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Environment

मेटाबोलाइट उत्पादन पर डीआई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स का संग्रह

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

रूट एक्स्यूडेट्स का स्राव आमतौर पर तनाव की स्थिति में पौधों के लिए एक बाहरी विषहरण रणनीति है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण के माध्यम से अल्फाल्फा पर ज़ेनोबायोटिक्स के प्रभाव का आकलन कैसे किया जाए।

Abstract

रूट एक्स्यूडेट्स पौधे की जड़ों और आसपास के वातावरण के बीच सूचना संचार और ऊर्जा हस्तांतरण का मुख्य माध्यम हैं। रूट एक्स्यूडेट्स के स्राव में परिवर्तन आमतौर पर तनाव की स्थिति में पौधों के लिए एक बाहरी विषहरण रणनीति है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मेटाबोलाइट उत्पादन पर डाई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट (डीईएचपी) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करना है। सबसे पहले, अल्फाल्फा के पौधों को हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग में डीईएचपी तनाव के तहत उगाया जाता है। दूसरा, पौधों को सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें 6 घंटे के लिए 50 मिलीलीटर स्टरलाइज्ड अल्ट्राप्योर पानी होता है ताकि रूट एक्स्यूडेट्स एकत्र किए जा सकें। समाधान को तब वैक्यूम फ्रीज ड्रायर में फ्रीज-सुखाया जाता है। जमे हुए नमूनों को बीआईएस (ट्राइमिथाइलसिलिल)) ट्राइफ्लोरोसिटामाइड (बीएसटीएफए) अभिकर्मक के साथ निकाला और व्युत्पन्न किया जाता है। इसके बाद, व्युत्पन्न अर्क को गैस क्रोमैटोग्राफ सिस्टम का उपयोग करके मापा जाता है जो टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी-टीओएफ-एमएस) के साथ युग्मित होता है। अधिग्रहित मेटाबोलाइट डेटा का विश्लेषण जैव सूचना विज्ञान विधियों के आधार पर किया जाता है। रूट एक्स्यूडेट्स के मद्देनजर अल्फाल्फा पर डीईएचपी के प्रभाव को प्रकट करने के लिए अंतर मेटाबोलाइट्स और महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित चयापचय मार्गों का गहराई से पता लगाया जाना चाहिए।

Introduction

डीआई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट (डीईएचपी) एक सिंथेटिक रासायनिक यौगिक है जो विभिन्न प्लास्टिक और पॉलिमर में प्लास्टिसाइज़र के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है ताकि उनकी प्लास्टिसिटी और ताकत में सुधार हो सके। पिछले कुछ वर्षों में, अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने सुझाव दिया है कि डीईएचपी एक अंतःस्रावी अवरोधक है और मनुष्यों औरअन्य जानवरों के श्वसन, तंत्रिका और प्रजनन प्रणाली पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है। इसके स्वास्थ्य जोखिम को ध्यान में रखते हुए, संयुक्त राज्य अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी, यूरोपीय संघ और चीन के पर्यावरण निगरानी केंद्र ने डीईएचपी को प्राथमिकता प्रदूषकों की सूची में वर्गीकृत किया है। प्लास्टिक मल्चिंग और जैविक उर्वरकों के अनुप्रयोग, अपशिष्ट जल के साथ सिंचाई और कीचड़फार्म अनुप्रयोग के कारण मिट्टी को पर्यावरण में डीईएचपी का एक महत्वपूर्ण सिंक माना जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, डीईएचपी को खेत की मिट्टी में सर्वव्यापी रूप से पाया गया है, जिसकीसामग्री चीन के कुछ क्षेत्रों में सूखे मिट्टी के प्रति किलोग्राम मिलीग्राम तक भी पहुंच जाती है। डीईएचपी मुख्य रूप से जड़ों के माध्यम से पौधों में प्रवेश कर सकता है औरमिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में विभिन्न ट्रॉफिक स्तरों पर जैवआवर्धन से गुजर सकता है। इसलिए, हाल के दशकों में पौधों में डीईएचपी-प्रेरित तनाव के बारे में महत्वपूर्ण चिंता जताई गई है।

पौधे आमतौर पर डीईएचपी एक्सपोजर के प्रति संवेदनशील होते हैं। डीईएचपी तनाव को बीज अंकुरण और सामान्य चयापचय पर प्रतिकूल प्रभाव डालने के लिए देखा गया है, जिससे पौधे की वृद्धि और विकासमें बाधा आती है। उदाहरण के लिए, डीईएचपी मेसोफिल कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित कर सकता है, क्लोरोफिल और ऑस्मोलाइट की सामग्री को कम कर सकता है, और एंटीऑक्सिडेटिव एंजाइम गतिविधियों को बढ़ा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततःखाद्य पौधों की उपज और गुणवत्ता में गिरावट आती है। हालांकि, डीईएचपी तनाव के लिए पौधों की प्रतिक्रिया पर पिछले अधिकांश अध्ययनों ने ऑक्सीडेटिव तनाव और शारीरिक और जैव रासायनिक विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित किया है। पौधे के चयापचय से जुड़े संबंधित तंत्र कम अध्ययन किए जाते हैं। रूट एक्स्यूडेट्स एक सामान्य शब्द है जो यौगिकों का वर्णन करता है जो पौधे की जड़ें स्रावित होती हैं और पर्यावरण में छोड़ती हैं। उन्हें पौधों और राइजोस्फीयर मिट्टी के बीच बातचीत मीडिया के रूप में माना जाता है, जो पौधे की वृद्धिऔर विकास का समर्थन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि रूट एक्स्यूडेट्स सभी प्रकाश संश्लेषक कार्बन13 का लगभग 30% -40% है। प्रदूषित वातावरण में, रूट एक्स्यूडेट्स चयापचय या बाहरी बहिष्करण के माध्यम से प्रदूषकों के तनाव के लिए पौधों की सहनशीलता में सुधार करने में शामिलहैं। नतीजतन, प्रदूषण तनाव के लिए पौधे की जड़ की प्रतिक्रिया की गहरी समझ सेल जैव रसायन और जैविक घटनासे जुड़े अंतर्निहित तंत्र को प्रकट करने में मदद कर सकती है।

मेटाबोलॉमिक्स तकनीक कोशिकाओं 16,17, ऊतकों18, और यहां तक कि शर्करा, कार्बनिक एसिड, अमीनो एसिड और लिपिड सहित जीवों के एक्सयूडेट्स19 के भीतर एक साथ बड़ी संख्या में छोटे अणु मेटाबोलाइट्स को मापने के लिए एक कुशल रणनीति प्रदान करती है। पारंपरिक या शास्त्रीय रासायनिक विश्लेषण विधियों की तुलना में, मेटाबोलॉमिक्स दृष्टिकोण मेटाबोलाइट्स की संख्या को बहुत बढ़ाता है जिन्हें20 का पता लगाया जा सकता है, जो उच्च-थ्रूपुट तरीके से मेटाबोलाइट्स की पहचान करने और प्रमुख चयापचय मार्गों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। मेटाबोलॉमिक्स का व्यापक रूप से तनाव वातावरण में जैविक प्रतिक्रिया के अनुसंधान क्षेत्र में उपयोग किया गया है, जैसे कि भारी धातु21, उभरते प्रदूषक22, और नैनोकणों19। पौधों पर इन अध्ययनों में से अधिकांश ने आंतरिक पौधों के ऊतकों में चयापचय परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया है, जबकि कुछ को पर्यावरणीय तनाव के लिए रूट एक्स्यूडेट्स की प्रतिक्रिया पर रिपोर्ट किया गया है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य मेटाबोलाइट उत्पादन पर डीईएचपी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के लिए सामान्य दिशानिर्देश पेश करना है। परिणाम डीईएचपी द्वारा प्लांट मेटाबोलॉमिक्स के अनुवर्ती अध्ययन के लिए एक विधि मार्गदर्शन प्रदान करेंगे।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक सामान्य पाइपलाइन प्रदान करना है, एक हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग से मेटाबोलिक विश्लेषण तक, अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स पर डीईएचपी के प्रभाव को निर्धारित करना।

1. हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग

नोट: यह प्रोटोकॉल डीईएचपी की विभिन्न सांद्रता के तनाव के तहत अल्फाल्फा (मेडिकागो सैटिवा) रोपाई प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए अल्फाल्फा हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है। तीन उपचार स्थापित किए गए थे: बिना किसी परिवर्धन के नियंत्रण, और पोषक तत्व समाधान 1 मिलीग्राम किलो -1 और 10 मिलीग्राम किलो -1 डीआई (डीईएचपी) के साथ स्पाइक किया गया। डीईएचपी की सांद्रता मिट्टी23 में डीईएचपी की वास्तविक सामग्री के अनुसार निर्धारित की गई थी। प्रत्येक उपचार में छह प्रतिकृतियां थीं।

  1. अल्फाल्फा के बीजों को 10 मिनट के लिए 0.1% सोडियम हाइपोक्लोराइट और 30 मिनट के लिए 75% एथिल अल्कोहल के साथ स्टरलाइज़ करें।
    1. आसुत पानी के साथ कई बार निष्फल बीज को कुल्ला करें और फिर अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पेट्री डिश में नम फिल्टर पेपर पर अंकुरित करें।
  2. पोषक तत्वों के घोल से भरी एक कल्चर बोतल में 20 समान, अंकुरित, बड़े-मोटे बीजों को एक एनग्राफमेंट टोकरी पर स्थानांतरित करें, जो (μM में): Ca(NO 3)2, 3,500; एनएच4एच2पीओ4, 1,000; KNO3, 6,000; एमजीएसओ4, 2,000; एनए2फे-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए), 75; एच3 बीओ3, 46; एमएनएसओ4, 9.1; ZnSO4, 0.8; क्यूएसओ4, 0.3; और (एनएच4)6मो7ओ24, 0.02। 0.1 M KOH का उपयोग करके समाधान pH को 7.0 में समायोजित करें। सभी समाधानों को साप्ताहिक नवीनीकृत करें।
  3. सभी कल्चर बोतलों को 150-180 μmol m-2 s-1 की हल्की तीव्रता के साथ एक नियंत्रित विकास कक्ष में रखें, जिसमें प्रत्येक दिन 16 घंटे की फोटोअवधि के साथ, क्रमशः 27 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस क्रमशः दिन (16 घंटे) और रात (8 घंटे) का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  4. 2 सप्ताह के बाद 1 मिलीग्राम किलो -1 और 10 मिलीग्राम किलो -1 डीईएचपी तनाव के तहत कल्चर प्रयोगों के लिए 15 समान अल्फाल्फा रोपाई को एक नई कांच की बोतल में स्थानांतरित करें। डीईएचपी के फोटोलिसिस और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और पैराफिल्म के साथ कांच की बोतलों को लपेटें। समान शर्तों को लागू करने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी और पैराफिल्म के साथ नियंत्रण बोतलों को भी लपेटें। तरल स्तर को बनाए रखने के लिए रोजाना पोषक तत्व समाधान को पूरक करें।
  5. अल्फाल्फा के पौधों के लिए लगातार विकास की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए हर 2 दिनों में बोतलों को बेतरतीब ढंग से रखें और घुमाएं।
  6. खेती के 7 दिनों के बाद, अल्फाल्फा के पौधों को बोतलों से हटा दें और कई बार अल्ट्राप्योर पानी से धो लें, जड़ के संग्रह की तैयारी करें।

2. रूट एक्स्यूडेट्स का संग्रह, निष्कर्षण और चयापचय विश्लेषण

नोट: इस प्रोटोकॉल को तीन भागों में विभाजित किया गया है: एक संग्रह प्रयोग, एक निष्कर्षण प्रयोग, और रूट एक्स्यूडेट्स का मेटाबोलिक विश्लेषण। संग्रह प्रयोग का लक्ष्य पौधों के नमूनों में स्रावित मेटाबोलाइट्स को बाद के निष्कर्षण के लिए समाधान प्रणाली में स्थानांतरित करना है।

  1. संग्रह प्रयोग
    1. 10 समान अल्फाल्फा रोपाई को 50 मिलीलीटर निष्फल विआयनीकृत पानी से भरे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 6 घंटे के लिए जड़ ों को इकट्ठा करने के लिए जड़ों को पानी में डुबोएं; ट्यूब ों को सीधा रखें। प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम छह प्रतिकृतियां करें।
    2. जड़ों को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब लपेटें।
    3. पौधों को हटा दें और मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग के लिए एकत्र किए गए तरल को फ्रीज-ड्राई करें।
  2. निष्कर्षण प्रयोग
    1. 30 सेकंड के लिए ट्यूबों और भंवर में निष्कर्षण समाधान (मेथनॉल: एच2ओ = 3: 1, वी / वी) के 1.8 एमएल जोड़ें।
    2. बर्फ के पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए ट्यूबों पर अल्ट्रासाउंड तरंगों को लागू करें।
    3. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 11,000 × ग्राम पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सावधानीपूर्वक 200 μL सतह पर तैरनेवाला को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने से सतह पर तैरनेवाला का 45 μL लें और इसे 270 μL की अंतिम मात्रा में गुणवत्ता नियंत्रण (QC) नमूनों में मिलाएं, जिसका उपयोग नमूनों के चयापचय डेटा के अंशांकन के लिए किया जाता है।
    5. एक वैक्यूम कंसंट्रेटर में अर्क को फ्रीज-ड्राई करें। आंतरिक मानक (राइबोन्यूक्लियोल) के 5 μL के साथ सूखना जारी रखें।
    6. वैक्यूम कंसंट्रेटर में वाष्पीकरण के बाद, ट्यूबों में 30 μL मेथॉक्सीमिनेशन हाइड्रोक्लोराइड (20 मिलीग्राम mL-1 की सांद्रता पर पाइरिडिन में घुल गया) जोड़ें और ट्यूबों को 30 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, नमूनों में 40 μL bis (trimethylsilyl) trifloroacetamide (BSTFA) अभिकर्मक (1% ट्राइमेथिलक्लोरोसिलेन [TMC], V/V के साथ) जोड़ें और ट्यूबों को 70 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 1.5 घंटे के लिए रखें।
    7. नमूने को कमरे के तापमान पर ठंडा करें और क्यूसी नमूनों में फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (एफएएमई) (क्लोरोफॉर्म में) के 5 μL जोड़ें।
  3. मेटाबोलिक विश्लेषण
    1. स्प्लिटलेस मोड का उपयोग करके मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग विश्लेषण के लिए टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर (जीसी-टीओएफ-एमएस) के साथ युग्मित गैस क्रोमेटोग्राफ सिस्टम में व्युत्पन्न अर्क के 1.0 μL इंजेक्ट करें।
      1. रूट एक्स्यूडेट्स के पृथक्करण के लिए एक केशिका स्तंभ (30 मीटर x 250 μm x 0.25 μm) का उपयोग करें, जिसमें हीलियम 1.0 एमएल मिनट -1 की प्रवाह दर पर वाहक गैस के रूप में है। इंजेक्शन तापमान को 280 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और क्रमशः 280 डिग्री सेल्सियस और 250 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफर लाइन तापमान और आयन स्रोत तापमान बनाए रखें।
      2. पृथक्करण के लिए, निम्नलिखित ओवन प्रोग्राम का उपयोग करें: 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट आइसोथर्मल हीटिंग, 310 डिग्री सेल्सियस पर 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट -1 ओवन रैंप, और 8 मिनट के लिए 310 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम इज़ोटेर्मल हीटिंग।
      3. -70 ईवी ऊर्जा के साथ इलेक्ट्रॉन टकराव मोड का प्रदर्शन करें। 12.5 स्पेक्ट्रा / सेकंड की दर से 50-500 मीटर / जेड की मास स्कैन रेंज के साथ पूर्ण स्कैन निगरानी मोड का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
    2. शोर को हटाने के लिए अलग-अलग चोटियों को फ़िल्टर करें। विचलन मान को इंटरक्वार्टाइल रेंज के आधार पर फ़िल्टर किया जाता है।
    3. अनुपलब्ध मानों को न्यूनतम मानों के आधे से भरें, डेटा को मानकीकृत और सामान्य करें.
    4. बहुभिन्नरूपी विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में .csv प्रारूप में अंतिम डेटा आयात करें।
    5. जीन और जीनोम (केईजीजी) डेटाबेस (जैविक प्रणाली के उच्च-स्तरीय कार्यों और उपयोगिताओं को समझने के लिए एक डेटाबेस संसाधन) के क्योटो एनसाइक्लोपीडिया में मेटाबोलाइट्स को देखें, और मेटाबोलाइट्स को कार्बोहाइड्रेट, एसिड, लिपिड, अल्कोहल और अमाइन जैसे विभिन्न श्रेणियों में वर्गीकृत करें। सभी रूट एक्स्यूडेट्स में प्रत्येक श्रेणी के प्रतिशत को इंगित करने के लिए पाई चार्ट बनाने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    6. समूहों के बीच अंतर को प्रदर्शित करने के लिए अव्यक्त संरचनाओं-भेदभाव विश्लेषण (ओपीएलएस-डीए) के लिए पर्यवेक्षित ऑर्थोगोनल अनुमानों को लागू करें।
    7. स्क्रीन ने मेटाबोलाइट्स को प्रोजेक्शन (वीआईपी) > 1 और पी < 0.05 (छात्र के टी टेस्ट) में परिवर्तनीय महत्व के आधार पर अंतर मेटाबोलाइट्स के रूप में काफी बदल दिया।
    8. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ गर्मी मानचित्र बनाने के लिए मेटाबोलोम डेटा का उपयोग करें और हिस्टोग्राम बनाने के लिए विभिन्न उपचारों के तहत फोल्ड परिवर्तनों का उपयोग करें।
    9. केईजीजी डेटाबेस और पबकेम में अंतर मेटाबोलाइट्स को देखें और अंतर मेटाबोलाइट्स युक्त चयापचय मार्गों को संकलित करें। मार्ग संवर्धन विश्लेषण या टोपोलॉजी विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस प्रयोग में, अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स को उपरोक्त विधियों (चित्रा 1) के अनुसार एकत्र, निकाला और विश्लेषण किया गया था। तीन उपचार समूह स्थापित किए गए थे: नियंत्रण, डीईएचपी की कम एकाग्रता (1 मिलीग्राम एल -1), और डीईएचपी की उच्च एकाग्रता (10 मिलीग्राम एल -1)।

नियंत्रण के क्रोमैटोग्राफ में कुल 778 चोटियों का पता लगाया गया था, जिनमें से 314 मेटाबोलाइट्स को द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के अनुसार पहचाना जा सकता है। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, इन चयापचयों को सापेक्ष बहुतायत के आधार पर छह प्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है: कार्बोहाइड्रेट (28.6%), एसिड (15.58%), लिपिड (13.87%), अल्कोहल (3.91%), अमाइन (0.92%), और अन्य (37.12%)। मेटाबोलाइट्स जो 0.5% से कम के लिए जिम्मेदार थे, उन्हें अन्य पदार्थों के रूप में वर्गीकृत किया गया था (चित्रा 2 ए)। एसिड को आगे फैटी एसिड (56.09%), अमीनो एसिड (26.62%), कार्बनिक एसिड (13.95%), और फेनोलिक एसिड (3.34%) में विभाजित किया गया था (चित्रा 2 बी)। इसके अलावा, अधिकांश पौधों की जड़ एक्स्यूडेट्स में कुछ सामान्य पदार्थों का भी अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स में पता लगाया जा सकता है, जिसमें पाइरिमिडाइन, हाइड्रॉक्सी पाइरिडिन, फ्लेवोनोइड्स, फिनोल, केटोन्स, पाइरिमिडिन, फ्लेवोनोइड्स और डाइटरपेन शामिल हैं।

वीआईपी स्कोर (चित्रा 3) के आधार पर विभिन्न डीईएचपी उपचारों के बीच अंतर मेटाबोलाइट्स में भिन्नता की कल्पना करने के लिए एक गर्मी मानचित्र प्लॉट किया गया था। नियंत्रण की तुलना में, डीईएचपी के संपर्क में अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स में 50 मेटाबोलाइट्स की सामग्री में काफी बदलाव आया, जिसमें मुख्य रूप से कुछ कार्बोहाइड्रेट और कम आणविक भार वाले कार्बनिक एसिड शामिल थे। डीईएचपी की उपस्थिति में पांच प्रकार के कार्बोहाइड्रेट (लिक्सोज, डिजिटोक्सोज, एरिथ्रोज, ट्रेहलोस, और फ्रुक्टोज 2, 6-बिहोस्फेट) को विनियमित किया गया था, और इनमें से दो (लिक्सोस और डिजिटोक्सोज) में काफी वृद्धि हुई थी क्योंकि डीईएचपी की एकाग्रता में वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, डीईएचपी की उपस्थिति में पांच मेटाबोलाइट्स को डाउनरेगुलेट किया गया था, जिसमें डी-टैलोज और ग्लूकोज जैसे मोनोसैकराइड, माल्टोज, सेलोबायोस और ट्रेहलोज जैसे डिसैकराइड्स और डी-अरबिटोल जैसे चीनी अल्कोहल शामिल थे। कार्बोहाइड्रेट सामग्री को पौधे की शारीरिक स्थिति के संकेतक के रूप में माना गयाहै। इसलिए, यहां मोनोसैकराइड और डिसैकराइड के स्तर में कमी ने डीईएचपी तनाव के कारण शारीरिक तनाव का संकेत दिया। कार्बोहाइड्रेट की तुलना में, डीईएचपी ने अल्फाल्फा रोपाई में एसिड चयापचय पर अधिक प्रभाव डाला। डीईएचपी के संपर्क में, 11 एसिड मेटाबोलाइट्स की सामग्री में काफी वृद्धि हुई थी, जिसमें मुख्य रूप से 2-एमिनो-2-नॉरबोर्नएनेकारबॉक्सिलिक एसिड, 5-हाइड्रॉक्सीइंडोल-2-कार्बोक्जिलिक एसिड, 3-हाइड्रॉक्सी-एल-प्रोलाइन, पेलार्गोनिक एसिड और पामिटिक एसिड शामिल थे। इसी समय, डीईएचपी ने अल्फाल्फा रोपाई में कुछ फ्लेवोनोइड्स के चयापचय को भी रोक दिया, जिसमें 4', 5-डायहेरॉक्सी-7-मेथॉक्सीआइसोफ्लेवोन और नियोहेस्पेरिडिन शामिल हैं।

डीईएचपी से प्रभावित चयापचय मार्गों को चित्रा 4 में वर्णित किया गया है। डीईएचपी ने कार्बोहाइड्रेट के चयापचय को काफी रोक दिया, जैसे कि कुछ मोनोसैकराइड और डिसैकराइड, जो प्रकाश संश्लेषण के उत्पाद हैं। इसलिए, डीईएचपी अल्फाल्फा के प्रकाश संश्लेषण को एक निश्चित सीमा तक दबा सकता है। इसके अलावा, डीईएचपी फैटी एसिड के चयापचय को बढ़ावा दे सकता है, जो पौधों के लिए डीईएचपी से तनाव का विरोध करने में सहायक होते हैं। डीईएचपी से प्रभावित प्रमुख चयापचय मार्ग कार्बोहाइड्रेट चयापचय और फैटी एसिड चयापचय थे, जबकि अमीनो एसिड चयापचय, लिपिड चयापचय और ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड (टीसीए) चक्र बहुत कम हद तक प्रभावित हुए थे।

Figure 1
चित्रा 1: अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स के लिए गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण का एक प्रवाह चार्ट। बीएसटीएफए बीआईएस (ट्राइमिथाइलसिलिल) ट्राइफ्लोरोसेटामाइड (बीएसटीएफए) अभिकर्मक (1% ट्राइमिथाइलक्लोरोसिलेन [टीएमसी], वी / वी के साथ) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मेटाबोलाइट्स का वर्गीकरण। (ए) ज्ञात मेटाबोलाइट्स और (बी) एसिड का वर्गीकरण। प्रत्येक प्रकार की सामग्री के प्रतिशत को नियंत्रण में सभी पदार्थों के शिखर क्षेत्र के योग से प्रत्येक श्रेणी के शिखर क्षेत्र के योग से विभाजित किया जाता है। अन्य पदार्थ <0.5% पर थे। अन्य एसिड <0.5% पर थे। यह आंकड़ा वांग एट अल.25 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न डीईएचपी उपचारों के साथ अल्फाल्फा रोपाई के रूट एक्स्यूडेट्स (वीआईपी > 1, पी < 0.05) के लिए पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण का हीटमैप। लाल और हरा क्रमशः उच्च और निम्न बहुतायत का प्रतिनिधित्व करते हैं। एसीके नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है; 1 + एडी 1 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी के साथ उपचार का प्रतिनिधित्व करता है; 10 + एडी 10 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी के साथ उपचार का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा वांग एट अल.25 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चयापचय मार्गों की गड़बड़ी और जैविक समापन बिंदुओं (1 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी, 10 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी) में परिवर्तन के बीच संबंध। मेटाबॉलिक मार्ग क्योटो एनसाइक्लोपीडिया ऑफ जीन एंड जीनोम (केईजीजी) डेटाबेस के आधार पर स्थापित किए गए थे। हरे रंग के पाठ में मेटाबोलाइट्स वर्तमान कार्य में पाए गए मेटाबोलाइट्स थे। कोष्ठक में "लाल बक्से" और "नीले बक्से" के संकेत बताते हैं कि मेटाबोलाइट्स क्रमशः जैविक समापन बिंदुओं में वृद्धि (पी < 0.05) या कमी (पी < 0.05) योगदान करते हैं। आंकड़े को मेटाबोलाइट्स को मोटे तौर पर कार्बोहाइड्रेट, फैटी एसिड और प्रोटीन चयापचय में अलग करके पठनीय बनाया गया है, जैसा कि क्रमशः हरे, लाल और काले आयताकार बक्से द्वारा दिखाया गया है। एसीके नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है; 1 + एडी 1 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी के साथ उपचार का प्रतिनिधित्व करता है; 10 + एडी 10 मिलीग्राम एल -1 डीईएचपी के साथ उपचार का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा वांग एट अल.25 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल डीईएचपी तनाव के तहत अल्फाल्फा के रूट एक्स्यूडेट्स को इकट्ठा करने और मापने के साथ-साथ मेटाबोलोम डेटा का विश्लेषण करने के तरीके के बारे में सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर पूरा ध्यान देने की आवश्यकता है। हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोगों में, अल्फाल्फा के पौधों को डीईएचपी की विभिन्न सांद्रता के साथ पोषक तत्वों के समाधान से भरी कांच की बोतलों में हाइड्रोपोनिक रूप से सुसंस्कृत किया गया था। कांच की बोतलों को पूरे कल्चर अवधि में एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश से बचाया जाना चाहिए, ताकि डीईएचपी को फोटोलिसिस से रोका जा सके और सभी संस्कृति समाधानों25,26 में डीईएचपी सांद्रता की एकरूपता सुनिश्चित की जा सके। डीईएचपी सांद्रता को 1 मिलीग्राम एल -1 और 10 मिलीग्राम एल -1 के रूप में सेट किया गया था, आमतौर पर डीईएचपी27,28 से दूषित मिट्टी में पाए जाने वाले सांद्रता के अनुसार। रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह के दौरान, सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को अभी भी जड़ों को प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटने की आवश्यकता होती है। यहां, संग्रह का समय 6 घंटे निर्धारित किया गया था। यदि संग्रह का समय बहुत कम है, तो कुछ कम-बहुतायत वाले रूट एक्स्यूडेट्स की एकाग्रता का पता लगाने के लिए बहुत कम हो सकता है, इसलिए रूट एक्स्यूडेट्स की संरचना डीईएचपी तनाव के तहत अल्फाल्फा रोपाई की वास्तविक प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है। यदि संग्रह का समय बहुत लंबा है, तो एकत्र किए गए रूट एक्स्यूडेट्स को संस्कृति प्रणालियों में रोगाणुओं द्वारा कुछ हद तक नीचा दिखाया जा सकता है। इस मामले में, कुछ माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स का भी पता लगाया जा सकता है, जिससे रूट एक्सयूडेट्स29 की संरचना बदल जाती है। इसके अलावा, प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम छह प्रतिकृतियां की जानी चाहिए ताकि सटीक चयापचय डेटा विश्लेषण सुनिश्चित किया जा सके।

केवल कुछ निश्चित प्रकार के रूट एक्स्यूडेट्स, जैसे अमीनो एसिड, फैटी एसिड, फेनोलिक यौगिक, और अन्य कार्बनिक एसिड, पारंपरिक लक्षित विश्लेषणात्मक तरीकों (यानी, ज्ञात यौगिकों की खोज) 30,31,32 का उपयोग करके निर्धारित किए जा सकते हैं, मानक विश्लेषणात्मक तरीकों का उपयोग करके, जैसे स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री, उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), आयन क्रोमैटोग्राफी (आईसी), गैस क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस / टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) के साथ। वाद्य विश्लेषण तकनीकों के विकास के साथ, जीसी-टीओएफ-एमएस, तरल क्रोमैटोग्राफी-उच्च रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एचआर-एमएस), और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) 33 के आधार पर गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण उभरा है। रूट एक्स्यूडेट्स के अन्य पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों की तुलना में, गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण पता लगाए गए रूट एक्स्यूडेट्स की संख्या का विस्तार करता है, जो पर्यावरणीय तनाव के लिए पौधे की चयापचय प्रतिक्रियाओं को गहराई से समझने की सुविधा प्रदान करता है।

वर्तमान अध्ययन में तकनीक की कुछ सीमाएं हैं, खासकर मेटाबोलाइट्स के मात्रात्मक विश्लेषण में। गैर-लक्षित मेटाबोलिक विश्लेषण केवल सटीक सांद्रता के बजाय विभिन्न मेटाबोलाइट्स के बीच सापेक्ष मात्रात्मक संबंधों को प्रदर्शित करता है। यह पर्यावरणीय व्यवहार या रूट एक्स्यूडेट्स34 के पारिस्थितिक प्रभावों की जांच के लिए प्रतिकूल है। अल्फाल्फा रोपाई के विकास मीडिया के लिए, वर्तमान अध्ययन में हाइड्रोपोनिक कल्चर प्रयोग किए गए थे, जिनमें आसान नियंत्रण और आसान संचालन के फायदे हैं। हालांकि, कृत्रिम हाइड्रोपोनिक विकास वातावरण वास्तविक मिट्टी के वातावरण से अलग है,जिससे जड़ों द्वारा मेटाबोलाइट रीपटेक के कारण सकल उत्सर्जन दर का संभावित कम अनुमान लगाया जा सकता है। हाइड्रोपोनिक संस्कृति की तुलना में, रेत संस्कृति एक अपेक्षाकृत अधिक ठोस विधि है क्योंकि यह वास्तविक मिट्टी के वातावरण के करीब है, जोयथार्थवादी वातावरण में रूट एक्स्यूडेट्स के संग्रह की सुविधा प्रदान करता है। इसलिए, प्रयोगात्मक परिणामों को और अधिक ठोस बनाने के लिए रेत संस्कृति या यहां तक कि वास्तविक मिट्टी संस्कृति की एक विधि स्थापित करने के लिए काम चल रहा है, जो हमें अधिक गहन शोध करने में मदद करेगा, विषाक्तता प्रतिक्रिया को समझाने के लिए व्यावहारिक महत्व के बेहतर परिणाम दिखाएगा।

गैर-लक्षित चयापचय विश्लेषण के आधार पर, हम न केवल पर्यावरणीय तनाव37 के लिए पौधों की चयापचय प्रतिक्रिया का पता लगा सकते हैं, बल्कि अंतर मेटाबोलाइट्स भी निर्धारित कर सकते हैं औरदूषित पदार्थों के पर्यावरणीय व्यवहार में अंतर मेटाबोलाइट्स की महत्वपूर्ण भूमिका की जांच कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पेलार्गोनिक एसिड के स्तर का उपयोग जड़ झिल्ली क्षति के संकेतक के रूप में किया जा सकता है जब पौधे तनावमें होते हैं। असंतृप्त फैटी एसिड (पामिटिक एसिड) झिल्ली तरलता40 को बढ़ाने के लिए भी पाया गया, जो अल्फाल्फा रूट झिल्ली को डीईएचपी क्षति से बचा सकता है। डीईएचपी द्वारा बाधित कुछ फ्लेवोनोइड फलियां और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत में भाग ले सकते हैं। इसके अलावा, पौधों और राइजोस्फीयर जैविक समुदाय के बीच बातचीत को गैर-लक्षित चयापचय विश्लेषण के साथ अधिक गहराई से समझा जा सकता है, खासकरदूषित पदार्थों के तनाव के तहत। गैर-लक्षित चयापचय विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक उपकरणों के विकास के साथ अधिक प्रकार के रूट एक्स्यूडेट्स की पहचान की जाएगी, जो पौधे की जड़ एक्स्यूडेट्स43 के मेटाबोलिक फिंगरप्रिंटिंग के निर्माण के लिए सहायक है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस काम को संयुक्त रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (41877139), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (41991335) की प्रमुख परियोजनाओं, चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016वाईएफडी0800204), जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या बीके 20161616), "135" योजना और चीनी विज्ञान अकादमी (आईएसएसएसआईपी 1615) के फ्रंटियर ्स प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 196
मेटाबोलाइट उत्पादन पर डीआई (2-एथिलहेक्सिल) थैलेट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अल्फाल्फा रूट एक्स्यूडेट्स का संग्रह
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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