Summary
تم وصف إجراء جديد مفصل للتصوير الوظيفي للفئران المستيقظة ذات الرأس.
Abstract
التخدير ، الذي يشيع استخدامه في البحث العلمي قبل السريري والأساسي ، له تأثير اكتئابي على وظائف التمثيل الغذائي والخلايا العصبية والأوعية الدموية في الدماغ ويمكن أن يؤثر سلبا على النتائج الفسيولوجية العصبية. يعد استخدام الحيوانات المستيقظة للدراسات البحثية مفيدا ولكنه يشكل تحديا كبيرا يتمثل في الحفاظ على هدوء الحيوانات وثباتها لتقليل القطع الأثرية الحركية خلال الحصول على البيانات. يعد التصوير المستيقظ في القوارض الأصغر حجما (مثل الفئران) شائعا جدا ولكنه يظل ضئيلا في الفئران لأن الفئران أكبر وأقوى ولديها ميل أكبر لمعارضة قيود الحركة وتثبيت الرأس على مدى الفترات الطويلة المطلوبة للتصوير. تم وصف نموذج جديد للتصوير العصبي للفئران المستيقظة المثبتة بالرأس باستخدام حبال مخيطة يدويا مخصصة ، وزرع رأس مطبوع 3D ، وأغطية رأس ، وإطار رأس. تشير النتائج التي تم الحصول عليها بعد تجربة واحدة من التحفيز أحادي الشارب إلى زيادة في شدة الاستجابة الوظيفية المثارة. إن اكتساب الاستجابة الوظيفية المستثارة من الفئران المستيقظة الثابتة الرأس أسرع من تلك الموجودة في الفئران المخدرة ، وهي موثوقة وقابلة للتكرار ويمكن استخدامها للدراسات الطولية المتكررة.
Introduction
يتم الحصول على معظم تحقيقات التصوير العصبي العلمية الأساسية وقبل السريرية والانتقالية من الحيوانات المخدرة1،2. يسهل التخدير التجريب ولكنه يؤثر باستمرار على عملية التمثيل الغذائي في الدماغ والجسم وضغط الدم ومعدل ضربات القلب3. يضيف نوع المخدر ومدة وطريقة الإعطاء متغيرات مربكة لتفسير البيانات التي يمكن أن تسهم في التكاثر والفشل الانتقالي4. يتمثل عنق الزجاجة الرئيسي لدراسات التصوير العصبي للفئران المستيقظة والمثبتة على الرأس في الحاجة إلى الحفاظ على الفئران ثابتة وهادئة طوال عمليات التحضير والحصول على البيانات. تنتج الحركات الصغيرة عناصر حركة غير مبررة ، والتي يمكن أن تؤثر سلبا على تحليل البيانات وتفسيراتها.
تم ابتكار نموذج جديد للتصوير العصبي من الفئران المستيقظة ذات الرأس الثابت باستخدام حبال مخصصة ، وغرسات رأس ثلاثية الأبعاد (3D) مطبوعة ، وأغطية رأس ، وإطار رأس يوفر العديد من المزايا لسهولة التجريب. غرسة الرأس 3D خفيفة وتغطي جزءا صغيرا من الجمجمة اللازمة للتبديل. تم تصميم غرسات الرأس والأغطية المطبوعة 3D باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). تم وصف بروتوكولات تحفيز الشارب ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات ، والنتائج من الفئران المخدرة بالتفصيل في العمل السابق5،6،7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت جميع الإجراءات متوافقة مع إرشادات المعهد الوطني للصحة ووافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة كاليفورنيا في إيرفين. تم استخدام سبعة ذكور وأنثى فأر واحدة (Sprague-Dawley ، الوزن: 185-350 جم) في هذه الدراسة. بعد الانتهاء من الدراسة ، تم التضحية بالفئران باستخدام جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون.
1. تصميم المكونات المختلفة
- تصميم غرسة الرأس:
- اصنع غرسة الرأس باستخدام برنامج CAD (الشكل 1C) وصممها لتصوير المنطقة الخلفية للبريجما والمجاورة لخط الوسط المتمركز على القشرة الحسية الجسدية. تأكد من أن غرسة الرأس تغطي مساحة من 0.9 مم إلى 1.9 مم على الجمجمة بعيدا عن منطقة التصوير.
- استخدم ثلاثة مسامير فقط لتثبيت غرسة الرأس على جمجمة الفئران. صمم جميع الثقوب اللولبية بحيث تظل على الجانب الآخر من خط الوسط في نصف الكرة المقابل لنصف الكرة المصورة.
- ضع قضيبا مجوفا من الداخل في الجزء العلوي من غرسة الرأس للسماح للأسلاك بتثبيت غطاء الرأس على غرسة الرأس كما هو موضح في الشكل 1 د.
- تصميم غطاء الرأس:
- تأكد من أن غطاء الرأس يغطي منطقة التصوير تماما ويحميها من أي نوع من الصدمات كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب. أضف انحناءا إلى غطاء الرأس بحيث يتماشى مع شكل الرأس دون التسبب في صعوبة الأنشطة اليومية للحيوان في الأقفاص المخصبة القياسية.
- اقطع الجانب الداخلي من غطاء الرأس في شكل مستطيل أوسع بحيث يمكن احتواء الجزء العلوي من غرسة الرأس فيه كما هو موضح في الشكل 1E. عموديا على هذا المستطيل ، قم بقطع منطقتين مستطيلتين أخريين لتثبيت غطاء الرأس على غرسة الرأس.
- مرر سلكا واحدا عبر الشريط العلوي المجوف لزرع الرأس لتثبيت غطاء الرأس على رأس الجرذ كما هو موضح في الشكل 1E-G. مرر السلك الثاني بنفس الطريقة.
ملاحظة: يمكن إزالة هذه الأسلاك بسهولة باستخدام كماشة أو ملقط. يتم توفير ملفات الطباعة ثلاثية الأبعاد (تنسيق الملف: STL) كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2.
- تصميم إطار الرأس:
- صمم إطار الرأس بطريقة يمكن أن يتحرك بها جزء مقطوع واحد عبر الشريط العلوي لزرع الرأس ويتم تثبيته باستخدام مشبك.
- قم بزاوية الجزء المقطوع الآخر لتوفير قوة إضافية للحفاظ على رأس الجرذ ثابتا لجعل الجانب المقابل متاحا تماما للتصوير. لغرض هذه الدراسة ، قم بقطع الصفيحة الفولاذية بقصاصات من الصفيح لإنتاج إطار الرأس (الشكل 1H ، I).
ملاحظة: يمكن طباعة هذا الجزء 3D كذلك.
2. تدريب الفئران الأولي
- اسمح للفئران بالتأقلم مع بيئة بيت الحيوان في أقفاصها لمدة 2-3 أيام.
- ابدأ في التعامل مع الفئران في غرفة هادئة. افتح القفص واطلب من المجرب وضع يده داخل القفص بالقرب من الجرذ لمدة 15-20 دقيقة للسماح للفأر بالتعود على العمران.
- بمجرد أن يظهر الجرذ الهدوء من خلال عدم الذهول أو الهروب من يدي المجرب ، التقط الجرذ برفق للتعامل معه. تعامل مع الجرذ لمدة 30-45 دقيقة كل يوم قبل تدريب حبال.
3. تدريب حبال
- تدريب الفئران لمدة 2-3 أيام على الأقل في الرافعات قبل الزرع الجراحي لزرع الرأس وغطاء الرأس.
- رتب إعداد الرافعة كما هو موضح في الشكل 2 أ. نظف إعداد الرافعة باستخدام مناديل الإيثانول.
ملاحظة: جميع الرافعات مخيطة يدويا ومصنوعة من مادة شبكية إما في الأسفل أو على كلا الجانبين كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ب. - للتدريب على حبال ، تخدير الفئران باستخدام 4 ٪ isoflurane للتحريض و 1 ٪ للصيانة حتى لا يكون هناك منعكس قرصة مخلب الخلفي.
- تحت تخدير الأيزوفلوران ، ضع الفئران على ورقة بلاستيكية مرنة بقياس 20 سم × 8 سم (الطول × العرض) ، حيث يتم تغطية 10 سم × 8 سم من الصفيحة البلاستيكية بالكامل بالجزء الأكثر ليونة من الفيلكرو.
ملاحظة: تخدير الفئران لتدريب حبال هو خطوة اختيارية ، تستخدم في المقام الأول للحد من التوتر والقلق. - في أول يومين من التدريب ، ضع الجرذ بإحكام في جورب طفل (بحجم 0-3 أشهر) مع إخراج الرأس من خلال ثقب صغير محفور في نهاية الجورب.
- لف قطعة صغيرة من الوسادة الماصة حول الجزء السفلي من الجسم للحفاظ على جفاف الفئران وجمع البراز.
- لف الفئران بقطعة قماش قطنية قابلة للتنفس (الحجم: 25 سم × 25 سم). ضع الجرذ على ورقة بلاستيكية تحتوي على شرائط فيلكرو ملتصقة بها.
- قم بتأمين الفئران على الصفيحة البلاستيكية باستخدام شرائط فيلكرو بعرض 0.5 سم على مسافة 3-6 مم عن بعضها البعض.
- تأمين الفئران في حبال. إزالة تخدير الغاز. السماح للفأر بالتعافي من تخدير الغاز في حبال.
- عندما يبدأ الجرذ في الخفق ، قدم بضع قطرات من محلول السكروز بنسبة 10٪ كمكافأة كل 10-15 دقيقة.
- قدم الفئران بشكل عشوائي مع المحفزات الحسية التي سيتم استخدامها أثناء التصوير (هنا تحفيز شارب ، كل 15-25 دقيقة) لجعلها معتادة على المنبهات الحسية. تحفيز الشعيرات يدويا على فترات عشوائية.
- درب الجرذ في المعلاق لمدة 1 ساعة في اليوم 1 ، و 2 ساعة في اليوم 2 ، و 3 ساعات في اليوم 3 كما هو موضح في الشكل 2 ج.
4. التحضير قبل الجراحة
- اطبع غرسة الرأس وغطاء الرأس باستخدام الطابعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 1).
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية وأغطية الرأس (الغرسات والأغطية) عن طريق غمر المعدات في مبيد الجراثيم Metricide28 لمدة 10 ساعات. شطف الأدوات جيدا بالماء المعقم قبل الجراحة مباشرة.
- تعريض الفئران إلى 4٪ إيزوفلوران ثم الحفاظ على 1٪ -2٪ إيزوفلوران حتى لا يكون هناك منعكس قرصة مخلب الخلفي. يمكن إجراء هذه الجراحة تحت العديد من أنواع التخدير ، مثل الأيزوفلوران ، بنتوباربيتال الصوديوم ، وكيتامين زيلازين.
- حقن الأتروبين (0.05 ملغم / كغم) في العضل لتقليل الإفرازات المخاطية للمساعدة في التنفس.
- حلق رأس الجرذ 5 مم متمركزا حول خط الوسط باستخدام أداة تشذيب الشعر بدءا من بين العينين إلى مؤخرة الأذنين.
- راقب التشبع الجزئي للأكسجين ومعدل ضربات القلب من خلال مقياس التأكسج النبضي ومسبار مراقبة معدل ضربات القلب المثبت على الساق الخلفية للفئران.
- امسح رأس الجرذ والمنطقة المحيطة به ثلاث مرات بجولات متناوبة من البيتادين ومناديل الكحول بنسبة 70٪.
- إصلاح الفئران في نظام stereotaxic.
- أدخل مسبار مستقيمي مشحم بالفازلين لقياس درجة حرارة جسم الفئران والحفاظ عليها من خلال نظام التغذية المرتدة لبطانية التدفئة لتجنب انخفاض حرارة الجسم بعد إعطاء التخدير.
- تطبيق الليدوكائين هيدروكلوريد المخدر الموضعي بتركيز 20 ملغ/ مل، 0.07 ملغ/كغ +/- 0.2 من وزن الجسم تحت الجلد في موقع الجراحة.
- ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف.
- تطبيق 2٪ مخدر موضعي تحت الجلد على موقع الجراحة.
- حقن 3 مل من محلول الرنين المرضع في درجة حرارة الغرفة تحت الجلد لمنع الجفاف وتوفير التغذية أثناء الجراحة.
5. الجراحة
- قم بإزالة جزء الجلد فوق موقع الجراحة (قطره 4 مم متمركز حول خط الوسط ومركز الرأس) باستخدام مقص جراحي حاد. تشريح وإزالة جزء من الجلد (~ قطر 2 مم ، فوق القشرة الحسية الجسدية اليسرى) بين الأذن والعين على الجزء الزمني من الرأس.
- قم بإزالة أنسجة الجلد الكامنة (القحف) باستخدام مشرط لكشف الجمجمة. تنظيف الجمجمة باستخدام شاش القطن المعقم.
- سحب / استئصال العضلات الصدغية لكشف الحجم المطلوب لمنطقة التصوير [7.5 مم × 7.5 مم لهذه الدراسة].
- فضح الجمجمة على نصف الكرة المقابل لزرع الرأس. ضع غرسة الرأس على الجمجمة للتأكد من موقع مسامير التثبيت للزرع كما هو موضح في الشكل 2D-F.
- ضع علامة على الجمجمة لحفر البراغي باستخدام India Ink باستخدام مثقاب الحفر 1. حفر ثقوب لدغ للبراغي باستخدام مثقاب الأسنان 3. قم بربط غرسة الرأس في مكانها.
- تجفيف الجمجمة باستخدام الشاش المعقم. ضع طبقة رقيقة من لاصق الأنسجة حول وتحت غرسة الرأس للصقها على الجمجمة. ضع طبقة من الأسمنت السني لدعم غرسة الرأس في مكانها واترك الأسمنت يجف لمدة 2-3 دقائق.
ملاحظة: يضمن استخدام لاصق الأنسجة بالإضافة إلى الأسمنت السني ثباتا قويا8. - باستخدام مثقاب الأسنان 3 ، قم بتخفيف مساحة 7.5 مم × 7.5 مم على الجانب الأيسر من الجمجمة خلف البريغما مباشرة والجانب إلى خط الوسط. قم بتقطيع الجمجمة إلى ~ 50 ميكرومتر كما هو موضح في الشكل 3 أ.
- ضع مرهم مضاد حيوي موضعي على موقع الجراحة ثم قم بتغطيته بطبقة رقيقة من مطاط السيليكون لحماية الجمجمة الرقيقة كما هو موضح في الشكل 3 ب. قم بتغطية موقع الجراحة باستخدام غطاء الرأس كما هو موضح في الشكل 3C. قم بتثبيته في مكانه باستخدام قطعتين صغيرتين من الأسلاك تمر عبر كل من غرسة الرأس وغطاء الرأس كما هو موضح في الشكل 3D ، E. ضع مطاط السيليكون لتغطية غطاء الرأس والجمجمة لتثبيت غطاء الرأس بشكل أكبر على رأس الجرذ كما هو موضح في الشكل 3F.
ملاحظة: يوفر مطاط السيليكون حماية إضافية للجمجمة الرقيقة. - حقن الفئران مع فلونيكسين ميغلومين (2.5 ملغم / كغم) تحت الجلد لإدارة الألم والالتهاب. للوقاية من العدوى، يتم حقن المضاد الحيوي إنروفلوكساسين (22.7 ملغ/مل، 10 ملغ/كغ +/-.01)، داخل الصفاق.
- انقل الجرذ إلى غرفة الإنعاش للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة جسمه ببطانية دافئة ومصباح حراري. راقب الجرذ باستمرار حتى يستعيد وعيه ويمكنه الحفاظ على راقد القص.
- أعد الجرذ إلى قفصه المنفصل بمجرد أن يتعافى تماما.
- لمدة 3 أيام القادمة، يتم تطبيق فلونيكسين والبوبرينورفين لتخفيف الالتهاب والألم والوقاية من العدوى مرتين يوميا.
6. التصوير أثناء اليقظة
- تخدير الفئران مع 4 ٪ إيزوفلوران للتحريض و 1 ٪ للصيانة عندما لا يكون هناك منعكس قرصة مخلب الخلفي. حقن أسيبرومازين (0.3-0.5 ملغ/كغ) تحت الجلد.
ملاحظة: هذا التركيز من الأسيبرومازين أقل من مستويات التخدير الخفيفة ويساعد فقط في الحفاظ على هدوء الفئران طوال عملية التصوير. - باستخدام شرائط مخصصة من الفيلكرو ، ثبت الفئران على الورقة البلاستيكية المستخدمة أثناء إجراءات التدريب. لف الجزء السفلي من الجسم باستخدام وسادة امتصاص وضع الفئران بإحكام في حبال.
- قم بإزالة مطاط السيليكون. قم بإزالة غطاء الرأس عن طريق إزالة أسلاك التثبيت. ثبت إطار الرأس في غرسة الرأس كما هو موضح في الشكل 2G.
- قفل إطار الرأس في المشابك كما هو موضح في الشكل 2H ، I.
- إزالة تخدير الغازات. اغسل منطقة التصوير بمحلول ملحي 3x ونظفها بشاش مبلل. جفف منطقة التصوير واصنع بئرا حول منطقة التصوير باستخدام الفازلين. املأ البئر بمحلول ملحي معقم وقم بتغطيته بشريحة زجاجية (الشكل 2E).
- الرجوع إلى إجراءات الاستحواذ للتصوير البصري للإشارة الجوهرية ، وبروتوكول تحفيز الشارب ، وتحليل البيانات وعرضها ، والتي تمت مناقشتها بالتفصيل سابقا 6,7.
- طوال التجربة ، راقب الفئران بحثا عن علامات الإثارة والأرق ، والتي يمكن تقليلها بشكل أكبر عن طريق تغطية عيون الفئران بقطعة قماش ناعمة أو شاش (اختياري).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض إشارات التصوير البصري التمثيلية من تجربة واحدة لفأر مخدر والاستجابة المجمعة (من 40 تجربة تم جمعها) لفأر مستيقظ (الشكل 4). يمكن تصور شدة الإشارة لتحفيز الشعيرات المفردة للفأر المستيقظ عند عتبة أعلى من الفئران المخدرة ، مما يدل على إشارة أقوى من الحيوان المستيقظ. يتم تحفيز شعيرات C2 للفئران عند 5 هرتز لمدة 1 ثانية ، ويتم عرض الاستجابة الوظيفية كتغيير كسري مقارنة بخط الأساس. المناطق الداكنة (تحت العتبة السلبية) هي المناطق الرئيسية للنشاط العصبي ، وتظهر المناطق البيضاء الساطعة (فوق العتبة الإيجابية) استجابة الدم المؤكسجة للتحفيز9. تتم محاذاة الصور بحيث يكون من اليسار إلى اليمين من المنضدة إلى الذيلية (C) ومن أعلى إلى أسفل هو الاتجاه الإنسي إلى الجانبي (L) ، كما هو موضح بالأسهم.
الشكل 1: غطاء الرأس وزرع الرأس وإطار الرأس. (أ) غطاء الرأس (المنظر العلوي): يظهر جانب المنظر العلوي الانحناء للمحاذاة على طول انحناء الرأس لحماية الرأس ؛ الجزءان المستطيلان المجوفان مخصصان لمرور الأسلاك المعدنية عبر غطاء الرأس. (ب) يظهر غطاء الرأس (المنظر السفلي) القطع المستطيل الأوسع ليلائم الشريط العلوي لغرسة الرأس والقطعين العموديين للأسلاك للتحرك عبر الغرسة وغطاء الرأس لإبقائهما في مكانهما. (ج) غرسة الرأس مع الثقوب الثلاثة المقطوعة لمسامير التثبيت. يمكن تعديل مواضع مسامير التثبيت على غرسة الرأس وفقا لرأس الفئران. (د) غطاء الرأس وزرع الرأس (منظر جانبي) ؛ يظهر المنظر الجانبي لغرسة الرأس الشريط المستطيل المجوف من الداخل للسماح للسلك بالمرور لتثبيت غطاء الرأس على غرسة الرأس. (E-G) منظر لزرع الرأس مثبت في غطاء الرأس من خلال قطعة سلكية واحدة ؛ منظر سفلي ومنظر جانبي ومنظر علوي لإظهار كيفية تركيب غرسة الرأس داخل غطاء الرأس. (H) إطار الرأس ، (I) زرع الرأس مثبت في إطار الرأس. المسافة بين خطين على المقياس (كما هو موضح بالمستطيل الأزرق) هي 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الرافعات ، وزرع الرأس ، وتثبيت إطار الرأس للتصوير المستيقظ والمثبت على الرأس. (أ ، ب) حبال مخصصة مع مادة المعاوضة إما للأسفل فقط أو كلا الجانبين ؛ (ج) فأر يوضع على الصفيحة البلاستيكية ، مثبتا بشرائط فيلكرو ، أثناء تدريب الرافعة ؛ (D-F) مناظر علوية وجانبية لزرع الرأس على جمجمة الفئران فوق نصف الكرة المقابل. تظهر الخطوط المنقطة منطقة التصوير. تظهر المناظر العلوية والجانبية بوضوح الثقوب الثلاثة لتثبيت غرسة الرأس في الجمجمة باستخدام برغي التثبيت. (ه) يوضح المنظر الجانبي الشريط المجوف الذي يمر من خلاله السلك لتثبيت غطاء الرأس بغرسة الرأس عندما لا يتم تصوير الفئران. مرت ساق واحدة من إطار الرأس عبر الجزء المجوف من غرسة الرأس لتصوير قشرة الفئران. (ز) إطار الرأس من خلال غرسة الرأس للفئران المستيقظة والمثبتة الرأس. (H) إطار الرأس من خلال غرسة الرأس مع تثبيت ساقيه للتصوير المستيقظ والثابت للرأس (I) للفئران المستيقظة المثبتة على الرأس أثناء جلسات التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: وضع غرسة الرأس. أ: تحضير الجمجمة الرقيقة للتصوير المستيقظ المثبت بالرأس. (ب) غرسة رأس مثبتة على جمجمة الفئران ومنطقة تصوير الجمجمة الرقيقة المغطاة بالسيليكون المطاطي. (ج) غطاء الرأس يوضع على غرسة الرأس. (د، ه) غطاء الرأس مثبت على غرسة الرأس باستخدام أسلاك معدنية مطلية. (F) غطاء الرأس والمنطقة المحيطة مغطاة بالسيليكون المطاطي لمزيد من الدعم في تثبيت الجمجمة وحمايتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاستجابات الوظيفية لتحفيز شعيرات C2. (أ) استجابة وظيفية تمثيلية لتجربة واحدة لتحفيز شارب C2 5 هرتز لمدة 1 ثانية من تصوير الفئران المستيقظة والمثبتة على الرأس ، مع استمرار كل تجربة لمدة 7 ثوان مع فاصل زمني بين التجارب قدره 3 ثوان ± 2 ثانية. عتبة تمثيل التدرج الرمادي للتغير الجزئي من خط الأساس (-3.5 × 10−3 إلى 3.5 × 10−3). (ب) استجابة وظيفية تمثيلية لتجربة واحدة لتحفيز شعيرات C2 5 هرتز لمدة 1 ثانية من فأر مخدر (بنتوباربيتال الصوديوم). عتبة تمثيل التدرج الرمادي للتغير الجزئي من خط الأساس (-2.5 × 10−4 إلى 2.5 × 10−4). الاستجابة الوظيفية للفأر المستيقظ الثابت الرأس أقوى 140 مرة من استجابة الجرذ المخدر. كل إطار هو إطار 0.5 ثانية. تتم محاذاة الصور بحيث يكون من اليسار إلى اليمين من المنقار إلى الذيلية ومن أعلى إلى أسفل من الاتجاه الإنسي إلى الاتجاه الجانبي كما هو موضح في الأسهم. المناطق الداكنة (تحت العتبة السلبية) هي المناطق الرئيسية للنشاط العصبي ، وتظهر المناطق البيضاء الساطعة (فوق العتبة الإيجابية) استجابة الدم المؤكسجة للتحفيز. شريط المقياس = 1 مم. الاختصارات: C = الذيلية ؛ L = الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: ملف طباعة 3D لزرع الرأس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: ملف طباعة 3D لغطاء الرأس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر استخدام تصوير الفئران المستيقظ والثابت للرأس العديد من المزايا من حيث السهولة والتخصيص. تسمح الرافعات المصممة خصيصا بلف الفئران من خلال مادة شبكية قابلة للتنفس ، مما يلغي الحاجة إلى إحاطة الحيوانات في غرف تقييد بلاستيكية مغلقة لفترات طويلة من الزمن10,11. تبقى الفئران هادئة وخالية من الإجهاد طوال الفترات الطويلة لجلسات التصوير المتتالية باستخدام جرعة منخفضة جدا من الأسيبرومازين أقل من مستويات التخدير الخفيف في الفئران (1.0-2.5 ملغم / كغم)12. للحفاظ على ثبات الجرذ والقضاء على القطع الأثرية المتحركة أثناء جلسات التصوير ، يتم استخدام شرائط الفيلكرو. يتم وضع شرائط الفيلكرو على بعد 3-6 مم من بعضها البعض لتجنب انقباض الجسم غير الضروري لساعات طويلة. يتم تدريب الفئران وتعويدها على الرافعات في سن مبكرة لضمان بقائها هادئة ومريحة في الرافعات أثناء التحضير والحصول على البيانات. بناء على النتائج الأولية ، فإن الفئران الصغيرة التي تزن حوالي 150-175 جم أسهل وأسرع في التدريب من الفئران الأكبر سنا.
تزن غرسة الرأس على رأس الجرذ 0.174 جم فقط ، ويزن غطاء الرأس القابل للإزالة 1.483 جم. تغطي غرسة الرأس مساحة من 0.5 سم إلى 1.5 سم في نصف الكرة الأرضية ، مما يسمح بالوصول الكامل إلى نصف الكرة الآخر للتصوير العصبي. يضمن حجم غطاء الرأس تغطية كاملة لموقع الجراحة. لا يبدو أن أوزان غرسة الرأس وغطاء الرأس تعيق الحركة والأنشطة اليومية ، ويمكن إيواء الفئران معا في أقفاص قياسية. باستخدام طريقة تقييد الرأس والجسم هذه ، يمكن تصوير الفئران لمدة 2-3 ساعات في كل مرة في أيام مختلفة للدراسات الطولية. يمكن إجراء جلسات تصوير متعددة على فأر واحد لمدة تصل إلى 3 أشهر على الأقل باستخدام هذا الإعداد. يستغرق ما مجموعه 25 دقيقة لطباعة 3D زرع الرأس وغطاء الرأس. الأجزاء قابلة للتخصيص بسهولة اعتمادا على حجم القوارض ويمكن أيضا تخصيصها لاستخدامها في الفئران. بالنسبة للدراسات التي تتطلب تمايز الفئران ، يمكن أن توفر الألوان والمواد المختلفة سهولة التعرف عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تخصيص الجزء العلوي من الغطاء لإضافة رموز أو أرقام أو أحرف لسهولة التعرف عليها.
هناك عدة خطوات مهمة لنجاح عملية الزرع والتصوير ، وأهمها تدريب الفئران وتعويدها. يتم تقديم الفئران بشكل عشوائي مع المحفزات الحسية لتقليل إمكانية التعلم الترابطي ، والتي يمكن أن تؤثر على نتائج التصوير. يجب أن تكون الجراحة وجميع الأدوات الجراحية معقمة لمنع العدوى ، واستخدام المضادات الحيوية المحلية أمر حتمي. يعد استخدام الأسيبرومازين في بداية التصوير أمرا مهما للحفاظ على هدوء الحيوانات وهدوئها لتجنب الحركات غير الضرورية أثناء جلسات التصوير. يجب أن تكون جمجمة الجرذ جافة للتثبيت المناسب ، ويجب أن تكون طبقة الأسمنت السني المترسب رقيقة بما يكفي لغطاء الرأس لتناسب غرسة الرأس.
بالنسبة للدراسة الحالية ، تركزت منطقة التصوير على القشرة الحسية الجسدية. تبلغ أبعاد المنطقة الرقيقة حوالي 7.5 مم × 7.5 مم ، وهو مدى المساحة التي يمكن تصويرها في الدراسة الحالية. ومع ذلك ، يمكن زيادة المساحة المصورة إلى 11 مم × 11 مم إذا لزم الأمر. ميزة أخرى لهذا التصميم هي أنه يسمح بتصوير المنطقة الرقيقة بأكملها على الرغم من انحناء القشرة.
تتطلب غرسات الرأس التي تم الإبلاغ عنها سابقا ما يقرب من 7-12 برغي تثبيت لتثبيت غرسة الرأس على رأس الجرذ13,14. هذا يمنع تصوير منطقة أكبر من خلال إعداد الجمجمة الرقيقة. تتطلب طريقة التثبيت الأخرى تثبيت مادة راتنجية على مساحة كبيرة باستخدام مسامير الرأس ، مما يجعل الجمجمة غير قابلة للوصول للتصوير14. يتطلب التصوير المستيقظ للفئران باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي تثبيت الحيوانات في أنابيب أسطوانية ، مما يجعل تجارب التصوير مرهقة للحيوانات11,15. في بعض الإعدادات الأخرى ، تبرز غرسة الرأس من الرأس ويمكن أن تتشابك في أقفاص قياسية16,17. تعمل غرسة الرأس وغطاء الرأس على التخلص من استخدام تثبيت الشرائح الزجاجية وتسطيح الجمجمة الرقيقة للتصوير المزمن18,19. حجم زرع الرأس واستخدام الانحناء على غطاء الرأس يلغي الحاجة إلى إجراء تغييرات على الأقفاص القياسية كما هو الحال في الإجراءات المزمنة الأخرى18,19. تعتبر غرسات الرأس في الفئران أسهل لأنه يتم استخدام تكوين صمولة ومسمار واحد فقط ، وهو أمر غير ممكن في الفئران ، حيث أن الفئران أقوى بكثير وأكثر صعوبة في الحفاظ على ثباتها20.
يتمثل الحد من غرسة الرأس في أنه على الرغم من صغر حجمها ، إلا أنها تتطلب تثبيت الغرسة على الجمجمة باستخدام البراغي. زرع الرأس ضروري للحفاظ على رأس الحيوان ثابتا ولكنه يحد من تصوير دماغ الفئران بالكامل. ومع ذلك ، فإن ميزة استخدام غرسة الرأس هذه هي أنه يمكن استخدامها لتصوير منطقة أوسع للتحفيز الحسي المستثار باستخدام طرق تصوير عصبي مختلفة مثل التصوير البصري للإشارة الجوهرية ، والتصوير المقطعي للتماسك البصري دوبلر ، وتصوير البقع بالليزر.
تميل التمثيلات الوظيفية القشرية القائمة على الإشارات الجوهرية للفئران المستيقظة والمثبتة الرأس إلى أن تكون أقوى في شدتها من الفئران المخدرة باستخدام نفس بروتوكول تحفيز الشارب . تم الإبلاغ عن زيادة مماثلة في قوة استجابة الإشارة الجوهرية المستحثة في القرودالمستيقظة 21,22. العمل الحالي مستمر لتحسين تصميم غرسة الرأس وغطاء الرأس لبيئات أكثر تحديا مثل الموائل الطبيعية23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
نعترف بكلارا جونز وجيمس ستيروالت ولين هوانغ ويونغ جون ها وأميرسهيل زاريه لمساعدتهم أثناء تدريب الفئران وإعداد الرافعات. تم توفير التمويل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة ، رقم المنحة: NS119852) ومؤسسة Leducq (رقم المنحة: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
