Hier wird ein Protokoll zur Entwicklung eines personalisierten Organ-on-a-Chip-Systems vorgestellt, das die Struktur und Funktion der nierenglomerulären Filtrationsbarriere rekapituliert, indem genetisch angepasste Epithel- und vaskuläre Endothelzellen integriert werden, die sich von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unterscheiden. Dieses biotechnologisch hergestellte System kann die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranbringen.
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Methodenartikel
Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen 15% der erwachsenen US-Bevölkerung, aber die Etablierung gezielter Therapien wurde durch den Mangel an Funktionsmodellen eingeschränkt, die menschliche biologische Reaktionen und Nephrotoxizität genau vorhersagen können. Fortschritte in der Nierenpräzisionsmedizin könnten helfen, diese Einschränkungen zu überwinden. Zuvor etablierte In-vitro-Modelle des menschlichen Nierenglomerulus - der primäre Ort für die Blutfiltration und ein Hauptziel vieler Krankheiten und Arzneimitteltoxizitäten - verwenden jedoch typischerweise heterogene Zellpopulationen mit begrenzten funktionellen Eigenschaften und unübertroffenen genetischen Hintergründen. Diese Eigenschaften schränken ihre Anwendung für die patientenspezifische Krankheitsmodellierung und therapeutische Entdeckung erheblich ein.
Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das humanes induziertes pluripotentes Stamm (iPS) Zell-abgeleitetes glomeruläres Epithel (Podozyten) und vaskuläres Endothel von einem einzigen Patienten integriert, um einen isogenen und vaskularisierten mikrofluidischen Nierenglomerulus-Chip zu entwickeln. Der resultierende Glomerulus-Chip besteht aus Stammzell-abgeleiteten Endothel- und Epithelzellschichten, die linienspezifische Marker exprimieren, Basalmembranproteine produzieren und eine Gewebe-Gewebe-Schnittstelle bilden, die der glomerulären Filtrationsbarriere der Niere ähnelt. Der konstruierte Glomerulus-Chip filtert selektiv Moleküle und rekapituliert medikamenteninduzierte Nierenschäden. Die Fähigkeit, die Struktur und Funktion des Nierenglomerulus mithilfe isogener Zelltypen zu rekonstruieren, schafft die Möglichkeit, Nierenerkrankungen mit Patientenspezifität zu modellieren und den Nutzen von Organs-on-Chips für die Nierenpräzisionsmedizin und verwandte Anwendungen voranzutreiben.
Einleitung
Organ-on-a-Chip-Geräte sind dynamische 3D-In-vitro-Modelle, die molekulare und mechanische Stimulation sowie Vaskularisation verwenden, um Gewebe-Gewebe-Schnittstellen zu bilden, die die Struktur und Funktion bestimmter Organe modellieren. Zuvor etablierte Organ-on-a-Chip-Geräte, die darauf abzielten, den Glomerulus der Niere (Glomerulus-Chips) zu rekapitulieren, bestanden aus tierischen Zelllinien1 oder menschlichen primären und immortalisierten Zelllinien heterogener Quellen 2,3. Die Verwendung genetisch heterogener Zellquellen weist Variationen auf, die die Studien zu patien....
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Protokoll
1. Herstellung von Basalmembranmatrixlösungen und beschichteten Substraten
- Basalmembranmatrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Aliquot nach dem Vorschlag des Herstellers für das Verdünnungsverhältnis. Mischen Sie mit einem 50-ml-Konikröhrchen und einer Pipette gründlich eine geeignete Menge der Basalmembranmatrix 1 in 25 ml kaltes DMEM/F12, bis sie vollständig aufgetaut und aufgelöst ist.
- Um ein gefrorenes Aliquot aufzulösen, nehmen Sie ~ 200 μL aus den 25 mL kaltem DMEM / F12 und geben Sie es in das gefrorene aliquote Röhrchen. Pipettieren Sie auf und ab, bis die Matrix gründlich aufgetaut und aufgelöst ist. Übertragen Sie de....
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Ergebnisse
Hier zeigen wir, dass ein funktionelles 3D-In-vitro-Modell des Glomerulus aus einer isogenen Quelle menschlicher iPS-Zellen vaskularisiert und epithelialisiert werden kann. Insbesondere enthält dieses Protokoll Anweisungen zur Anwendung der humanen iPS-Zelltechnologie, insbesondere ihrer Fähigkeit, sich in spezialisierte Zelltypen zu differenzieren, um ein glomeruläres Nierenepithel (Podozyte) und vaskuläres Endothel (viECs) zu erzeugen, das in mikrofluidische Geräte integriert werden kann, um die Struktur und F.......
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Diskussion
In diesem Bericht skizzieren wir ein Protokoll zur Ableitung von vaskulärem Endothel und glomerulärem Epithel (Podozyten) aus einer isogenen menschlichen iPS-Zelllinie und der Verwendung dieser Zellen zur Entwicklung eines 3D-Organ-on-a-Chip-Systems, das die Struktur, die Gewebe-Gewebe-Schnittstelle und die molekulare Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmt. Dieser Glomerulus-Chip ist mit Endothel und glomerulärem Epithel ausgestattet, die zusammen eine Barriere für selektive Filtermoleküle darstellen.
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Offenlegungen
S.M. ist Erfinder eines Patents im Zusammenhang mit der Podozytendifferenzierung aus menschlichen iPS-Zellen. Der andere Autor hat nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Abteilung für Nephrologie am Duke Department of Medicine, einem Whitehead-Stipendium für biomedizinische Forschung und einem Genentech Research Award für S. Musah unterstützt. Y. Roye ist Empfänger des Duke University-Alfred P. Sloan Foundation Scholarship und des William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship des Department of Biomedical Engineering der Duke University. Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University clone #11) wurde in der Duke iPSC Core Facility generiert und uns vom Bursac Lab der Duke University zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattac....
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Materialien
Sie
Corning Fibronectin, Human Corning 356008 DU11 humane iPS-Zellen
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antikörper | |||
| Alexa Fluor 488- und Alexa Fluor 594-konjugierte Sekundärantikörper | Thermo/Life Technologies | A32744; Nr. A32754; Nr. A-11076; Nr. A32790; Nr. A21203; A11015 | |
| Kollagen IV | Thermo/Life Technologies | 14-9871-82 | |
| Nephrinprogen | GP-N2 | ||
| PECAM-1 | R& D Systems | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| Basalmembranmatrizen | |||
| Basalmembran (3) | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) Fragment | Iwai Nordamerika | N8922012 | Basalmembran-Matrix (2) |
| Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, 5-ml-Fläschchen | BD Biosciences | 354277 | Basalmembran-Matrix (1); kann Variation von Charge zu Charge aufweisen |
| Cells | |||
| Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University Clone #11) wurde in der Duke iPSC Core Facility erzeugt und uns vom Bursac Lab an der Duke University zur Verfügung gestellt. Die Linie wurde getestet und für frei von Mykoplasmen (letzter Test im November 2021) und Karyotypanomalien (Juli 2019) befunden | |||
| Kulturmedium, Wachstumsfaktoren und Medienzusätze | |||
| 0,5M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo/Life Technologies | 21985023 | |
| Albumin aus Rinderserum, Texas Red Konjugat | Thermo/Life Technologies | A23017 | |
| All-trans-Retinsäure (500 mg) | Stem Cell Technologies | 72262 | |
| B27 serumfreies Nahrungsergänzungsmittel | Thermo/Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Nahrungsergänzungsmittel (50x) ohne Vitamin A | Thermo/Life Technologies | 12587010 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Kann Schwankungen von Charge zu Charge aufweisen |
| Komplettes Medium-Kit mit CultureBoost-R | Cell Systems | 4Z0-500-R | Podozyten-Pflegemedium |
| DMEM/F12 | Thermo/Life Technologies | 12634028 | |
| DMEM/F12 mit GlutaMAX-Ergänzung | Thermo/Life Technologies | 10565042 | DMEM/F12 mit Glutamin |
| Forskolin (Adenylylcyclase-Aktivator) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX-Ergänzungsmittel | Thermo/Life Technologies | 35050061 | Glutamin-Ergänzungsmittel |
| Hitzeinaktiviertes FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparinlösung | Stem Cell Technologies | 7980 | |
| Human Activin A | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| Human BMP7 | Thermo/Life Technologies | PHC9544 | |
| Human VEGF | Thermo/Life Technologies | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 Medium | Stem Cell Technologies | 05850 | Humane iPS-Zellkulturmedien (CCM). Fügen Sie laut Hersteller 5x Zuschlag hinzu. Human iPS CCM kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo/Life Technologies | 17502048 | |
| Neurobasale Medien | Thermo/Life Technologies | 21103049 | Laterale Mesoderm-Basalmedien |
| PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penicillin-Streptomycin, flüssig (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| ROCK Inhibitor (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endothelzellkulturmedium (CCM). Ergänzen Sie laut Hersteller. Endotheliales CCM kann bis zu zwei Wochen bei 4 Grad gelagert werden; C oder -20 &Grad; C für bis zu 6 Monate. |
| TGF-Beta-Hemmer (SB431542) | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| Enzyme und andere Reagenzien | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Zellablösungspuffer |
| Dimethylsuloxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Ethanollösung, 70 % (vol/vol), biotechnologische Qualität | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Thermo/Life Technologies | 28906 | |
| Steriles destilliertes Wasser | Thermo/Life Technologies | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Equipment | |||
| Trypsin EDTA, 0,05% | Thermo/Life Technologies | 25300-120 | |
| (Orb) Hub-Modul | Emulate | ORB-HM1 | |
| Runde Petrischale 100 mm x 15 mm | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm quadratische Zellkulturschale | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirierende Pipetten, einzeln verpackt | Corning | 29442-462 | |
| Aspirationseinheit | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Zentrifuge | Beckman Coulter | B99516 | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen, 15 mL | Corning | 352097 | |
| konisches Zentrifugenröhrchen, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Fluoreszenzmikroskop zur Aufnahme von Bildern von fixierten und verschmutzten Zellen. |
| Hämozytometer | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| Inverted Zeiss Axio Observer ausgestattet mit AxioCam 503 Kamera | Carl Zeiss Micrscopy | 491916-0001-000 (Mikroskop) ; 426558-0000-000 (Kamera) | |
| Kimberly-Clark Nitrilhandschuhe | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, groß | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 aufrechtes konfokales Mikroskop-Medienreservoir | |||
| (tragbares POD-Modul) | Emulieren | POD-1 | |
| Mikroplatten-Shaker | VWR | 12620-926 | |
| Organ-Chip-Emulation | S-1 Chip Organ-Chip-Halter | ||
| Emulieren | Sie AK-CCR | ||
| P10 Präzisions-Barriere-Pipettenspitzen | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 Barriere-Pipettenspitzen | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 Barriere-Pipettenspitzen | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 Barriere-Pipettenspitzen | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 Barriere-Pipettenspitzen | Denville Scientific | P1122 | |
| Plasma Asher | Quorum tech | K1050X RF | Dieser Plasma-Ätzer/Asher/Reiniger wurde als Teil der Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF) der Duke University eingesetzt. |
| Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappverschluss für das Zellsieb | Corning | 352235 | |
| Serologische Pipette, 10 mL, einzeln verpackte | Corning | 356551 | |
| Serologische Pipette, 25 ml, einzeln verpackte | Corning | 356525 | |
| Serologische Pipette, 5 ml, einzeln verpackte | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0,22 & Mikro; m, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile Mikrozentrifugenröhrchen | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 Zellkulturkolben mit Entlüftungskappe | Corning | 430641U | |
| Mit Gewebekulturen behandelte 12-Well-Platten | Corning | 353043 | |
| Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten | Corning | 353046 | |
| Vakuummodulator und perstaltische Pumpe (Zoe Culture Module) | Emulate | ZOE-CM1 | Organ Chip Bioreaktor |
| VE-Cadherin CD144 Anti-Human-Antikörper - APC konjugiert | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Breit abgeschrägter Zelllifter | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 MicroBead Kit, menschlich | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS Säulen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Referenzen
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....
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Nachdrucke und Genehmigungen
