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Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.

Abstract

Los exudados de raíces son el principal medio de comunicación de información y transferencia de energía entre las raíces de las plantas y el entorno circundante. El cambio en la secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo tiene como objetivo introducir directrices generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) en la producción de metabolitos. Primero, las plántulas de alfalfa se cultivan bajo estrés DEHP en un experimento de cultivo hidropónico. En segundo lugar, las plantas se transfieren a tubos de centrífuga que contienen 50 ml de agua ultrapura esterilizada durante 6 h para recoger los exudados de la raíz. Las soluciones se liofilizan en un liofilizador al vacío. Las muestras congeladas se extraen y se derivatizan con el reactivo bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, los extractos derivatizados se miden utilizando un sistema de cromatógrafo de gases acoplado con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS). Los datos de metabolitos adquiridos se analizan en base a métodos bioinformáticos. Los metabolitos diferenciales y las vías metabólicas significativamente modificadas deben explorarse profundamente para revelar el impacto del DEHP en la alfalfa en vista de los exudados de la raíz.

Introduction

El ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) es un compuesto químico sintético que se usa ampliamente en varios plásticos y polímeros como plastificante para mejorar su plasticidad y resistencia. En los últimos años, un número creciente de estudios han sugerido que el DEHP es un disruptor endocrino y tiene efectos adversos sobre los sistemas respiratorio, nervioso y reproductivo de los seres humanos y otros animales 1,2,3. Teniendo en cuenta su riesgo para la salud, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, la Unión Europea y el Centro de Monitoreo Ambiental de China han clasificado el DEHP en la lista de contaminantes prioritarios. El suelo ha sido considerado como un importante sumidero de DEHP en el medio ambiente, debido a la aplicación de mantillo plástico y fertilizantes orgánicos, riego con aguas residuales y aplicación de lodos agrícolas4. Como era de esperar, el DEHP se ha detectado ubicuamente en suelos de tierras de cultivo, cuyo contenido incluso alcanza hasta miligramos por kilogramo de suelo seco en algunas regiones de China 5,6. El DEHP puede ingresar a las plantas principalmente a través de las raíces y sufrir biomagnificación a diferentes niveles tróficos en los ecosistemas del suelo7. Por lo tanto, se ha planteado una preocupación significativa sobre el estrés inducido por el DEHP en las plantas en las últimas décadas.

Las plantas suelen ser vulnerables a la exposición al DEHP. Se ha observado que el estrés del DEHP ejerce un efecto adverso sobre la germinación de las semillas y el metabolismo normal, inhibiendo así el crecimiento y desarrollo de las plantas 8,9. Por ejemplo, el DEHP puede inducir daño oxidativo a las células del mesófilo, disminuir el contenido de clorofila y osmolitos, y elevar las actividades de las enzimas antioxidantes, lo que eventualmente resulta en una disminución en el rendimiento y la calidad de las plantas comestibles10,11. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos sobre la respuesta de las plantas al estrés del DEHP se han centrado en el estrés oxidativo y las características fisiológicas y bioquímicas. Los mecanismos correspondientes asociados con el metabolismo de las plantas están menos estudiados. Exudados de raíz es un término genérico que describe compuestos que las raíces de las plantas secretan y liberan en el medio ambiente. Han sido considerados como el medio de interacción entre las plantas y el suelo de la rizosfera, desempeñando un papel importante en el apoyo al crecimiento y desarrollo de las plantas12. Es bien sabido que los exudados de la raíz representan aproximadamente el 30%-40% de todo el carbono fotosintético13. En ambientes contaminados, los exudados radiculares están involucrados en la mejora de la tolerancia de las plantas al estrés de los contaminantes a través del metabolismo o la exclusión externa14. Como consecuencia, una comprensión profunda de la respuesta de los exudados de las raíces de las plantas al estrés por contaminación puede ayudar a revelar los mecanismos subyacentes asociados con la bioquímica celular y los fenómenos biológicos15.

La tecnología metabolómica proporciona una estrategia eficiente para medir un gran número de metabolitos de moléculas pequeñas simultáneamente dentro de las células 16,17, tejidos18 e incluso exudados de organismos 19, incluidos azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos y lípidos. En comparación con los métodos de análisis químico tradicionales o clásicos, el enfoque metabolómico aumenta en gran medida el número de metabolitos que se pueden detectar20, lo que puede ayudar a identificar metabolitos de una manera de mayor rendimiento e identificar vías metabólicas clave. La metabolómica ha sido ampliamente utilizada en el campo de investigación de la respuesta biológica en ambientes de estrés, como metales pesados21, contaminantes emergentes22 y nanopartículas19. La mayoría de estos estudios en plantas se han centrado en los cambios metabólicos en los tejidos interiores de las plantas, mientras que pocos se han reportado sobre la respuesta de los exudados de las raíces al estrés ambiental. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es introducir pautas generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del DEHP en la producción de metabolitos. Los resultados proporcionarán una guía metodológica para el estudio de seguimiento de la metabolómica vegetal por DEHP.

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Protocol

El objetivo de este protocolo es proporcionar una tubería general, desde un experimento de cultivo hidropónico hasta el análisis metabolómico, cuantificando el efecto del DEHP en los exudados de la raíz de alfalfa.

1. Experimento de cultivo hidropónico

NOTA: Este protocolo presenta un ejemplo de un experimento de cultivo hidropónico de alfalfa diseñado para obtener plántulas de alfalfa (Medicago sativa) bajo el estrés de diferentes concentraciones de DEHP. Se establecieron tres tratamientos: el control sin adiciones y la solución nutritiva enriquecida con 1 mg kg-1 y 10 mg kg-1 de di(DEHP. Las concentraciones de DEHP se establecieron de acuerdo con el contenido real de DEHP en el suelo23. Cada tratamiento tuvo seis réplicas.

  1. Esterilice las semillas de alfalfa con hipoclorito de sodio al 0,1% durante 10 min y alcohol etílico al 75% durante 30 min.
    1. Enjuague las semillas esterilizadas varias veces con agua destilada y luego germine en papel de filtro húmedo en una placa de Petri estéril a 30 ° C en la oscuridad.
  2. Transfiera 20 semillas uniformes, germinadas y grandes a una cesta de injerto en una botella de cultivo llena de solución nutritiva, compuesta de (en μM): Ca(NO 3)2, 3,500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Ácido Na2Fe-etilendiaminotetraacético (EDTA), 75; H 3BO3, 46; MnSO4, 9,1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; y (NH4 )6Mo7O24, 0.02. Ajuste el pH de la solución a 7,0 utilizando 0,1 M KOH. Renueve todas las soluciones semanalmente.
  3. Colocar todos los frascos de cultivo en una cámara de crecimiento controlado con una intensidad lumínica de 150-180 μmol m-2 s-1 con un fotoperiodo de 16 h cada día, a 27 °C y 20 °C representando el día (16 h) y la noche (8 h), respectivamente.
  4. Transfiera 15 plántulas uniformes de alfalfa a una nueva botella de vidrio para experimentos de cultivo por debajo de 1 mg kg-1 y 10 mg kg-1 de estrés DEHP después de 2 semanas. Envuelva las botellas de vidrio con papel de aluminio y parafilm para evitar la fotólisis y la volatilización del DEHP. Para aplicar las mismas condiciones, también envuelva las botellas de control con papel de aluminio y parafilm. Complemente la solución nutritiva diariamente para mantener el nivel de líquido.
  5. Coloque y gire las botellas al azar cada 2 días para garantizar condiciones de crecimiento consistentes para las plántulas de alfalfa.
  6. Después de 7 días de cultivo, retire las plántulas de alfalfa de las botellas y lávelas con agua ultrapura varias veces, preparándose para la recolección de exudados de raíces.

2. Recolección, extracción y análisis metabolómico de exudados radiculares

NOTA: Este protocolo se divide en tres partes: un experimento de recolección, un experimento de extracción y un análisis metabolómico de los exudados de la raíz. El objetivo del experimento de recolección es transferir los metabolitos secretados en las muestras de plantas al sistema de solución para su posterior extracción.

  1. Experimento de recopilación
    1. Transfiera 10 plántulas uniformes de alfalfa a tubos de centrífuga llenos de 50 ml de agua desionizada esterilizada. Sumerge las raíces en agua para recoger los exudados de la raíz durante 6 h; Mantenga los tubos en posición vertical. Realizar al menos seis réplicas para cada tratamiento.
    2. Envuelva los tubos de la centrífuga con papel de aluminio para proteger las raíces de la luz.
    3. Retire las plantas y liofilique el líquido recolectado para el perfil de metabolitos.
  2. Experimento de extracción
    1. Añadir 1,8 ml de solución de extracción (metanol:H2O= 3:1, V/V) a los tubos y vórtice durante 30 s.
    2. Aplique ondas de ultrasonido a los tubos durante 10 minutos en un baño de agua helada.
    3. Centrifugar las muestras a 4 °C y 11.000 × g durante 15 min.
    4. Transfiera cuidadosamente 200 μL de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tomar 45 μL de sobrenadante de cada muestra y mezclarlo en muestras de control de calidad (QC) a un volumen final de 270 μL, que se utiliza para la calibración de los datos del metaboloma de las muestras.
    5. Liofilizar los extractos en un concentrador de vacío. Continuar secando con 5 μL del patrón interno (ribonucleol).
    6. Después de la evaporación en un concentrador de vacío, añadir 30 μL de clorhidrato de metoxiaminación (disuelto en piridina a una concentración de 20 mg mL-1) a los tubos e incubar los tubos a 80 °C durante 30 min. A continuación, añadir 40 μL de reactivo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (con trimetilclorosilano [TMC] AL 1% de v/v) a las muestras y colocar los tubos a 70 °C durante 1,5 h para la derivatización.
    7. Enfriar las muestras a temperatura ambiente y añadir 5 μL de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) (en cloroformo) a las muestras de control de calidad.
  3. Análisis metabolómico
    1. Inyectar 1,0 μL de los extractos derivatizados en un sistema de cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS) para el análisis de perfiles metabolómicos utilizando un modo sin división.
      1. Utilice una columna capilar (30 m x 250 μm x 0,25 μm) para la separación de los exudados de la raíz, con helio como gas portador a un caudal de 1,0 ml min-1. Ajuste la temperatura de inyección a 280 °C y mantenga la temperatura de la línea de transferencia y la temperatura de la fuente de iones a 280 °C y 250 °C, respectivamente.
      2. Para la separación, utilice el siguiente programa de horno: calentamiento isotérmico de 1 min a 50 °C, una rampa de horno de 10 °C/min-1 a 310 °C y calentamiento isotérmico final a 310 °C durante 8 min.
      3. Realice el modo de colisión de electrones con -70 eV de energía. Obtenga espectros de masas utilizando el modo de monitoreo de barrido completo con un rango de escaneo de masas de 50-500 m/z a una velocidad de 12,5 espectros/s.
    2. Filtre los picos individuales para eliminar el ruido. El valor de desviación se filtra en función del rango intercuartílico.
    3. Rellene los valores que faltan con la mitad de los valores mínimos, estandarice y normalice los datos.
    4. Importe los datos finales en formato .csv en software de análisis estadístico para análisis multivariante.
    5. Busque los metabolitos en la base de datos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) (un recurso de base de datos para comprender las funciones y utilidades de alto nivel del sistema biológico) y clasifique los metabolitos en diferentes categorías, como carbohidratos, ácidos, lípidos, alcoholes y aminas. Utilice software de análisis estadístico para construir un gráfico circular para indicar el porcentaje de cada categoría en todos los exudados de la raíz.
    6. Aplicar proyecciones ortogonales supervisadas al análisis discriminatorio de estructuras latentes (OPLS-DA) para demostrar las diferencias entre los grupos.
    7. El cribado cambió significativamente los metabolitos como metabolitos diferenciales en función de una importancia variable en la proyección (VIP) > 1 y p < 0,05 (prueba t de Student).
    8. Utilice los datos del metaboloma para construir mapas de calor con el software de análisis estadístico y utilice los cambios de pliegue bajo diferentes tratamientos para construir histogramas.
    9. Busque los metabolitos diferenciales en la base de datos KEGG y Pubchem y compile las vías metabólicas que contienen los metabolitos diferenciales. Realizar análisis de enriquecimiento de vías o análisis de topología.

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Representative Results

En este experimento, los exudados de raíz de alfalfa fueron recolectados, extraídos y analizados de acuerdo con los métodos anteriores (Figura 1). Se establecieron tres grupos de tratamiento: control, baja concentración de DEHP (1 mg L-1) y alta concentración de DEHP (10 mg L-1).

Se detectaron un total de 778 picos en el cromatógrafo del control, de los cuales se pudieron identificar 314 metabolitos según los espectros de masas. Como se muestra en la Figura 2, estos metabolitos podrían clasificarse en seis tipos según la abundancia relativa: carbohidratos (28,6%), ácidos (15,58%), lípidos (13,87%), alcoholes (3,91%), aminas (0,92%) y otros (37,12%). Los metabolitos que representaron menos del 0,5% se agruparon como otras sustancias (Figura 2A). Los ácidos se subdividieron en ácidos grasos (56,09%), aminoácidos (26,62%), ácidos orgánicos (13,95%) y ácidos fenólicos (3,34%) (Figura 2B). Además, algunas sustancias comunes en los exudados de la raíz de la mayoría de las plantas también podrían detectarse en los exudados de la raíz de alfalfa, incluyendo pirimidinas, hidroxipiridinas, flavonoides, fenoles, cetonas, pirimidinas, flavonoides y diterpenos.

Se trazó un mapa de calor para visualizar la variación en los metabolitos diferenciales entre los diferentes tratamientos con DEHP, basado en la puntuación VIP (Figura 3). En comparación con el control, la exposición al DEHP cambió significativamente el contenido de 50 metabolitos en los exudados de la raíz de alfalfa, incluyendo principalmente algunos carbohidratos y ácidos orgánicos de bajo peso molecular. Cinco tipos de carbohidratos (lyxose, digitoxosa, eritrosa, trehalosa y fructosa 2, 6-bihosphate) fueron regulados al alza en presencia de DEHP, y dos de ellos (lyxose y digitoxosa) aumentaron significativamente a medida que aumentaba la concentración de DEHP. Además, cinco metabolitos fueron regulados a la baja en presencia de DEHP, incluyendo monosacáridos como D-talosa y glucosa, disacáridos como maltosa, celobiosa y trehalosa, y alcoholes de azúcar como D-arabitol. El contenido de carbohidratos ha sido considerado como un indicador del estado fisiológico de la planta24. Por lo tanto, la disminución de los niveles de monosacáridos y disacáridos en este documento indicó estrés fisiológico causado por el estrés del DEHP. En comparación con los carbohidratos, el DEHP ejerció un mayor efecto sobre el metabolismo ácido en las plántulas de alfalfa. Bajo la exposición al DEHP, el contenido de 11 metabolitos ácidos aumentó significativamente, incluyendo principalmente ácido 2-amino-2-norbornanocarboxílico, ácido 5-hidroxiindol-2-carboxílico, 3-hidroxi-L-prolina, ácido pelargónico y ácido palmítico. Al mismo tiempo, el DEHP también inhibió el metabolismo de algunos flavonoides en las plántulas de alfalfa, incluyendo 4', 5-dihiroxi-7-metoxiisoflavona y neohesperidina.

Las vías metabólicas influenciadas por el DEHP se describen en la Figura 4. El DEHP inhibió significativamente el metabolismo de los carbohidratos, como algunos monosacáridos y disacáridos, que son productos de la fotosíntesis. Por lo tanto, el DEHP puede suprimir la fotosíntesis de la alfalfa hasta cierto punto. Además, el DEHP puede promover el metabolismo de los ácidos grasos, que son útiles para que las plantas resistan el estrés del DEHP. Las principales vías metabólicas influenciadas por el DEHP fueron el metabolismo de los carbohidratos y el metabolismo de los ácidos grasos, mientras que el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los lípidos y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) se vieron afectados en mucha menor medida.

Figure 1
Figura 1: Un diagrama de flujo de análisis metabolómico no dirigido para exudados de raíz de alfalfa. BSTFA representa el reactivo bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (con 1% de trimetilclorosilano [TMC], V/V). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Clasificación de los metabolitos. (A) Clasificación de los metabolitos conocidos y (B) ácidos. El porcentaje de cada tipo de material se divide por la suma del área pico de cada categoría por la suma del área pico de todas las sustancias en el control. Otras sustancias fueron las que alcanzaron el <0,5%. Otros ácidos fueron los que estaban en <0.5%. Esta cifra ha sido modificada de Wang et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mapa de calor del análisis de agrupamiento jerárquico para exudados radiculares (VIP > 1, p < 0.05) de plántulas de alfalfa con diferentes tratamientos de DEHP. El rojo y el verde representan una abundancia alta y baja, respectivamente. ACK representa el control; 1+AD representa el tratamiento con 1 mg L−1 DEHP; 10+AD representa el tratamiento con 10 mg L−1 DEHP. Esta cifra ha sido modificada de Wang et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Relaciones entre la alteración de las vías metabólicas y las alteraciones en los criterios de valoración biológicos (1 mg L−1 DEHP, 10 mg L−1 DEHP). Las vías metabólicas se establecieron sobre la base de datos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Los metabolitos en texto verde fueron los metabolitos detectados en el presente trabajo. Los signos "cajas rojas" y "cajas azules" entre paréntesis indican que los metabolitos aumentaron (p < 0,05) o disminuyeron (p < 0,05) las contribuciones a los criterios de valoración biológicos, respectivamente. La figura se ha hecho legible separando los metabolitos aproximadamente en carbohidratos, ácidos grasos y metabolismo de proteínas, como se muestra en las cajas rectangulares verdes, rojas y negras, respectivamente. ACK representa el control; 1+AD representa el tratamiento con 1 mg L−1 DEHP; 10+AD representa el tratamiento con 10 mg L−1 DEHP. Esta cifra ha sido modificada de Wang et al.25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo proporciona orientación general sobre cómo recolectar y medir los exudados de la raíz de la alfalfa bajo estrés DEHP, así como sobre cómo analizar los datos del metaboloma. Se debe prestar mucha atención a algunos pasos críticos en este protocolo. En experimentos de cultivo hidropónico, las plántulas de alfalfa se cultivaron hidropónicamente en botellas de vidrio llenas de soluciones nutritivas con diferentes concentraciones de DEHP. Las botellas de vidrio deben protegerse de la luz cubriéndolas con papel de aluminio durante todo el período de cultivo, para evitar la fotólisis del DEHP y asegurar la uniformidad de las concentraciones de DEHP en todas las soluciones de cultivo25,26. Las concentraciones de DEHP se fijaron en 1 mg L-1 y 10 mg L-1, de acuerdo con las concentraciones generalmente encontradas en suelos contaminados con DEHP27,28. Durante la recolección de exudados de raíces, los tubos de centrífuga aún deben envolverse con papel de aluminio para proteger las raíces de la luz. Aquí, el tiempo de recolección se estableció en 6 h. Si el tiempo de recolección es demasiado corto, la concentración de algunos exudados de raíces de baja abundancia podría ser demasiado baja para ser detectada, por lo que la composición de los exudados de la raíz podría no reflejar la respuesta real de las plántulas de alfalfa bajo estrés DEHP. Si el tiempo de recolección es demasiado largo, los exudados de la raíz recolectados pueden ser degradados en cierta medida por los microbios en los sistemas de cultivo. En este caso, algunos metabolitos microbianos también podrían ser detectados, cambiando la composición de los exudados de la raíz29. Además, se deben realizar al menos seis réplicas para cada tratamiento a fin de garantizar un análisis preciso de los datos del metaboloma.

Solo algunos tipos ciertos de exudados radiculares, como aminoácidos, ácidos grasos, compuestos fenólicos y otros ácidos orgánicos, pueden determinarse utilizando métodos analíticos dirigidos convencionales (es decir, búsqueda de compuestos conocidos)30,31,32, utilizando métodos analíticos estándar, como espectrofotometría, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía iónica (IC), cromatografía de gases y espectrometría de masas en tándem (GC-MS / MS) o cromatografía líquida combinada. con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Con el desarrollo de técnicas de análisis instrumental, ha surgido el análisis metabolómico no dirigido basado en GC-TOF-MS, cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (LC-HR-MS) y resonancia magnética nuclear (RMN)33. En comparación con otros métodos analíticos convencionales de exudados radiculares, el análisis metabolómico no dirigido amplía en gran medida el número de exudados radiculares detectados, lo que facilita la comprensión profunda de las respuestas metabólicas de las plantas al estrés ambiental.

La técnica en el presente estudio tiene algunas limitaciones, especialmente en el análisis cuantitativo de metabolitos. El análisis metabolómico no dirigido solo demuestra las relaciones cuantitativas relativas entre diferentes metabolitos, en lugar de concentraciones precisas. Esto es desfavorable para las investigaciones sobre los comportamientos ambientales o los efectos ecológicos de los exudados de las raíces34. Para los medios de crecimiento de las plántulas de alfalfa, se realizaron experimentos de cultivo hidropónico en el estudio actual, que tienen las ventajas de un fácil control y una fácil operación. Sin embargo, el ambiente de crecimiento hidropónico artificial es diferente del ambiente real del suelo, lo que lleva a una posible subestimación de las tasas brutas de exudación debido a la recaptación de metabolitos por las raíces35. En comparación con el cultivo hidropónico, el cultivo de arena es un método relativamente más convincente porque está más cerca del ambiente real del suelo, facilitando la recolección de exudados radiculares en un ambiente realista36. Por lo tanto, se está trabajando para establecer un método de cultivo de arena o incluso cultivo real del suelo para que los resultados experimentales sean más convincentes, lo que nos ayudará a realizar una investigación más profunda, mostrando mejores resultados de importancia práctica para explicar la respuesta a la toxicidad.

Con base en el análisis metabólico no dirigido, no solo podemos explorar la respuesta metabólica de las plantas al estrés ambiental37, sino también determinar los metabolitos diferenciales e investigar más a fondo el importante papel de los metabolitos diferenciales en el comportamiento ambiental de los contaminantes38. Estudios previos han demostrado que el nivel de ácido pelargónico puede ser utilizado como un indicador de daño en la membrana radicular cuando las plantas están bajo estrés39. También se encontró que los ácidos grasos insaturados (ácido palmítico) aumentan la fluidez de la membrana40, lo que puede proteger las membranas de la raíz de alfalfa del daño del DEHP. Algunos flavonoides inhibidos por el DEHP pueden participar en la interacción entre leguminosas y microorganismos. Además, las interacciones entre las plantas y la comunidad biológica de la rizosfera pueden ser descifradas más profundamente con análisis metabólicos no dirigidos, especialmente bajo el estrés de contaminantes41. Se identificarán más tipos de exudados radiculares42 con el desarrollo de instrumentos analíticos para el análisis metabólico no dirigido, lo cual es útil para construir la huella metabolómica de los exudados de raíces de plantas43.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41877139), los Grandes Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41991335), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFD0800204), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (No. BK20161616), el Plan "135" y el Programa de Fronteras de la Academia China de Ciencias (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ciencias Ambientales Número 196
Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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