskolin (Adenylyl cyclase activator) Abcam ab120058
GlutaMAX supplement Thermo/Life Technologies 35050061 glutamine supplement
Heat-inactivated FBS Thermo/Life Technologies 10082147
Heparin solution Stem Cell Technologies 7980
Human Activin A Thermo/Life Technologies PHC9544
Human BMP4 Preprotech 120-05ET
Human BMP7 Thermo/Life Technologies PHC9544
Human VEGF Thermo/Life Technologies PHC9394
Inulin-FITC Sigma-Aldrich F3272
mTeSR1 medium Stem Cell Technologies 05850 Human iPS cell culture media (CCM). Add 5x supplement according to the manufacturer. Human iPS CCM can be stored for up to 6 months at -20 °C.
N-2 Supplement (100x) Thermo/Life Technologies 17502048
Neurobasal media Thermo/Life Technologies 21103049 Lateral mesoderm basal media
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo/Life Technologies 14190-250
Penicillin-streptomycin, liquid (100x) Thermo/Life Technologies 15140-163
ROCK inhibitor (Y27632) Tocris 1254
StemPro-34 SFM Thermo/Life Technologies 10639011 Endothelial cell culture medium (CCM). Add supplement according to manufacturer. Endothelial CCM can be stored for up to two weeks at 4 °C or -20 °C for up to 6 months.
TGF-Beta inhibitor (SB431542) Stem Cell Technologies 72234
Enzymes and other reagents
Accutase Thermo/Life Technologies A1110501 Cell detachment buffer
Dimethyl Suloxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade VWR 97065-058
Paraformaldehyde (PFA) Thermo/Life Technologies 28906
Sterile distilled water Thermo/Life Technologies 15230162
Triton X-100 VWR 97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05% Thermo/Life Technologies 25300-120
(Orb) Hub module Emulate ORB-HM1
100mm x 15 mm round petri dish Fisherbrand FB087579B
120 x 120 mm square cell culture dish VWR 688161
Accuri C6 BD Biosciences
Aspirating pipettes, individually wrapped Corning 29442-462
Aspirating Unit SP Bel-Art F19917-0150
Avanti J-15R Centrifuge Beckman Coulter B99516
Conical centrifuge tube, 15 mL Corning 352097
Conical centrifuge tube, 50 mL Corning 352098
EVOS M7000 Thermo/Life Technologies AMF7000 Fluorescent microscope to take images of fixed and stained cells.
Hemocytometer VWR 100503-092
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo/Life Technologies 51030403
Inverted Zeiss Axio Observer equipeed with AxioCam 503 camera Carl Zeiss Micrscopy 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)
Kimberly-Clark nitrile gloves VWR 40101-346
Kimwipes, large VWR 21905-049
Leoca SP8 Upright Confocal Microscope
Media reservoir (POD Portable Module) Emulate POD-1
Microplate shaker VWR 12620-926
Organ-chip Emulate S-1 Chip
Organ-chip holder Emulate AK-CCR
P10 precision barrier pipette tips Denville Scientific P1096-FR
P100 barrier pipette tips Denville Scientific P1125
P1000 barrier pipette tips Denville Scientific P1121
P20 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
P200 barrier pipette tips Denville Scientific P1122
Plasma Asher Quorum tech K1050X RF This Plasma Etcher/Asher/Cleaner was used as a part of Duke University's Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF).
Round bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap Corning 352235
Serological pipette, 10 mL, indivdually wrapped Corning 356551
Serological pipette, 25 mL, indivdually wrapped Corning 356525
Serological pipette, 5 mL, indivdually wrapped Corning 356543
Steriflip, 0.22 µm, PES EMD Millipore SCGP00525
Sterile Microcentrifuge tubes Thomas Scientific 1138W14
T75cm2 cell culture flask with vent cap Corning 430641U
Tissue culture-treated 12 well plates Corning 353043
Tissue culture-treated 6 well plates Corning 353046
Vacuum modulator and perstaltic pump (Zoe Culture Module) Emulate ZOE-CM1 Organ Chip Bioreactor
VE-Cadherin CD144 anti-human antibody - APC conjugated Miltenyi Biotec 130-126-010
Wide-beveled cell lifter Corning 3008
MACS
CD144 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-097-857
CD31 MicroBead Kit, human Miltenyi Biotec 130-091-935
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (5), 1-12 (2017).
  3. Petrosyan, A., et al. A glomerulus-on-a-chip to recapitulate the human glomerular filtration barrier. Nature Communications. 10 (1), 3656 (2019).
  4. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling. 9, 12 (2011).
  5. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: when do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  6. Da Sacco, S., et al. A novel source of cultured podocytes. PloS One. 8 (12), 81812 (2013).
  7. Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2 (2015).
  8. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of cardiovascular pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  9. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  10. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  11. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  12. Roye, Y. A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium. Micromachines. 12 (8), 967 (2021).
  13. Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).
  14. Ruotsalainen, V., et al. Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).
  15. Privratsky, J. R., Newman, P. J. PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  16. Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. The glomerular filtration barrier: components and crosstalk. International Journal of Nephrology. 2012, 749010 (2012).
  17. Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress. STAR Protocols. 2 (2), 100394 (2021).
  18. Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. The productivity crisis in pharmaceutical R&D. Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).
  19. Atchison, L., et al. iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).

Tags

Bioteknologi utgave 189
Isogen nyre glomerulus chip konstruert fra humant induserte pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney… More

Roye, Y., Musah, S. Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (189), e63821, doi:10.3791/63821 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter