Summary
जागृत, सिर-निश्चित चूहों की कार्यात्मक इमेजिंग के लिए एक विस्तृत नई प्रक्रिया का वर्णन किया गया है।
Abstract
एनेस्थेटिक्स, आमतौर पर प्रीक्लिनिकल और मौलिक वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग किया जाता है, मस्तिष्क के चयापचय, न्यूरोनल और संवहनी कार्यों पर अवसादग्रस्तता प्रभाव डालता है और न्यूरोफिज़ियोलॉजिकल परिणामों पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है। अनुसंधान अध्ययनों के लिए जागृत जानवरों का उपयोग फायदेमंद है, लेकिन डेटा अधिग्रहण के दौरान गति कलाकृतियों को कम करने के लिए जानवरों को शांत और स्थिर रखने की प्रमुख चुनौती है। छोटे आकार के कृन्तकों (जैसे, चूहों) में अवेक इमेजिंग बहुत आम है, लेकिन चूहों में कम रहती है क्योंकि चूहे बड़े, मजबूत होते हैं, और इमेजिंग के लिए आवश्यक लंबी अवधि में आंदोलन संयम और सिर निर्धारण का विरोध करने की अधिक प्रवृत्ति रखते हैं। अनुकूलित हाथ-सिलाई स्लिंग, 3 डी-मुद्रित सिर प्रत्यारोपण, हेड कैप और एक हेडफ्रेम का उपयोग करके जागृत, सिर-निश्चित चूहों के न्यूरोइमेजिंग का एक नया मॉडल वर्णित है। एकल-मूंछ उत्तेजना के एकल परीक्षण के बाद प्राप्त परिणाम उत्पन्न कार्यात्मक प्रतिक्रिया की तीव्रता में वृद्धि का सुझाव देते हैं। जागृत, सिर-स्थिर चूहों से उत्पन्न कार्यात्मक प्रतिक्रिया का अधिग्रहण एनेस्थेटाइज्ड चूहों की तुलना में तेज है, विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और इसका उपयोग बार-बार अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
Introduction
अधिकांश बुनियादी, प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल वैज्ञानिक न्यूरोइमेजिंग जांच एनेस्थेटाइज्ड जानवरों 1,2 से प्राप्त की जाती हैं। एनेस्थेटिक्स प्रयोग को आसान बनाते हैं लेकिन लगातार मस्तिष्क और शरीर के चयापचय, रक्तचाप और हृदय गति को प्रभावित करतेहैं। एनेस्थेटिक का प्रकार और प्रशासन की अवधि और मार्ग डेटा व्याख्या में भ्रामक चर जोड़ते हैं जो प्रजनन क्षमता और अनुवादविफलताओं में योगदान कर सकते हैं। जागृत, सिर-निश्चित चूहे न्यूरोइमेजिंग अध्ययनों की एक प्रमुख बाधा तैयारी और डेटा अधिग्रहण प्रक्रियाओं के दौरान चूहे को स्थिर और शांत रखने की आवश्यकता है। छोटे आंदोलन अनुचित गति कलाकृतियों का उत्पादन करते हैं, जो डेटा विश्लेषण और व्याख्याओं पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकते हैं।
अनुकूलित स्लिंग, त्रि-आयामी (3 डी)-मुद्रित सिर प्रत्यारोपण, हेड कैप और एक हेडफ्रेम का उपयोग करके जागृत, सिर-स्थिर चूहों से न्यूरोइमेजिंग का एक नया मॉडल तैयार किया गया है जो आसान प्रयोग के लिए कई फायदे प्रदान करता है। 3 डी हेड इम्प्लांट हल्का होता है और ट्रांसफिक्सिंग के लिए आवश्यक खोपड़ी के एक छोटे से हिस्से को कवर करता है। 3 डी-मुद्रित सिर प्रत्यारोपण और कैप कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डिज़ाइन किए गए हैं। मूंछ उत्तेजना, डेटा अधिग्रहण, डेटा विश्लेषण और एनेस्थेटाइज्ड चूहों के परिणामों के प्रोटोकॉल को पिछले काम 5,6,7 में विस्तार से वर्णित किया गया है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाएं राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुरूप थीं और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित थीं। इस अध्ययन में सात नर और एक मादा चूहा (स्प्राग-डॉवले, वजन: 185-350 ग्राम) का उपयोग किया गया था। अध्ययन पूरा होने के बाद, कार्बन डाइऑक्साइड ओवरडोज का उपयोग करके चूहों की बलि दी गई।
1. विभिन्न घटकों का डिजाइन
- सिर प्रत्यारोपण का डिजाइन:
- सीएडी सॉफ्टवेयर (चित्रा 1 सी) का उपयोग करके सिर प्रत्यारोपण करें और इसे ब्रेग्मा के पीछे के क्षेत्र और सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स पर केंद्रित मध्य रेखा से सटे क्षेत्र को चित्रित करने के लिए डिज़ाइन करें। सुनिश्चित करें कि सिर प्रत्यारोपण इमेजिंग क्षेत्र से दूर खोपड़ी पर 0.9 मिमी से 1.9 मिमी के क्षेत्र को कवर करता है।
- चूहे की खोपड़ी पर सिर प्रत्यारोपण को लंगर डालने के लिए केवल तीन स्क्रू का उपयोग करें। सभी स्क्रू छेदों को डिज़ाइन करें ताकि वे छवि वाले गोलार्ध के विपरीत गोलार्ध में मध्य रेखा के विपरीत तरफ रहें।
- सिर प्रत्यारोपण के ऊपरी भाग में अंदर से खोखली एक पट्टी रखें ताकि तार सिर की टोपी को सिर प्रत्यारोपण में ठीक कर सकें जैसा कि चित्र 1 डी में दिखाया गया है।
- हेड कैप का डिजाइन:
- सुनिश्चित करें कि हेड कैप इमेजिंग क्षेत्र को पूरी तरह से कवर करता है और इसे किसी भी प्रकार के आघात से बचाता है जैसा कि चित्रा 1 ए, बी में दिखाया गया है। सिर की टोपी में एक वक्रता जोड़ें ताकि यह मानक समृद्ध पिंजरों में जानवर की दैनिक गतिविधियों में कठिनाई पैदा किए बिना सिर के आकार में संरेखित हो।
- सिर की टोपी के आंतरिक हिस्से को एक व्यापक आयताकार आकार में काटें ताकि सिर प्रत्यारोपण का ऊपरी हिस्सा इसमें फिट हो सके जैसा कि चित्र 1 ई में दिखाया गया है। इस आयत के लंबवत, सिर की टोपी को सिर प्रत्यारोपण में लंगर डालने के लिए दो अन्य आयताकार क्षेत्रों को काटें।
- चूहे के सिर पर सिर की टोपी के निर्धारण के लिए सिर प्रत्यारोपण के ऊपरी खोखले बार के माध्यम से एक तार पारित करें जैसा कि चित्र 1 ई-जी में दिखाया गया है। दूसरे तार को भी इसी तरह से पास करें।
नोट: इन तारों को आसानी से प्लियर्स या फोर्सप्स का उपयोग करके हटाया जा सकता है। 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइलें पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 के रूप में प्रदान की जाती हैं (फ़ाइल प्रारूप: एसटीएल)।
- हेड फ्रेम का डिजाइन:
- हेड फ्रेम को इस तरह से डिज़ाइन करें कि एक कटा हुआ हिस्सा हेड इम्प्लांट के ऊपरी बार के माध्यम से आगे बढ़ सके और क्लैंप का उपयोग करके तय किया जाए।
- दूसरे कटे हुए हिस्से को एंगल करें ताकि चूहे के सिर को स्थिर रखने के लिए अतिरिक्त ताकत मिल सके ताकि विपरीत पक्ष इमेजिंग के लिए पूरी तरह से सुलभ हो सके। इस अध्ययन के उद्देश्य के लिए, हेड फ्रेम (चित्रा 1 एच, आई) का उत्पादन करने के लिए टिन स्निप्स के साथ स्टील प्लेट काटें।
नोट: यह भाग 3 डी मुद्रित भी किया जा सकता है।
2. प्रारंभिक चूहा प्रशिक्षण
- चूहों को 2-3 दिनों के लिए अपने पिंजरों में विवेरियम वातावरण में रहने दें।
- एक शांत कमरे में चूहे को संभालना शुरू करें। पिंजरे को खोलें और प्रयोगकर्ता को चूहे के पास पिंजरे के अंदर 15-20 मिनट के लिए अपना हाथ डालें ताकि चूहे को आदत हो सके।
- एक बार जब चूहा चौंककर या प्रयोगकर्ता के हाथों से दूर नहीं भागकर शांति प्रदर्शित करता है, तो धीरे से चूहे को हैंडलिंग के लिए उठाएं। स्लिंग प्रशिक्षण से पहले प्रत्येक दिन 30-45 मिनट के लिए चूहे को संभालें।
3. स्लिंग प्रशिक्षण
- सिर प्रत्यारोपण और हेड कैप के सर्जिकल प्रत्यारोपण से पहले स्लिंग में कम से कम 2-3 दिनों के लिए चूहों को प्रशिक्षित करें।
- स्लिंग सेटअप को व्यवस्थित करें जैसा कि चित्रा 2 ए में दिखाया गया है। इथेनॉल वाइप्स का उपयोग करके स्लिंग सेटअप को साफ करें।
नोट: सभी स्लिंग हाथ से सिले हुए हैं और नीचे या दोनों तरफ एक जाल सामग्री से बने होते हैं जैसा कि चित्र 2 ए, बी में दिखाया गया है। - स्लिंग प्रशिक्षण के लिए, प्रेरण के लिए 4% आइसोफ्लुरेन और रखरखाव के लिए 1% का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें जब तक कि कोई हिंद पंजा पिंच रिफ्लेक्स न हो।
- आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत, चूहों को 20 सेमी x 8 सेमी (लंबाई x चौड़ाई) मापने वाली लचीली प्लास्टिक शीट पर रखें, जहां प्लास्टिक शीट का 10 सेमी x 8 सेमी वेल्क्रो के नरम हिस्से के साथ पूरी तरह से कवर किया जाता है।
नोट: स्लिंग प्रशिक्षण के लिए चूहों को एनेस्थेटाइज करना एक वैकल्पिक कदम है, जिसका उपयोग मुख्य रूप से तनाव और चिंता को कम करने के लिए किया जाता है। - प्रशिक्षण के पहले 2 दिनों के लिए, चूहे को एक बेबी सॉक (आकार 0-3 महीने) में डाल दें, जिसमें सिर को सॉक के अंत में एक छोटे से छेद के माध्यम से बाहर निकाला जाए।
- चूहे को सूखा रखने और मल-मूत्र इकट्ठा करने के लिए शरीर के निचले हिस्से के चारों ओर शोषक पैड का एक छोटा टुकड़ा लपेटें।
- चूहे को एक सांस लेने योग्य सूती कपड़े में लपेटें (आकार: 25 सेमी x 25 सेमी)। चूहे को एक प्लास्टिक शीट पर रखें जिसमें वेल्क्रो स्ट्रिप्स चिपके हुए हैं।
- इसके अलावा एक दूसरे से 3-6 मिमी की दूरी पर 0.5 सेमी चौड़ी वेल्क्रो स्ट्रिप्स का उपयोग करके चूहे को प्लास्टिक शीट से सुरक्षित करें।
- स्लिंग में चूहे को सुरक्षित करें। गैस एनेस्थीसिया को हटा दें। चूहे को स्लिंग में गैस संज्ञाहरण से ठीक होने दें।
- जब चूहा फेंटना शुरू कर देता है, तो हर 10-15 मिनट में इनाम के रूप में 10% सुक्रोज समाधान की कुछ बूंदें दें।
- यादृच्छिक रूप से संवेदी उत्तेजनाओं के साथ चूहे को प्रस्तुत करें जिसका उपयोग इमेजिंग के दौरान किया जाएगा (यहां मूंछ उत्तेजना, हर 15-25 मिनट) ताकि इसे संवेदी उत्तेजनाओं का आदी बनाया जा सके। यादृच्छिक अंतराल पर मूंछों को मैन्युअल रूप से उत्तेजित करें।
- चूहे को स्लिंग में दिन 1 घंटे, दिन 2 पर 2 घंटे और दिन 3 पर 3 घंटे के लिए प्रशिक्षित करें जैसा कि चित्र 2 सी में दिखाया गया है।
4. प्रीसर्जिकल तैयारी
- 3 डी प्रिंटर (चित्रा 1) का उपयोग करके हेड इम्प्लांट और हेड कैप प्रिंट करें।
- 10 घंटे के लिए मीट्रिकाइड 28 रोगाणुनाशक में उपकरण डुबोकर सभी सर्जिकल उपकरणों और हेडपीस (प्रत्यारोपण और कैप्स) को निष्फल करें। सर्जरी से ठीक पहले बाँझ पानी के साथ उपकरणों को अच्छी तरह से धो लें।
- चूहे को 4% आइसोफ्लुरेन में उजागर करें और फिर 1% -2% आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखें जब तक कि कोई पिछला पंजा पिंच रिफ्लेक्स न हो। यह सर्जरी कई प्रकार के संज्ञाहरण के तहत की जा सकती है, जैसे कि आइसोफ्लुरेन, सोडियम पेंटोबार्बिटल और केटामाइन-ज़ाइलाज़िन।
- श्वास में मदद करने के लिए श्लेष्म स्राव को कम करने के लिए इंट्रामस्क्युलर रूप से एट्रोपिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें।
- आंखों के बीच से कान के पीछे तक शुरू होने वाले हेयर ट्रिमर का उपयोग करके मध्य रेखा के चारों ओर केंद्रित चूहे के सिर को 5 मिमी शेव करें।
- पल्स ऑक्सीमीटर के माध्यम से आंशिक ऑक्सीजन संतृप्ति और हृदय गति की निगरानी करें और चूहे के पिछले पैर को सुरक्षित हृदय गति मॉनिटर जांच करें।
- चूहे के सिर और आसपास के क्षेत्र को बीटाडाइन और 70% अल्कोहल वाइप्स के वैकल्पिक राउंड के साथ तीन बार पोंछें।
- चूहे को स्टीरियोटैक्सिक सिस्टम में ठीक करें।
- चूहे के शरीर के तापमान को मापने के लिए एक पेट्रोलियम जेली-स्नेहित रेक्टल प्रोब डालें और एनेस्थेटिक प्रशासन के बाद हाइपोथर्मिया से बचने के लिए हीटिंग कंबल की प्रतिक्रिया प्रणाली के माध्यम से इसे बनाए रखें।
- सर्जिकल साइट पर 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर, 0.07 मिलीग्राम / किग्रा + / -0.2 शरीर के वजन की एकाग्रता पर स्थानीय एनेस्थेटिक लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड का प्रबंधन करें।
- सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
- सर्जिकल साइट पर 2% स्थानीय एनेस्थेटिक चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
- निर्जलीकरण को रोकने और सर्जरी के दौरान पोषण प्रदान करने के लिए कमरे के तापमान पर लैक्टेटेड रिंगर के घोल के 3 एमएल इंजेक्ट करें।
5. सर्जरी
- तेज सर्जिकल कैंची का उपयोग करके सर्जिकल साइट (सिर के मध्य रेखा और केंद्र के आसपास केंद्रित 4 मिमी व्यास) पर त्वचा के हिस्से को हटा दें। सिर के अस्थायी हिस्से पर कान और आंख के बीच त्वचा के हिस्से (~ 2 मिमी व्यास, बाएं सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स पर) को विच्छेदित और हटा दें।
- खोपड़ी को उजागर करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करके, अंतर्निहित त्वचा (पेरिक्रैनियम) ऊतक को हटा दें। निष्फल कपास धुंध का उपयोग करके खोपड़ी को साफ करें।
- इमेजिंग क्षेत्र के लिए वांछित आकार को उजागर करने के लिए अस्थायी मांसपेशियों को वापस लेना / बचाव करना [इस अध्ययन के लिए 7.5 मिमी द्वारा 7.5 मिमी]।
- सिर प्रत्यारोपण के लिए खोपड़ी को विपरीत गोलार्ध पर उजागर करें। चित्र 2 डी-एफ में दिखाए गए अनुसार प्रत्यारोपण के लिए लंगर डालने वाले स्क्रू के स्थान का पता लगाने के लिए खोपड़ी पर सिर प्रत्यारोपण रखें।
- ड्रिल बिट 1 के साथ इंडिया इंक का उपयोग करके स्क्रू ड्रिल करने के लिए खोपड़ी को चिह्नित करें। डेंटल ड्रिल बिट 3 का उपयोग करके स्क्रू के लिए छेद ड्रिल करें। जगह में सिर प्रत्यारोपण को पेंच करें।
- बाँझ धुंध का उपयोग करके खोपड़ी को सुखाएं। सिर प्रत्यारोपण के चारों ओर और नीचे ऊतक चिपकने की एक पतली परत लागू करें ताकि इसे खोपड़ी से चिपकाया जा सके। सिर प्रत्यारोपण को आगे बढ़ाने के लिए दंत सीमेंट की एक परत लागू करें और सीमेंट को 2-3 मिनट के लिए सूखने दें।
नोट: दंत सीमेंट के अलावा ऊतक चिपकने वाला का उपयोग एक मजबूत पकड़ सुनिश्चित करताहै 8. - डेंटल ड्रिल बिट 3 का उपयोग करके, खोपड़ी के बाईं ओर 7.5 मिमी x 7.5 मिमी क्षेत्र को ब्रेग्मा के ठीक पीछे और मध्य रेखा के पार्श्व में पतला करें। खोपड़ी को ~ 50 μm तक पतला करें जैसा कि चित्र 3A में दिखाया गया है।
- सर्जिकल साइट पर सामयिक एंटीबायोटिक मलहम लागू करें और फिर पतली खोपड़ी की रक्षा के लिए इसे सिलिकॉन रबर की एक पतली परत के साथ कवर करें जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, हेड कैप का उपयोग करके सर्जिकल साइट को कवर करें। इसे सिर प्रत्यारोपण और हेड कैप दोनों के माध्यम से जाने वाले तारों के दो छोटे टुकड़ों के साथ ठीक करें जैसा कि चित्रा 3 डी, ई में दिखाया गया है। सिर की टोपी और खोपड़ी को कवर करने के लिए सिलिकॉन रबर लागू करें ताकि चूहे के सिर पर हेड कैप को स्थिर किया जा सके जैसा कि चित्र 3 एफ में दिखाया गया है।
नोट: सिलिकॉन रबर पतली खोपड़ी को अतिरिक्त सुरक्षा प्रदान करता है। - दर्द और सूजन प्रबंधन के लिए चूहे को फ्लूनिक्सिन मेग्लूमाइन (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इंजेक्ट करें। संक्रमण को रोकने के लिए, एनरोसाइट एंटीबायोटिक एनरोफ्लोक्सासिन (22.7 मिलीग्राम / मिलीलीटर, 10 मिलीग्राम / किग्रा + /
- एक वार्मिंग कंबल और हीट लैंप के साथ अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए चूहे को रिकवरी चैंबर में ले जाएं। चूहे को लगातार तब तक मॉनिटर करें जब तक कि वह होश में न आ जाए और स्टर्नल रिकंबेंसी बनाए रख सके।
- चूहे को पूरी तरह से ठीक होने के बाद अपने अलग पिंजरे में वापस कर दें।
- अगले 3 दिनों के लिए, सूजन और दर्द को कम करने के लिए फ्लूनिक्सिन और ब्यूप्रेनोर्फिन का प्रशासन करें और दिन में दो बार संक्रमण को रोकने के लिए एनरोसाइट करें।
6. जागृत इमेजिंग
- जब कोई पिछला पंजा पिंच रिफ्लेक्स नहीं होता है तो चूहे को प्रेरण के लिए 4% आइसोफ्लुरेन और रखरखाव के लिए 1% के साथ एनेस्थेटाइज करें। एसप्रोमाज़िन (0.3-0.5 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
नोट: एसीप्रोमाज़िन की यह एकाग्रता हल्के बेहोश करने के स्तर से नीचे है और केवल इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान चूहों को शांत रखने में मदद करती है। - वेल्क्रो की अनुकूलित स्ट्रिप्स का उपयोग करके, प्रशिक्षण प्रक्रियाओं के दौरान उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक शीट पर चूहे को ठीक करें। अवशोषण पैड का उपयोग करके शरीर के निचले हिस्से को लपेटें और चूहे को स्लिंग में रखें।
- सिलिकॉन रबर को हटा दें। फिक्सेशन तारों को हटाकर हेड कैप को हटा दें। जैसा कि चित्रा 2 जी में दिखाया गया है, हेड इम्प्लांट में हेडफ्रेम को ठीक करें।
- जैसा कि चित्रा 2 एच, आई में दिखाया गया है, हेडफ्रेम को क्लैंप में लॉक करें।
- गैस एनेस्थीसिया हटा दें। इमेजिंग क्षेत्र को खारा 3x के साथ फ्लश करें और गीली धुंध के साथ साफ करें। इमेजिंग क्षेत्र को सुखाएं और इमेजिंग क्षेत्र के आसपास पेट्रोलियम जेली का उपयोग करके एक कुआं बनाएं। कुएं को निष्फल लवण से भरें और कांच की स्लाइड (चित्रा 2 ई) के साथ कवर करें।
- आंतरिक सिग्नल ऑप्टिकल इमेजिंग, मूंछ उत्तेजना प्रोटोकॉल, और डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति के लिए अधिग्रहण प्रक्रियाओं का संदर्भ लें, जिन पर पहले विस्तार से चर्चा की गई है।
- प्रयोग के दौरान, आंदोलन और बेचैनी के संकेतों के लिए चूहों की निगरानी करें, जिसे नरम कपड़े या धुंध (वैकल्पिक) के साथ चूहों की आंखों को कवर करके और कम किया जा सकता है।
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Representative Results
एक एनेस्थेटाइज्ड चूहे के एकल परीक्षण से प्रतिनिधि ऑप्टिकल इमेजिंग संकेत और एक जागृत चूहे की अभिव्यक्त प्रतिक्रिया (40 एकत्र परीक्षणों की) को दिखाया गया है (चित्रा 4)। एक जागृत चूहे की एकल-मूंछ उत्तेजना के लिए संकेत तीव्रता को एनेस्थेटाइज्ड चूहे की तुलना में उच्च सीमा पर देखा जा सकता है, जो जागृत जानवर से एक मजबूत संकेत दिखाता है। चूहों की सी 2 मूंछें 1 सेकंड के लिए 5 हर्ट्ज पर उत्तेजित होती हैं, और कार्यात्मक प्रतिक्रिया को बेसलाइन की तुलना में आंशिक परिवर्तन के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। गहरे क्षेत्र (नकारात्मक सीमा से नीचे) न्यूरोनल गतिविधि के मुख्य क्षेत्र हैं, और उज्ज्वल सफेद क्षेत्र (सकारात्मक सीमा से ऊपर) उत्तेजना9 के लिए ऑक्सीजन युक्त रक्त प्रतिक्रिया दिखाते हैं। छवियों को इस तरह से संरेखित किया जाता है कि बाएं से दाएं रोस्ट्रल से पुच्छल (सी) तक हो और ऊपर से नीचे तक पार्श्व (एल) दिशा हो, जैसा कि तीरों द्वारा दिखाया गया है।
चित्र 1: हेड कैप, हेड इम्प्लांट और हेड फ्रेम। (ए) हेड कैप (टॉप व्यू): टॉप व्यू का साइड सिर की रक्षा के लिए सिर की वक्रता के साथ संरेखित करने के लिए वक्रता दिखाता है; दो खोखले आयताकार भाग धातु के तारों को हेड कैप से गुजरने के लिए हैं। (बी) हेड कैप (निचला दृश्य) सिर प्रत्यारोपण के शीर्ष बार में फिट होने के लिए व्यापक आयताकार कट दिखाता है और तारों को इम्प्लांट के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए दो लंबवत कट और उन्हें रखने के लिए हेड कैप दिखाता है। (सी) एंकरिंग स्क्रू के लिए तीन कट छेद के साथ हेड इम्प्लांट। सिर प्रत्यारोपण पर एंकरिंग स्क्रू की स्थिति को चूहे के सिर के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। (डी) हेड कैप और हेड इम्प्लांट (साइड व्यू); हेड इम्प्लांट का साइड व्यू आयताकार पट्टी को अंदर से खोखला दिखाता है ताकि तार सिर की टोपी को सिर प्रत्यारोपण तक लंगर डालने के लिए गुजर सके। (ई-जी) एक तार के टुकड़े के माध्यम से हेड कैप में लंगर डाले गए सिर प्रत्यारोपण का दृश्य; हेड कैप के अंदर हेड इम्प्लांट कैसे फिट किया जाता है, यह दिखाने के लिए नीचे का दृश्य, साइड व्यू और टॉप व्यू। (एच) हेड फ्रेम, (आई) हेड फ्रेम में लंगर डाला गया हेड इम्प्लांट। पैमाने पर दो रेखाओं के बीच की दूरी (जैसा कि नीले आयत द्वारा दिखाया गया है) 1 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: स्लिंग, हेड इम्प्लांट, और जागृत, सिर-फिक्स्ड इमेजिंग के लिए हेड फ्रेम का निर्धारण। (A, B) केवल नीचे या दोनों किनारों के लिए जाल सामग्री के साथ अनुकूलित स्लिंग; (सी) स्लिंग प्रशिक्षण के दौरान वेल्क्रो स्ट्रिप्स के साथ तय की गई प्लास्टिक शीट पर रखा गया चूहा; (डी-एफ) विपरीत गोलार्ध के ऊपर एक चूहे की खोपड़ी पर सिर प्रत्यारोपण के शीर्ष और साइड दृश्य। डॉटेड लाइनें इमेजिंग क्षेत्र दिखाती हैं। शीर्ष और साइड दृश्य स्पष्ट रूप से एंकरिंग स्क्रू के साथ खोपड़ी में सिर प्रत्यारोपण को ठीक करने के लिए तीन छेद दिखाते हैं। (ई) साइड व्यू उस खोखले बार को दर्शाता है जिसके माध्यम से तार सिर की टोपी को सिर प्रत्यारोपण में लंगर डालने के लिए गुजरता है जब चूहों को चित्रित नहीं किया जाता है। सिर के फ्रेम का एक पैर चूहे के कॉर्टेक्स की इमेजिंग के लिए सिर प्रत्यारोपण के खोखले हिस्से से गुजरता है। (जी) जागृत, सिर-स्थिर चूहों के लिए सिर प्रत्यारोपण के माध्यम से हेड फ्रेम। (एच) हेड इम्प्लांट के माध्यम से हेड फ्रेम अपने दो पैरों के साथ जागने के लिए दबाया जाता है, इमेजिंग सत्रों के दौरान जागने वाले, सिर-स्थिर चूहों की सिर-फिक्स्ड इमेजिंग (आई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: हेड इम्प्लांट प्लेसमेंट। (ए) जागृत, सिर-निश्चित इमेजिंग के लिए पतली खोपड़ी की तैयारी। (बी) सिर प्रत्यारोपण चूहे की खोपड़ी और रबर सिलिकॉन से ढके पतले खोपड़ी इमेजिंग क्षेत्र पर लगाया गया है। (सी) हेड इम्प्लांट पर सिर की टोपी लगाई गई। (D, E) लेपित धातु के तारों का उपयोग करके हेड इम्प्लांट पर सिर की टोपी लंगर डाली जाती है। (एफ) खोपड़ी के निर्धारण और सुरक्षा में आगे के समर्थन के लिए रबर-सिलिकॉन से ढका सिर की टोपी और आसपास का क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: C2 मूंछ उत्तेजनाओं की कार्यात्मक प्रतिक्रियाएं। (A) 1 s जागृत, सिर-निश्चित चूहे इमेजिंग के लिए 5 Hz C2 मूंछ उत्तेजना की एक प्रतिनिधि एकल परीक्षण कार्यात्मक प्रतिक्रिया, जिसमें प्रत्येक परीक्षण 3 s ± 2 s के अंतर-परीक्षण अंतराल के साथ 7 सेकंड तक चलता है। बेसलाइन से भिन्नात्मक परिवर्तन के ग्रेस्केल प्रतिनिधित्व की सीमा (−3.5 × 10−3 से 3.5 × 10−3)। (बी) एनेस्थेटाइज्ड (सोडियम पेंटोबार्बिटल) चूहे के 1 एस के लिए 5 हर्ट्ज सी 2 मूंछ उत्तेजना की एक प्रतिनिधि एकल परीक्षण कार्यात्मक प्रतिक्रिया। बेसलाइन से भिन्नात्मक परिवर्तन के ग्रेस्केल प्रतिनिधित्व की सीमा (−2.5 × 10−4 से 2.5 × 10−4)। जागृत, सिर-स्थिर चूहे की कार्यात्मक प्रतिक्रिया एनेस्थेटाइज्ड चूहे की तुलना में 140 गुना मजबूत होती है। प्रत्येक फ्रेम एक 0.5 एस फ्रेम है। छवियों को इस तरह से संरेखित किया गया है कि बाएं से दाएं रोस्ट्रल से पुच्छल तक और ऊपर से नीचे तक औसत से पार्श्व दिशा तक है जैसा कि तीरों द्वारा दिखाया गया है। गहरे क्षेत्र (नकारात्मक सीमा से नीचे) न्यूरोनल गतिविधि के मुख्य क्षेत्र हैं, और उज्ज्वल सफेद क्षेत्र (सकारात्मक सीमा से ऊपर) उत्तेजना के लिए ऑक्सीजन युक्त रक्त प्रतिक्रिया दिखाते हैं। स्केल बार = 1 मिमी संक्षिप्तीकरण: सी = पुच्छल; L = पार्श्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: सिर प्रत्यारोपण के लिए 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 2: हेड कैप के लिए 3 डी प्रिंटिंग फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
जागृत, सिर-निश्चित चूहे इमेजिंग का उपयोग आसानी और अनुकूलन के मामले में कई फायदे प्रदान करता है। कस्टम-डिज़ाइन किए गए स्लिंग चूहों को सांस लेने योग्य जाल सामग्री के माध्यम से लपेटने की अनुमति देते हैं, जिससेजानवरों को 10,11 की विस्तारित अवधि के लिए बंद, प्लास्टिक निरोधक कक्षों में संलग्न करने की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। चूहों में हल्के बेहोश करने की क्रिया (1.0-2.5 मिलीग्राम / किग्रा) के स्तर से नीचे एसीप्रोमाज़िन की बहुत कम खुराक का उपयोग करके चूहों को लगातार इमेजिंग सत्रों की लंबी अवधि के दौरान शांत और तनाव मुक्त रखा जाता है। चूहे को स्थिर रखने और इमेजिंग सत्रों के दौरान गति कलाकृतियों को खत्म करने के लिए, वेल्क्रो स्ट्रिप्स का उपयोग किया जाता है। वेल्क्रो स्ट्रिप्स को लंबे समय तक अनावश्यक शरीर कसना से बचने के लिए एक दूसरे से 3-6 मिमी पर रखा जाता है। चूहों को प्रशिक्षित किया जाता है और कम उम्र में स्लिंग के साथ आदत डाली जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे तैयारी और डेटा अधिग्रहण के दौरान अपने स्लिंग में शांत और आरामदायक रहें। प्रारंभिक परिणामों के आधार पर, लगभग 150-175 ग्राम वजन वाले युवा चूहों को पुराने चूहों की तुलना में प्रशिक्षित करना आसान और तेज होता है।
चूहे के सिर पर सिर प्रत्यारोपण का वजन केवल 0.174 ग्राम है, और हटाने योग्य सिर टोपी का वजन 1.483 ग्राम है। सिर प्रत्यारोपण एक गोलार्ध पर 0.5 सेमी से 1.5 सेमी के क्षेत्र को कवर करता है, जिससे न्यूरोइमेजिंग के लिए दूसरे गोलार्ध की पूर्ण पहुंच की अनुमति मिलती है। हेड कैप का आकार सर्जिकल साइट का पूर्ण कवरेज सुनिश्चित करता है। सिर प्रत्यारोपण और हेड कैप के वजन गतिशीलता और दैनिक गतिविधियों में बाधा नहीं डालते हैं, और चूहों को मानक पिंजरों में एक साथ रखा जा सकता है। इस सिर और शरीर निरोधक विधि का उपयोग करके, चूहों को अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अलग-अलग दिनों में हर बार 2-3 घंटे के लिए चित्रित किया जा सकता है। इस सेटअप का उपयोग करके कम से कम 3 महीने तक एक चूहे पर कई इमेजिंग सत्र किए जा सकते हैं। हेड इम्प्लांट और हेड कैप को 3 डी प्रिंट करने में कुल 25 मिनट लगते हैं। कृंतक के आकार के आधार पर भागों को आसानी से अनुकूलन योग्य हैं और चूहों में उपयोग करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। चूहों के भेदभाव की आवश्यकता वाले अध्ययनों के लिए, विभिन्न रंग और सामग्री आसान पहचान प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, टोपी के शीर्ष भाग को आसान पहचान के लिए प्रतीकों, संख्याओं या अक्षरों को जोड़ने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
सफल आरोपण और इमेजिंग के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण चूहों का प्रशिक्षण और आदत है। चूहों को यादृच्छिक रूप से संवेदी उत्तेजनाओं के साथ प्रस्तुत किया जाता है ताकि साहचर्य सीखने की क्षमता को कम किया जा सके, जो इमेजिंग परिणामों को प्रभावित कर सकता है। संक्रमण को रोकने के लिए सर्जरी और सभी सर्जिकल उपकरणों को बाँझ होने की आवश्यकता होती है, और स्थानीय एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग अनिवार्य है। इमेजिंग की शुरुआत में एसीप्रोमाज़िन का उपयोग इमेजिंग सत्रों के दौरान अनावश्यक आंदोलनों से बचने के लिए जानवरों को शांत और शांत रखने के लिए महत्वपूर्ण है। उचित निर्धारण के लिए चूहे की खोपड़ी को सूखने की आवश्यकता होती है, और जमा दंत सीमेंट की परत को सिर प्रत्यारोपण में फिट होने के लिए सिर की टोपी के लिए पर्याप्त पतला होना चाहिए।
वर्तमान अध्ययन के लिए, इमेजिंग क्षेत्र सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स पर केंद्रित था। पतला क्षेत्र लगभग 7.5 मिमी x 7.5 मिमी मापता है, जो उस क्षेत्र की सीमा है जिसे वर्तमान अध्ययन में चित्रित किया जा सकता है। हालांकि, यदि आवश्यक हो तो छवि क्षेत्र को 11 मिमी x 11 मिमी तक बढ़ाया जा सकता है। इस डिजाइन का एक और लाभ यह है कि यह कॉर्टेक्स की वक्रता के बावजूद पूरे पतले क्षेत्र की इमेजिंग की अनुमति देता है।
पहले रिपोर्ट किए गए सिर प्रत्यारोपण को चूहे के सिर पर सिर प्रत्यारोपण 13,14 को ठीक करने के लिए लगभग7-12 एंकरिंग स्क्रू की आवश्यकता होती है। यह पतली खोपड़ी की तैयारी के माध्यम से एक बड़े क्षेत्र की इमेजिंग को रोकता है। एक अन्य निर्धारण विधि के लिए सिर स्क्रू का उपयोग करके एक बड़े क्षेत्र पर राल सामग्री के निर्धारण की आवश्यकता होती है, जिससे खोपड़ी इमेजिंग14 के लिए दुर्गम हो जाती है। एमआरआई का उपयोग करके चूहों की जागृत इमेजिंग को बेलनाकार ट्यूबों में जानवरों के स्थिरीकरण की आवश्यकता होती है, जिससे इमेजिंग अनुभव जानवरों के लिए तनावपूर्ण हो जाते हैं 11,15. कुछ अन्य सेटअपों में, सिर प्रत्यारोपण सिर से बाहर निकलता है और मानक पिंजरों16,17 में उलझ सकता है। सिर प्रत्यारोपण और हेड कैप पुरानी इमेजिंग18,19 के लिए कांच की स्लाइड के निर्धारण और पतली खोपड़ी के चपटेपन के उपयोग को समाप्त करते हैं। सिर प्रत्यारोपण का आकार और हेड कैप पर वक्रता का उपयोग मानक पिंजरों में परिवर्तन करने की आवश्यकता को समाप्त करता है जैसा कि अन्य पुरानी प्रक्रियाओं18,19 में होता है। चूहों में सिर प्रत्यारोपण आसान है क्योंकि केवल एक अखरोट और स्क्रू कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग किया जाता है, जो चूहों में संभव नहीं है, क्योंकि चूहे बहुत मजबूत होते हैं और स्थिर रखना अधिक कठिन होताहै।
सिर प्रत्यारोपण की सीमा यह है कि, इसके छोटे आकार के बावजूद, इसे स्क्रू का उपयोग करके खोपड़ी में प्रत्यारोपण के लंगर की आवश्यकता होती है। सिर प्रत्यारोपण जानवर के सिर को स्थिर रखने के लिए आवश्यक है लेकिन पूरे चूहे के मस्तिष्क की इमेजिंग को सीमित करता है। हालांकि, इस हेड इम्प्लांट का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि इसका उपयोग विभिन्न न्यूरोइमेजिंग तौर-तरीकों जैसे आंतरिक सिग्नल ऑप्टिकल इमेजिंग, डॉप्लर ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी और लेजर स्पॉट इमेजिंग का उपयोग करके संवेदी उत्तेजना के लिए एक व्यापक क्षेत्र की छवि बनाने के लिए किया जा सकता है।
जागृत, सिर-स्थिर चूहों के आंतरिक संकेतों के आधार पर कॉर्टिकल कार्यात्मक प्रतिनिधित्व एक ही मूंछ उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड चूहों की तुलना में तीव्रता में मजबूत होते हैं। जागृत बंदरों21,22 में आंतरिक संकेत प्रतिक्रिया की ताकत में इसी तरह की वृद्धि की सूचना मिली है। वर्तमान काम अधिक चुनौतीपूर्ण वातावरण जैसे कि प्राकृतिक आवास23 के लिए हेड इम्प्लांट और हेड कैप डिज़ाइन में सुधार करने के लिए चल रहा है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम क्लारा जोन्स, जेम्स स्टिरवाल्ट, लिन्ह होआंग, यंग जून हा और अमीरसोहील ज़रेह को चूहों के प्रशिक्षण और स्लिंग की तैयारी के दौरान उनकी मदद के लिए स्वीकार करते हैं। फंडिंग राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच, अनुदान संख्या: एनएस 119852) और लेडुक फाउंडेशन (अनुदान संख्या: 15 सीवीडी02) द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
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