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收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对代谢物产生的影响

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

根系分泌物的分泌通常是植物在胁迫条件下的外部解毒策略。该协议描述了如何通过非靶向代谢组学分析 评估 异生素对苜蓿的影响。

Abstract

根系分泌物是植物根系与周围环境之间信息交流和能量传递的主要媒介。根系分泌物分泌物的变化通常是植物在胁迫条件下的外部解毒策略。该协议旨在引入收集苜蓿根系分泌物的一般指南，以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）对代谢物产生的影响。首先，在水培培养实验中在DEHP胁迫下生长苜蓿幼苗。其次，将植物转移到含有50mL灭菌超纯水的离心管中6小时以收集根系分泌物。然后将溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。冷冻样品用双（三甲基硅基））三氟乙酰胺（BSTFA）试剂提取并衍生化。随后，使用气相色谱系统与飞行时间质谱仪（GC-TOF-MS）测量衍生化提取物。然后基于生物信息学方法分析获得的代谢物数据。应深入探讨差异代谢产物和显著改变的代谢途径，以揭示DEHP对苜蓿根系分泌物的影响。

Introduction

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种合成化合物，广泛用于各种塑料和聚合物中作为增塑剂，以提高其可塑性和强度。在过去的几年中，越来越多的研究表明DEHP是一种内分泌干扰物，对人类和其他动物的呼吸，神经和生殖系统有不利影响1，2，3。考虑到其健康风险，美国环境保护署、欧盟和中国环境监测中心均已将DEHP列入重点污染物清单。由于施用了塑料覆盖和有机肥料、废水灌溉和污泥农场的应用，土壤被认为是DEHP在环境中的重要汇4。不出所料，DEHP在农田土壤中普遍存在，其含量甚至高达毫克/公斤干土在中国5，6。DEHP主要通过根部进入植物，并在土壤生态系统中经历不同营养水平的生物放大作用7。因此，近几十年来，人们对植物中DEHP引起的胁迫提出了重大关注。

植物通常容易受到DEHP暴露的影响。已经观察到DEHP胁迫对种子发芽和正常新陈代谢产生不利影响，从而抑制植物生长发育8，9。例如，DEHP可诱导叶肉细胞氧化损伤，降低叶绿素和渗透剂的含量，提高抗氧化酶活性，最终导致食用植物产量和品质下降10，11。然而，以往关于植物对DEHP胁迫响应的研究大多集中在氧化应激和生理生化特性上。与植物代谢相关的相应机制研究较少。根系分泌物是一个通用术语，描述植物根部分泌并释放到环境中的化合物。它们被认为是植物与根际土壤之间的相互作用介质，在支持植物生长发育方面发挥着重要作用12。众所周知，根系分泌物约占所有光合碳的30%-40%13。在污染环境中，根系分泌物通过新陈代谢或外部排斥来提高植物对污染物胁迫的耐受性14。因此，深入了解植物根系分泌物对污染胁迫的反应可能有助于揭示与细胞生物化学和生物现象相关的潜在机制15。

代谢组学技术提供了一种有效的策略，用于同时测量细胞16，17，组织18甚至生物体19的渗出物内的大量小分子代谢物，包括糖，有机酸，氨基酸和脂质。与传统或经典的化学分析方法相比，代谢组学方法大大增加了可检测的代谢物数量20，这有助于以更高通量的方式鉴定代谢物并鉴定关键代谢途径。代谢组学已广泛应用于胁迫环境下的生物反应研究领域，如重金属21、新兴污染物22和纳米颗粒19。这些关于植物的研究大多集中在植物内部组织的代谢变化上，而很少有关于根系分泌物对环境胁迫的响应的报道。因此，本研究的目的是引入收集苜蓿根系分泌物的一般指南，以研究DEHP对代谢物产生的影响。研究结果将为DEHP后续研究植物代谢组学提供方法指导。

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Protocol

该协议的目的是提供一个通用管道，从水培培养实验到代谢组学分析，量化DEHP对苜蓿根系分泌物的影响。

1. 水培培养实验

注意：该协议提供了苜蓿水培培养实验的示例，旨在在不同浓度的DEHP的压力下获得苜蓿（Medicago sativa）幼苗。设置三种处理：不添加任何成分的对照，并在营养液中加标1mg kg-1和10 mg kg-1的di（DEHP。根据土壤中DEHP的实际含量设定DEHP浓度23。每个处理有六个重复。

  1. 用0.1%次氯酸钠灭菌苜蓿种子10分钟，用75%乙醇消毒30分钟。
    1. 用蒸馏水冲洗灭菌的种子几次，然后在潮湿的滤纸上在无菌培养皿中在30°C的黑暗中发芽。
  2. 将20个均匀，发芽，丰满的大种子转移到装满营养液的培养瓶中的植入篮中，由（μM）组成：Ca（NO 3）2，3，500;NH 4 H2PO4， 1，000;KNO3， 6，000;镁硫4， 2，000;Na 2铁-乙二胺四乙酸， 75;H 3BO3， 46;锰硫4， 9.1;氧化锌4， 0.8;铜硫4， 0.3;和 （NH4 ）6Mo7O24， 0.02。使用0.1M KOH将溶液pH调节至7.0。每周更新所有解决方案。
  3. 将所有培养瓶置于光强度为150-180μmolm -2 s-1 的受控生长室中，光周期为每天16小时，分别在27°C和20°C代表白天（16小时）和夜晚（8小时）。
  4. 2周后，将15个均匀的苜蓿幼苗转移到新的玻璃瓶中，用于1mg kg-1和10mg kg-1 DEHP胁迫下的培养实验。用铝箔和封口膜包裹玻璃瓶，以防止DEHP的光解和挥发。要应用相同的条件，还要用铝箔和封口膜包裹控制瓶。每天补充营养液以维持液位。
  5. 每2天随机放置和旋转瓶子，以确保苜蓿幼苗的生长条件一致。
  6. 栽培7天后，从瓶中取出苜蓿幼苗，用超纯水洗涤数次，准备收集根系分泌物。

2. 根系渗出物的收集、提取和代谢组学分析

注意：本协议分为三部分：收集实验，提取实验和根分泌物的代谢组学分析。收集实验的目的是将植物样品中分泌的代谢物转移到溶液系统中进行后续提取。

  1. 收集实验
    1. 将 10 株均匀的苜蓿幼苗转移到装有 50 mL 灭菌去离子水的离心管中。将根浸入水中收集根系分泌物6小时;保持管子直立。每次处理至少进行六次重复。
    2. 用铝箔包裹离心管以保护根部免受光照。
    3. 取出植物并冷冻干燥收集的液体以进行代谢物分析。
  2. 提取实验
    1. 向试管中加入 1.8 mL 提取溶液（甲醇：H2O = 3：1，V/V）并涡旋 30 秒。
    2. 在冰水浴中将超声波施加到管子上10分钟。
    3. 将样品在4°C和11，000× g 下离心15分钟。
    4. 小心地将 200 μL 上清液转移到 1.5 mL 微量离心管中。从每个样品中取出 45 μL 上清液，并将其以 270 μL 的最终体积混合到质控 （QC） 样品中，用于校准样品的代谢组数据。
    5. 在真空浓缩器中冷冻干燥提取物。继续用 5 μL 内标（核糖核醇）干燥。
    6. 在真空浓缩器中蒸发后，向管中加入30μL甲氧基胺化盐酸盐（溶解在吡啶中，浓度为20mg mL-1），并将管在80°C孵育30分钟。然后，向样品中加入 40 μL 双（三甲基硅基）三氟乙酰胺 （BSTFA） 试剂（含 1% 三甲基氯硅烷 [TMC]，V/V），并将试管置于 70 °C 下 1.5 小时以进行衍生化。
    7. 将样品冷却至室温，并向QC样品中加入5 μL脂肪酸甲酯（FAME）（氯仿）。
  3. 代谢组学分析
    1. 将 1.0 μL 衍生化提取物注入与飞行时间质谱仪 （GC-TOF-MS） 偶联的气相色谱系统中，用于使用无分流模式进行代谢组学分析。
      1. 使用毛细管柱（30 m x 250 μm x 0.25 μm）分离根系分泌物，以氦气作为载气，流速为1.0 mL min-1。将进样温度设置为280°C，并将传输线温度和离子源温度分别保持在280°C和250°C。
      2. 对于分离，请使用以下烘箱程序：在50°C下等温加热1分钟，将10°C / min-1 烘箱斜坡加热至310°C，并在310°C下最终等温加热8分钟。
      3. 以-70 eV的能量执行电子碰撞模式。使用全扫描监测模式获得质谱，质量扫描范围为 50-500 m/z，速率为 12.5 谱图/秒。
    2. 滤除单个峰值以消除噪声。偏差值根据四分位数间距进行过滤。
    3. 用最小值的一半填充缺失值，对数据进行标准化和规范化。
    4. 将.csv格式的最终数据导入统计分析软件进行多元分析。
    5. 在京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库（用于了解生物系统的高级功能和效用的数据库资源）中查找代谢物，并将代谢物分为不同的类别，例如碳水化合物，酸，脂质，醇和胺。使用统计分析软件构建饼图，以指示每个类别在所有根系分泌物中的百分比。
    6. 将监督正交投影应用于潜在结构判别分析 （OPLS-DA） 以证明组之间的差异。
    7. 根据投影（VIP）的可变重要性（VIP）>1和 p <0.05（学生 t 检验）筛选显着改变的代谢物作为差异代谢物。
    8. 利用代谢组数据，利用统计分析软件构建热图，利用不同处理下的倍数变化构建直方图。
    9. 在KEGG数据库和Pubchem中查找差异代谢物，并编译包含差异代谢物的代谢途径。执行路径富集分析或拓扑分析。

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Representative Results

在该实验中，根据上述方法收集，提取和分析苜蓿根系分泌物（图1）。设置三个治疗组：对照组，低浓度DEHP（1mg L−1）和高浓度DEHP（10mg L-1）。

对照色谱共检出778个峰，其中314个代谢物可根据质谱鉴定。如图 2所示，这些代谢物根据相对丰度可分为六种类型：碳水化合物（28.6%），酸（15.58%），脂类（13.87%），醇类（3.91%），胺（0.92%）和其他（37.12%）。占小于0.5%的代谢物被归类为其他物质（图2A）。酸进一步细分为脂肪酸（56.09%）、氨基酸（26.62%）、有机酸（13.95%）和酚酸（3.34%）（图2B）。此外，大多数植物根系分泌物中的一些常见物质也可以在苜蓿根系分泌物中检测到，包括嘧啶类、羟基吡啶类、黄酮类、酚类、酮类、嘧啶类、黄酮类和二萜类。

根据VIP评分绘制热图以可视化不同DEHP处理中差异代谢物的变化（图3）。与对照相比，DEHP暴露显著改变了苜蓿根系分泌物中50种代谢物的含量，主要包括部分碳水化合物和低分子量有机酸。在DEHP存在下，五种类型的碳水化合物（lyxose，洋地黄糖，赤藓糖，海藻糖和果糖2，6-二甲酸酯）上调，其中两种（lyxose和Digitoxose）随着DEHP浓度的增加而显着增加。此外，在DEHP存在下调了五种代谢物，包括单糖如D-塔糖和葡萄糖，二糖如麦芽糖、纤维二糖和海藻糖，以及糖醇如D-阿拉伯糖醇。碳水化合物含量被认为是植物生理状态的指标24。因此，本文中单糖和二糖水平的降低表明由DEHP应激引起的生理应激。与碳水化合物相比，DEHP对苜蓿幼苗酸代谢的影响更大。在DEHP暴露下，11种酸代谢物含量显著增加，主要包括2-氨基-2-降冰片烷羧酸、5-羟基吲哚-2-羧酸、3-羟基-L-脯氨酸、天竺葵酸和棕榈酸。同时，DEHP还抑制了苜蓿幼苗中一些黄酮类化合物的代谢，包括4'，5-二羟甲基-7-甲氧基异黄酮和新橙皮苷。

受DEHP影响的代谢途径如图 4所示。DEHP显着抑制碳水化合物的代谢，如一些单糖和双糖，它们是光合作用的产物。因此，DEHP可以在一定程度上抑制苜蓿的光合作用。而且，DEHP可以促进脂肪酸的代谢，有助于植物抵抗DEHP的压力。DEHP影响的主要代谢途径是碳水化合物代谢和脂肪酸代谢，而氨基酸代谢、脂质代谢和三羧酸（TCA）循环受到的影响程度较小。

Figure 1
图1：苜蓿根系分泌物非靶向代谢组学分析流程图。 BSTFA代表双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）试剂（含1%三甲基氯硅烷[TMC]，V/V）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：代谢物的分类 。 （A）已知代谢物和（B）酸的分类。将每种材料的百分比除以各类别的峰面积之和除以对照中所有物质的峰面积之和。其他物质为<0.5%。其他酸为<0.5%。这个数字是从Wang等人25修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：不同DEHP处理的苜蓿幼苗根系分泌物（VIP > 1， p < 0.05）分层聚类分析热图。 红色和绿色分别代表高丰度和低丰度。ACK 表示控件;1 + AD代表用1mg L−1 DEHP治疗;10 + AD代表用10mg L−1 DEHP处理。这个数字是从Wang等人25修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：代谢途径紊乱与生物终点改变之间的关系（1 mg L− 1 DEHP，10 mg L−1 DEHP）。 代谢途径是根据京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库建立的。绿色文本中的代谢物是本工作中检测到的代谢物。括号中的“红框”和“蓝框”符号分别表示代谢物对生物终点的贡献增加（p < 0.05）或减少（p < 0.05）。通过将代谢物大致分离为碳水化合物、脂肪酸和蛋白质代谢，该图已变得可读，如绿色、红色和黑色矩形框分别所示。ACK 表示控件;1 + AD代表用1mg L−1 DEHP治疗;10 + AD代表用10mg L−1 DEHP处理。这个数字是从Wang等人25修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

该协议提供了有关如何在DEHP胁迫下收集和测量苜蓿根系分泌物以及如何分析代谢组数据的一般指导。需要密切关注该协议中的一些关键步骤。在水培培养实验中，将苜蓿幼苗在装有不同浓度DEHP营养液的玻璃瓶中水培。在整个培养过程中，玻璃瓶应用铝箔覆盖，以防止玻璃瓶光解并确保所有培养溶液中DEHP浓度的均匀性25，26。DEHP 浓度设定为 1 mg L-1 和 10 mg L-1，根据通常在被DEHP 27，28 污染的土壤中发现的浓度。在收集根系分泌物的过程中，离心管仍然需要用铝箔包裹，以保护根部免受光照。在这里，收集时间设置为6小时。如果收集时间太短，一些低丰度根系分泌物的浓度可能太低而无法检测到，因此根系分泌物的组成可能无法反映DEHP胁迫下苜蓿幼苗的真实响应。如果收集时间过长，收集的根系分泌物可能会被培养系统中的微生物降解到一定程度。在这种情况下，还可以检测到一些微生物代谢物，从而改变根分泌物29的组成。此外，每种处理应至少进行六次重复，以确保准确的代谢组数据分析。

只有某些类型的根系分泌物，如氨基酸、脂肪酸、酚类化合物和其他有机酸，可以使用常规靶向分析方法（即搜索已知化合物）30，31，32，使用标准分析方法，如分光光度法、高压液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）或液相色谱联合法使用串联质谱法 （LC-MS/MS）。随着仪器分析技术的发展，出现了基于GC-TOF-MS、液相色谱-高分辨率质谱（LC-HR-MS）和核磁共振（NMR）的非靶向代谢组学分析33。与其他常规的根系分泌物分析方法相比，非靶向代谢组学分析大大扩展了根系分泌物的检测数量，有助于深入了解植物对环境胁迫的代谢响应。

目前研究中的技术有一些局限性，特别是在代谢物的定量分析中。非靶向代谢组学分析仅显示不同代谢物之间的相对定量关系，而不是准确的浓度。这不利于研究根系分泌物的环境行为或生态效应34。针对苜蓿幼苗的生长培养基，本研究进行了水培培养实验，具有易于控制、易操作等优点。然而，人工水培生长环境与实际土壤环境不同，导致可能低估了根系35代谢物再吸收引起的总渗出率。与水培相比，沙培是一种相对更具说服力的方法，因为它更接近真实的土壤环境，便于在现实环境中收集根系分泌物36。因此，正在建立一种沙子培养甚至真实土壤培养的方法，以使实验结果更具说服力，这将有助于我们进行更深入的研究，显示出更好的结果，对解释毒性反应具有实际意义。

基于非靶向代谢分析，我们不仅可以探索植物对环境胁迫的代谢响应37，还可以确定差异代谢物，并进一步研究差异代谢物在污染物环境行为中的重要作用38。先前的研究表明，当植物处于胁迫下时，天竺葵酸水平可以用作根膜损伤的指标39。还发现不饱和脂肪酸（棕榈酸）可以增加膜流动性40，这可以保护苜蓿根膜免受DEHP损伤。一些被DEHP抑制的黄酮类化合物可以参与豆类和微生物之间的相互作用。此外，植物与根际生物群落之间的相互作用可以通过非靶向代谢分析更深入地破译，特别是在污染物的压力下41。随着非靶向代谢分析仪器的发展，将鉴定出更多类型的根系分泌物42 ，这有助于构建植物根系分泌物的代谢组学指纹图谱43。

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Disclosures

作者声明，他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些利益或个人关系似乎会影响本文中报告的工作。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金（41877139）、国家自然科学基金重大项目（41991335）、国家重点研发计划（2016YFD0800204）、江苏省自然科学基金（编号：BK20161616）、“135”计划、中国科学院前沿计划（ISSASIP1615）的联合支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

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环境科学，第196期，
收集苜蓿根系分泌物以研究邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯对代谢物产生的影响
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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