Summary
En detaljert ny prosedyre for funksjonell avbildning av våkne, hodefikserte rotter er beskrevet.
Abstract
Anestesi, som ofte brukes i preklinisk og grunnleggende vitenskapelig forskning, har en depressiv innflytelse på hjernens metabolske, nevronale og vaskulære funksjoner og kan påvirke nevrofysiologiske resultater negativt. Bruk av våkne dyr til forskningsstudier er fordelaktig, men utgjør den største utfordringen med å holde dyrene rolige og stasjonære for å minimere bevegelsesartefakter gjennom datainnsamling. Våken avbildning hos mindre gnagere (f.eks. mus) er svært vanlig, men forblir lite hos rotter da rotter er større, sterkere og har en større tendens til å motsette seg bevegelsesbegrensninger og hodefiksering over de lange varighetene som kreves for avbildning. En ny modell av neuroimaging av våkne, hodefikserte rotter ved hjelp av tilpassede håndsydde slynger, 3D-printede hodeimplantater, hodekapsler og en hoderamme er beskrevet. Resultatene som er oppnådd etter en enkelt prøve med enkeltwhisker-stimulering, antyder en økning i intensiteten av den fremkalte funksjonelle responsen. Oppkjøpet av den fremkalte funksjonelle responsen fra våkne, hodefaste rotter er raskere enn fra bedøvede rotter, pålitelig, reproduserbar og kan brukes til gjentatte langsgående studier.
Introduction
De fleste av de grunnleggende, prekliniske og translasjonelle vitenskapelige neuroimaging-undersøkelsene er anskaffet fra bedøvede dyr 1,2. Anestetika letter eksperimentering, men påvirker kontinuerlig hjernens og kroppens metabolisme, blodtrykk og hjertefrekvens3. Type bedøvelse og varighet og administrasjonsvei legger til konfunderende variabler til datatolkning som kan bidra til reproduserbarhet og translasjonsfeil4. En stor flaskehals ved våkne, hodefikserte nevroavbildningsstudier hos rotter er kravet om å holde rotta stasjonær og rolig gjennom forberedelses- og datainnsamlingsprosessene. Små bevegelser produserer uberettigede bevegelsesartefakter, noe som kan påvirke dataanalyse og tolkninger negativt.
En ny modell av neuroimaging fra våkne, hodefikserte rotter ved hjelp av tilpassede slynger, tredimensjonale (3D) -trykte hodeimplantater, hodekapsler og en hoderamme er utviklet som gir flere fordeler for enkel eksperimentering. 3D-hodeimplantatet er lett og dekker en liten del av skallen som trengs for transfixing. De 3D-printede hodeimplantatene og capsene er designet ved hjelp av programvare for dataassistert konstruksjon (CAD). Protokollene for whisker-stimulering, datainnsamling, dataanalyse og resultater fra bedøvede rotter er beskrevet i detalj i tidligere arbeid 5,6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer var i samsvar med National Institute of Health retningslinjer og godkjent av University of California, Irvine Animal Care and Use Committee. Syv hanner og en hunnrotte (Sprague-Dawley, vekt: 185-350 g) ble brukt i denne studien. Etter at studien var fullført, ble rottene ofret ved hjelp av overdosering av karbondioksid.
1. Design av ulike komponenter
- Design av hodeimplantatet:
- Lag hodeimplantatet ved hjelp av CAD-programvare (figur 1C) og design det for å avbilde området bakre for bregma og ved siden av midtlinjen sentrert på den somatosensoriske cortex. Sørg for at hodeimplantatet dekker et område på 0,9 mm til 1,9 mm på hodeskallen vekk fra bildeområdet.
- Bruk bare tre skruer for å forankre hodeimplantatet på rottens skalle. Design alle skruehullene slik at de forblir på motsatt side av midtlinjen i den kontralaterale halvkule av den avbildede halvkule.
- Plasser en stang, uthult fra innsiden, i den øvre delen av hodeimplantatet for å la ledningene feste hodehetten til hodeimplantatet som vist i figur 1D.
- Design av hodehetten:
- Sørg for at hodehetten dekker bildeområdet helt og beskytter det mot enhver form for traume som vist i figur 1A, B. Legg en krumning på hodehetten slik at den justerer seg etter formen på hodet uten å forårsake vanskeligheter med dyrets daglige aktiviteter i standardberikede bur.
- Klipp innsiden av hodehetten i en bredere rektangulær form slik at den øvre delen av hodeimplantatet får plass i den, som vist i figur 1E. Vinkelrett på dette rektangelet, kutt to andre rektangulære regioner for å forankre hodehetten til hodeimplantatet.
- Før en ledning gjennom den øvre hule stangen på hodeimplantatet for fiksering av hodehetten på rottehodet som vist i figur 1E-G. Pass den andre ledningen på samme måte.
MERK: Disse ledningene kan enkelt fjernes ved hjelp av tang eller tang. 3D-utskriftsfilene leveres (filformat: STL) som tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2.
- Design av hoderammen:
- Design hoderammen på en slik måte at en kuttet del kan bevege seg gjennom den øvre stangen på hodeimplantatet og festes ved hjelp av en klemme.
- Vinkle den andre kuttede delen for å gi ekstra styrke for å holde rottehodet fast for å gjøre den kontralaterale siden helt tilgjengelig for avbildning. For formålet med denne studien, kutt stålplaten med tinnsnips for å produsere hoderammen (figur 1H, I).
MERK: Denne delen kan også 3D-skrives ut.
2. Innledende rottetrening
- La rotter akklimatisere seg til vivariummiljøet i burene sine i 2-3 dager.
- Begynn å håndtere rotta i et stille rom. Åpne buret og la eksperimentøren legge hånden inne i buret nær rotta i 15-20 minutter for å la rotta bli tilvennet.
- Når rotta viser ro ved ikke å bli skremt eller løpe vekk fra eksperimentørens hender, må du forsiktig plukke rotta opp for håndtering. Håndter rotta i 30-45 min hver dag før slyngetrening.
3. Slyngetrening
- Tren rottene i minst 2-3 dager i stroppene før kirurgisk implantasjon av hodeimplantatet og hodehetten.
- Ordne slyngeoppsettet som vist i figur 2A. Rengjør slyngeoppsettet med etanolservietter.
MERK: Alle slyngene er håndsydd og laget av et nettingmateriale enten på bunnen eller på begge sider som vist i figur 2A, B. - For slyngetrening, bedøv rottene med 4% isofluran for induksjon og 1% for vedlikehold til det ikke er noen bakpoteklemmerefleks.
- Under isoflurananestesi, plasser rottene på en fleksibel plastplate som måler 20 cm x 8 cm (lengde x bredde), hvor 10 cm x 8 cm av plastplaten er helt dekket med den mykere delen av borrelåsen.
MERK: Bedøvelse av rotter for slyngetrening er et valgfritt trinn, primært brukt til å redusere stress og angst. - De første 2 dagene av treningen, legg rotta tett inn i en babysokk (størrelse 0-3 måneder) med hodet ut gjennom et lite hull skåret på enden av sokken.
- Pakk et lite stykke absorberende pute rundt den nedre kroppsdelen for å holde rotta tørr og samle ekskrementer.
- Pakk rotta inn i en pustende bomullsklut (størrelse: 25 cm x 25 cm). Legg rotta på en plastplate som har borrelåsstrimler limt til den.
- Fest rotta ytterligere til plastplaten med 0,5 cm brede borrelåsstrimler i en avstand på 3-6 mm fra hverandre.
- Fest rotta i slyngen. Fjern gassbedøvelsen. La rotta komme seg fra gassbedøvelse i slyngen.
- Når rotta begynner å vispe, tilby noen dråper 10% sukroseløsning som en belønning hver 10-15 min.
- Presenter tilfeldig rotta med sensoriske stimuli som skal brukes under avbildning (her whisker stimulering, hver 15-25 min) for å gjøre den vant til sensoriske stimuli. Stimuler værhårene manuelt med tilfeldige intervaller.
- Tren rotta i slyngen i 1 time på dag 1, 2 timer på dag 2 og 3 timer på dag 3 som vist i figur 2C.
4. Prekirurgisk forberedelse
- Skriv ut hodeimplantatet og hodehetten med 3D-skriveren (figur 1).
- Steriliser alle kirurgiske instrumenter og hodestykker (implantater og caps) ved å senke utstyret i Metricide28 bakteriedrepende middel i 10 timer. Skyll verktøyet grundig med sterilt vann like før operasjonen.
- Utsett rotta for 4 % isofluran og oppretthold deretter 1%-2 % isofluran til det ikke er noen refleks av bakpoten. Denne operasjonen kan utføres under mange typer anestesi, som isofluran, natriumpentobarbital og ketamin-xylazin.
- Injiser atropin (0,05 mg / kg) intramuskulært for å redusere slimete sekreter for å hjelpe til med å puste.
- Barber hodet på rotta 5 mm sentrert rundt midtlinjen ved hjelp av en hårtrimmer fra mellom øynene til baksiden av ørene.
- Overvåk delvis oksygenmetning og hjertefrekvens gjennom et pulsoksymeter og hjertefrekvensmåler sonde festet til rottens bakben.
- Tørk rottens hode og området rundt tre ganger med vekslende runder med betadin og 70% alkoholservietter.
- Fest rotta i et stereotaksisk system.
- Sett inn en vaselinsmurt rektal sonde for å måle rottens kroppstemperatur og opprettholde den gjennom varmeteppets tilbakemeldingssystem for å unngå hypotermi etter bedøvelse.
- Administrer lokalbedøvende lidokainhydroklorid i en konsentrasjon på 20 mg/ml, 0,07 mg/kg +/-0,2 kroppsvekt subkutant på operasjonsstedet.
- Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørking.
- Administrer 2% lokalbedøvelse subkutant over operasjonsstedet.
- Injiser 3 ml laktert ringeroppløsning ved romtemperatur subkutant for å forhindre dehydrering og gi næring under operasjonen.
5. Kirurgi
- Fjern den delen av huden over operasjonsstedet (4 mm diameter sentrert rundt midtlinjen og midten av hodet) ved hjelp av skarp kirurgisk saks. Dissekere og fjerne en del av huden (~ 2 mm diameter, over venstre somatosensorisk cortex) mellom øret og øyet på den temporale delen av hodet.
- Fjern, ved hjelp av en skalpell, den underliggende huden (pericranium) vev for å avsløre skallen. Rengjør skallen med sterilisert bomullsgassbind.
- Trekk inn / resekter temporal muskel for å eksponere ønsket størrelse for avbildningsområdet [7,5 mm x 7,5 mm for denne studien].
- Utsett skallen på den kontralaterale halvkule for hodeimplantatet. Plasser hodeimplantatet på skallen for å fastslå plasseringen av forankringsskruer for implantatet som vist i figur 2D-F.
- Merk skallen for boring av skruene med India Ink med borkrone 1. Bor burrhullene for skruene ved hjelp av tannborkrone 3. Skru hodeimplantatet på plass.
- Tørk skallen med sterilt gasbind. Påfør et tynt lag av vevlim rundt og under hodeimplantatet for å lime det til skallen. Påfør et lag med dental sement for ytterligere å støtte hodeimplantatet på plass og la sementen tørke i 2-3 min.
MERK: Bruk av vevlim i tillegg til dental sement sikrer et sterkt grep8. - Ved hjelp av tannborkrone 3, tynn et 7,5 mm x 7,5 mm område på venstre side av skallen like bakre til bregma og lateralt til midtlinjen. Tynn skallen til ~50 μm som vist i figur 3A.
- Påfør aktuell antibiotikasalve over operasjonsstedet og dekk den deretter med et tynt lag silikongummi for å beskytte den tynne skallen som vist i figur 3B. Dekk operasjonsstedet med hodehetten som vist i figur 3C. Fest den på plass med de to små ledningsstykkene som går gjennom både hodeimplantatet og hodehetten som vist i figur 3D, E. Påfør silikongummi for å dekke hodehetten og hodeskallen for å stabilisere hodehetten ytterligere på rottens hode som vist i figur 3F.
MERK: Silisiumgummi gir ekstra beskyttelse mot tynnet skalle. - Injiser rotta subkutant med flunixinmeglumin (2,5 mg/kg) for smerte- og betennelsesbehandling. For å forhindre infeksjon, injiser Enrositt antibiotika enrofloksacin (22,7 mg/ml, 10 mg/kg +/-0,01), intraperitonealt.
- Flytt rotta til restitusjonskammeret for å opprettholde kroppstemperaturen med et varmeteppe og en varmelampe. Overvåk rotta kontinuerlig til den gjenvinner bevisstheten og kan opprettholde sternal recumbency.
- Sett rotta tilbake i sitt separate bur når den har kommet seg helt.
- I de neste 3 dagene, administrer flunixin og buprenorfin for å lindre betennelse og smerte og enrositt for å forhindre infeksjon to ganger daglig.
6. Våken bildebehandling
- Bedøv rotta med 4% isofluran for induksjon og 1% for vedlikehold når det ikke er noen bakpoteklemmerefleks. Injiser acepromazin (0,3-0,5 mg/kg) subkutant.
MERK: Denne konsentrasjonen av acepromazin er under milde sedasjonsnivåer og bidrar bare til å holde rottene rolige gjennom hele bildeprosessen. - Bruk tilpassede strimler med borrelås, fest rotta på plastplaten som brukes under treningsprosedyrene. Pakk den nedre kroppsdelen med en absorpsjonspute og legg rotta tett i slyngen.
- Fjern silisiumgummi. Fjern hodehetten ved å fjerne fikseringsledningene. Fest hoderammen i hodeimplantatet som vist i figur 2G.
- Lås hoderammen i klemmer som vist i figur 2H, I.
- Fjern gassbedøvelse. Skyll bildeområdet med saltvann 3x og rengjør med vått gasbind. Tørk bildeområdet og lag en brønn, ved hjelp av petroleumjell, rundt bildeområdet. Fyll brønnen med sterilisert saltvann og dekk med et glassglass (figur 2E).
- Se innsamlingsprosedyrene for optisk avbildning av indre signal, whisker-stimuleringsprotokollen og dataanalyse og presentasjon, som har blitt diskutert i detalj tidligere 6,7.
- Gjennom hele forsøket, overvåke rotter for tegn på agitasjon og rastløshet, som kan reduseres ytterligere ved å dekke øynene til rotter med en myk klut eller gasbind (valgfritt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative optiske bildesignalene fra et enkelt forsøk på en bedøvet rotte og den summerte responsen (av 40 innsamlede forsøk) av en våken rotte er vist (figur 4). Signalintensiteten for enkeltvisgerstimulering av en våken rotte kan visualiseres ved en høyere terskel enn for den bedøvede rotten, og viser et sterkere signal fra det våkne dyret. C2-værhårene til rotter stimuleres ved 5 Hz i 1 s, og den funksjonelle responsen vises som en brøkdel av endring sammenlignet med grunnlinjen. De mørkere områdene (under den negative terskelen) er hovedområdene av nevronaktivitet, og de lyse hvite områdene (over den positive terskelen) viser den oksygenerte blodresponsen på stimulering9. Bildene er justert slik at fra venstre til høyre er fra rostral til caudal (C) og fra topp til bunn er mediale til laterale (L) retning, som vist av pilene.
Figur 1: Hodehette, hodeimplantat og hoderamme. (A) Hodehetten (øverste visning): siden av toppvisningen viser krumningen for å justere langs krumningen av hodet for å beskytte hodet; De to hule rektangulære delene er for metalltrådene å passere gjennom hodehetten. (B) Hodehette (nederste visning) viser det bredere rektangulære kuttet for å passe i den øverste linjen på hodeimplantatet og de to vinkelrette kuttene for ledningene for å bevege seg gjennom implantatet og hodehetten for å holde dem på plass. (C) Hodeimplantat med de tre kuttehullene for forankringsskruene. Posisjonene til forankringsskruene på hodeimplantatet kan justeres i henhold til rottehodet. (D) Hodehette og hodeimplantat (sett fra siden); Sidevisningen av hodeimplantatet viser den rektangulære stangen uthult fra innsiden for å la ledningen passere gjennom for å forankre hodehetten til hodeimplantatet. (VG Nett) Utsikt over hodeimplantatet forankret i hodehetten gjennom ett ledningsstykke; Bunnvisning, sidevisning og toppvisning for å vise hvordan hodeimplantatet er montert inne i hodehetten. (H) Hoderamme, (I) hodeimplantat forankret i hoderammen. Avstanden mellom to linjer på skalaen (som vist ved det blå rektangelet) er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Stropper, hodeimplantat og fiksering av hoderammen for våken, hodefiksert avbildning. (A,B) Tilpasset slynge med nettingmateriale for enten bare bunn eller begge sider; (C) rotte plassert på plastplaten, festet med borrelåsstrimler, under slyngetrening; (D-F) topp- og sidevisning av hodeimplantatet på en rotteskalle over den kontralaterale halvkule. Stiplede linjer viser bildeområdet. Topp- og sidevisningene viser tydelig de tre hullene for å feste hodeimplantatet til skallen med forankringsskruen. (E) Sidevisningen viser den hule stangen som ledningen passerer gjennom for å forankre hodehetten til hodeimplantatet når rottene ikke er avbildet. Ett ben av hoderammen passerte gjennom den hule delen av hodeimplantatet for avbildning av rottebarken. (G) Hoderamme gjennom hodeimplantatet for våkne, hodefikserte rotter. (H) Hoderammen gjennom hodeimplantatet med de to bena klemt fast for våken, hodefiksert avbildning (I) av våkne, hodefikserte rotter under avbildningsøktene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av hodeimplantat. (A) Den tynne hodeskallen forberedelse for våken, hode-fast bildebehandling. (B) Hodeimplantat festet på rotteskallen og det tynne hodeskallebildeområdet dekket med gummisilikonet. (C) Hodehette plassert på hodeimplantatet. (D,E) Hodehette forankret til hodeimplantatet ved hjelp av belagte metalltråder. (F) Hodehetten og det omkringliggende området dekket med gummi-silikon for ytterligere støtte i fiksering og beskyttelse av skallen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonelle responser av C2 whisker-stimuleringer. (A) En representativ funksjonell respons i enkeltforsøk av en 5 Hz C2 whisker-stimulering for 1 s våken, hodefiksert rottebildebehandling, med hver prøve som varer i 7 s med et intervall på 3 s ± 2 s. Terskelen for gråtonerepresentasjon av brøkendring fra baseline (−3,5 × 10−3 til 3,5 × 10−3). (B) En representativ funksjonell respons i enkeltforsøk av en 5 Hz C2 værhårstimulering i 1 s av en bedøvet (natriumpentobarbital) rotte. Terskelen for gråtonerepresentasjon av brøkendring fra baseline (−2,5 × 10−4 til 2,5 × 10−4). Den funksjonelle responsen til den våkne, hodefaste rotten er 140 ganger sterkere enn den bedøvede rotten. Hver ramme er en 0,5 s ramme. Bildene er justert slik at fra venstre til høyre er fra rostral til caudal og fra topp til bunn er fra mediale til laterale retning som vist av pilene. De mørkere områdene (under den negative terskelen) er hovedområdene av nevronaktivitet, og de lyse hvite områdene (over den positive terskelen) viser den oksygenerte blodresponsen på stimulering. Skala bar = 1 mm. Forkortelser: C = caudal; L = lateral. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: 3D-utskriftsfil for hodeimplantatet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: 3D-utskriftsfil for hodehetten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av våken, hodefast rotteavbildning gir mange fordeler når det gjelder enkelhet og tilpasning. De spesialdesignede slyngene gjør at rottene kan pakkes inn gjennom pustende nettingmateriale, noe som eliminerer behovet for å omslutte dyr i lukkede plastkamre i lengre perioder10,11. Rotter holdes rolige og stressfrie gjennom lange varigheter av påfølgende bildebehandlingsøkter ved bruk av en svært lav dose acepromazin under nivåene av mild sedasjon hos rotter (1,0-2,5 mg/kg)12. For å holde rotta stødig og ytterligere eliminere bevegelsesartefakter under bildebehandlingsøktene, brukes borrelåsstrimler. Borrelåsstrimlene er plassert 3-6 mm fra hverandre for å unngå unødvendig innsnevring av kroppen i lange timer. Rottene trenes og tilvennes med slynger i ung alder for å sikre at de forblir rolige og komfortable med å hvile i slyngene under forberedelse og datainnsamling. Basert på de foreløpige resultatene er unge rotter som veier ca. 150-175 g lettere og raskere å trene enn eldre rotter.
Hodeimplantatet på rottehodet veier bare 0,174 g, og den avtagbare hodehetten veier 1,483 g. Hodeimplantatet dekker et område på 0,5 cm til 1,5 cm på den ene halvkule, noe som gir fullstendig tilgjengelighet til den andre halvkule for bildediagnostikk. Størrelsen på hodehetten sikrer full dekning av operasjonsstedet. Vekten av hodeimplantatet og hodehetten ser ikke ut til å hindre mobiliteten og de daglige aktivitetene, og rottene kan plasseres sammen i standardbur. Ved hjelp av denne hode- og kroppsbegrensningsmetoden kan rottene avbildes i 2-3 timer hver gang på forskjellige dager for longitudinelle studier. Flere bildebehandlingsøkter kan utføres på en enkelt rotte i minst 3 måneder ved hjelp av dette oppsettet. Det tar totalt 25 minutter å 3D-printe hodeimplantatet og hodehetten. Delene kan enkelt tilpasses avhengig av størrelsen på gnageren og kan også tilpasses til bruk i mus. For studier som krever differensiering av rotter, kan forskjellige farger og materialer gi enkel identifisering. I tillegg kan den øverste delen av hetten tilpasses for å legge til symboler, tall eller bokstaver for enkel identifisering.
Det er flere viktige skritt for vellykket implantasjon og avbildning, hvorav det viktigste er trening og habituation av rotter. Rottene presenteres tilfeldig med sensoriske stimuli for å minimere potensialet for assosiativ læring, noe som kan påvirke bilderesultatene. Operasjonen og alle kirurgiske instrumenter må være sterile for å forhindre infeksjon, og bruk av lokale antibiotika er avgjørende. Bruk av acepromazin i starten av avbildningen er viktig for å holde dyrene rolige og stille for å unngå unødvendige bevegelser under bildebehandlingen. Hodeskallen til rotta må være tørr for riktig fiksering, og laget av avsatt tannsement må være tynt nok til at hodehetten passer i hodeimplantatet.
For den nåværende studien var bildeområdet sentrert på den somatosensoriske cortex. Det tynne området måler omtrent 7,5 mm x 7,5 mm, som er omfanget av området som kan avbildes i den aktuelle studien. Det avbildede området kan imidlertid økes til 11 mm x 11 mm om nødvendig. En annen fordel med dette designet er at det tillater avbildning av hele det tynnede området til tross for cortexens krumning.
Tidligere rapporterte hodeimplantater krever nesten 7-12 forankringsskruer for å feste hodeimplantatet på rottehodet13,14. Dette utelukker avbildning av et større område gjennom tynnet skalleforberedelse. En annen fikseringsmetode krever fiksering av et harpiksmateriale over et stort område ved hjelp av hodeskruer, noe som gjør skallen utilgjengelig for avbildning14. Våken avbildning av rotter ved hjelp av MR krever immobilisering av dyr i sylindriske rør, noe som gjør bildeopplevelsene stressende for dyrene11,15. I noen andre oppsett stikker hodeimplantatet ut av hodet og kan vikle seg inn i standardbur16,17. Hodeimplantatet og hodehetten eliminerer bruken av fiksering av glassglass og utflating av den tynne skallen for kronisk avbildning18,19. Størrelsen på hodeimplantatet og bruken av krumning på hodehetten eliminerer behovet for å gjøre endringer i standardburene som ved andre kroniske prosedyrer18,19. Hodeimplantatene hos mus er lettere fordi bare en enkelt mutter og skruekonfigurasjon brukes, noe som ikke er mulig hos rotter, da rotter er mye sterkere og vanskeligere å holde stabile20.
Begrensningen av hodeimplantatet er at det, til tross for sin lille størrelse, krever forankring av implantatet til skallen ved hjelp av skruer. Hodeimplantatet er nødvendig for å holde dyrets hode stødig, men begrenser avbildning av hele rottehjernen. En fordel ved å bruke dette hodeimplantatet er imidlertid at det kan brukes til å avbilde et bredere område for fremkalt sensorisk stimulering ved hjelp av forskjellige neuroimaging modaliteter som intrinsic signal optisk bildebehandling, doppler optisk koherens tomografi og laser speckle imaging.
De kortikale funksjonelle representasjonene basert på inneboende signaler fra våkne, hodefikserte rotter har en tendens til å være sterkere i intensitet enn hos bedøvede rotter som bruker samme whisker-stimuleringsprotokoll. En tilsvarende økning i styrken av fremkalt indre signalrespons er rapportert hos våkne aper21,22. Nåværende arbeid pågår for å forbedre hodeimplantatet og hodehettedesignet for mer utfordrende miljøer som det naturalistiske habitatet23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Clara Jones, James Stirwalt, Linh Hoang, Young Joon Ha og Amirsoheil Zareh for deres hjelp under trening av rottene og forberedelse av slyngene. Finansiering ble gitt av National Institutes of Health (NIH, Grant Number: NS119852) og Leducq Foundation (Grant Number: 15CVD02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Sprague Dawley | |
| Isoflurane | Pivetal | 21295098 | General anesthetic |
| Lidocaine HCl 2% injection | Phoenix | L-2000-04 | Local anesthetic |
| Atropine sulfate injection | Vedco | 5098907512 | Help in respiration |
| Lactated Ringer's injection solution | Vedco | 50989088317 | |
| Flunixin injection | Vedco | 6064408670 | Pain management |
| Enrosite injection (Enrofloxacin 2.27%) | VetOne | 501084 | Avoid infection |
| PromAce injection (Acepromazine maleate) | Beohringer Ingelheim | 136059 | |
| Animax ointment | Dechra Veterinary Products | 122-75 | active ingredients of nystatin 1000units per gram, neomycin sulfate 2.5mg per gram, thiostrepton 2500 units per gram, and triamcinolone acetonide 1mg per gram |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 211-38 | |
| Povidone-iodine PVP prep pads | Medline | MDS093917 | Betadine generic |
| Isopropyl alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #3 bur |
| Screws, 00-90 x 1/8 flat head stainless steel | J.I. Morris | F0090CE125 | Anchor screws |
| Stereotaxic system | Kopf Instruments | 1430 | |
| Homeothermic heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7220-F | |
| Pulse oximeter & heart rate monitor | Kent Scientific | MouseStat Jr. | |
| Petrolatum | Fisher Scientific | P66-1LB | Vaseline generic |
| Wire, bare copper | Fisher Scientific | 15-545-2C | 20 gauge |
| Teets Cold Cure powder | Pearson Dental | C73-0054 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Teets Cold Cure liquid | Pearson Dental | C73-0078 | active ingredient: Methyl Methacrylate |
| Silicone mold rubber | Smooth-On | Body Double Fast | silicon polymer |
| Metricide 28 (Germicide) | Metrex | Oct-05 | |
| India ink, black | Pelikan | 301051 | |
| Dental drill | NSK Dental | Ultimate XL-F | |
| 3D printer | Prusa Research | i3 MK3S+ | |
| Sew on fasteners | Velcro | 90030 | |
| Pet screening utility fabric | Joann | 10173334 | Netting material |
| Bur (drill bit), standard operatory carbide | SS White Burs | 14829 | #1 bur |
References
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Lythgoe, M. F., Sibson, N. R., Harris, N. G.
- Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: A telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Veterinary Research. 10, 310 (2014).
- Uhlig, C., Krause, H., Koch, T., Gama de Abreu, M., Spieth, P. M. Anesthesia and monitoring in small laboratory mammals used in anesthesiology, respiratory and critical care research: A systematic review on the current reporting in top-10 impact factor ranked journals. PLoS One. 10 (8), 0134205 (2015).
- Chen-Bee, C. H., et al. Visualizing and quantifying evoked cortical activity assessed with intrinsic signal imaging. Journal of Neuroscience Methods. 97 (2), 157-173 (2000).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Xiong, Y., Frostig, R. D. The triphasic intrinsic signal: Implications for functional imaging. The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4572-4586 (2007).
- Chen-Bee, C. H., Agoncillo, T., Lay, C. C., Frostig, R. D. Intrinsic signal optical imaging of brain function using short stimulus delivery intervals. Journal of Neuroscience Methods. 187 (2), 171-182 (2010).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).
- Frostig, R. D., Lieke, E. E., Ts'o, D. Y., Grinvald, A. Cortical functional architecture and local coupling between neuronal activity and the microcirculation revealed by in vivo high-resolution optical imaging of intrinsic signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (16), 6082-6086 (1990).
- Chang, P. C., et al. Novel method for functional brain imaging in awake minimally restrained rats. Journal of Neurophysiology. 116 (1), 61-80 (2016).
- Stenroos, P., et al. Awake rat brain functional magnetic resonance imaging using standard radio frequency coils and a 3D printed restraint kit. Frontiers in Neuroscience. 12, 548 (2018).
- Vogler, G. A. Chapter 19 - Anesthesia and Analgesia (Second Edition). The Laboratory Rat. Suckow, M. A., Weisbroth, S. H., Franklin, C. L. , Academic Press. Cambridge, MA. 627-664 (2006).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--Procedures and pitfalls. Somatosensory and Mot Research. 27 (4), 131-148 (2010).
- Roh, M., Lee, K., Jang, I. S., Suk, K., Lee, M. G. Acrylic resin molding based head fixation technique in rodents. Journal of Visualized Experiments. (107), e53064 (2016).
- Ferris, C. F. Applications in awake animal magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 16, 854377 (2022).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Desjardins, M., et al. Awake mouse imaging: From two-photon microscopy to blood oxygen level-dependent functional magnetic resonance imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9, 5499 (2019).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
- Cao, R., et al. Functional and oxygen-metabolic photoacoustic microscopy of the awake mouse brain. Neuroimage. 150, 77-87 (2017).
- Grinvald, A., Frostig, R. D., Siegel, R. M., Bartfeld, E. High-resolution optical imaging of functional brain architecture in the awake monkey. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (24), 11559-11563 (1991).
- Roe, A. W. Long-term optical imaging of intrinsic signals in anesthetized and awake monkeys. Applied Optics. 46 (10), 1872-1880 (2007).
- Polley, D., Kvašňák, E., Frostig, R. Naturalistic experience transforms sensory maps in the adult cortex of caged animals. Nature. 429 (6987), 67-71 (2004).
