Summary
Utsöndringen av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll beskriver hur man bedömer effekterna av xenobiotika på alfalfa via icke-riktad metabolomisk analys.
Abstract
Rotutsöndringar är det viktigaste mediet för informationskommunikation och energiöverföring mellan växtrötter och den omgivande miljön. Förändringen i utsöndring av rotutsöndringar är vanligtvis en extern avgiftningsstrategi för växter under stressförhållanden. Detta protokoll syftar till att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfarotexadat för att studera effekterna av di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) på metabolitproduktionen. Först odlas alfalfa plantor under DEHP-stress i ett hydroponiskt odlingsexperiment. För det andra överförs växterna till centrifugrör innehållande 50 ml steriliserat ultrarent vatten i 6 timmar för att samla rotutsöndringar. Lösningarna frystorkas sedan i en vakuumfrystork. De frysta proverna extraheras och derivatiseras med bis(trimetylsilyl)) trifluororacetamid (BSTFA)-reagens. Därefter mäts de derivatiserade extrakten med användning av ett gaskromatografsystem kopplat till en masspektrometer (GC-TOF-MS). De förvärvade metabolitdata analyseras sedan baserat på bioinformatiska metoder. Differentiella metaboliter och signifikant förändrade metabolismvägar bör undersökas djupt för att avslöja effekten av DEHP på alfalfa med tanke på rotutsöndringar.
Introduction
Di (2-etylhexyl) ftalat (DEHP) är en syntetisk kemisk förening som ofta används i olika plaster och polymerer som mjukgörare för att förbättra deras plasticitet och styrka. Under de senaste åren har ett ökande antal studier föreslagit att DEHP är ett hormonstörande ämne och har negativa effekter på andnings-, nerv- och reproduktionssystemen hos människor och andra djur 1,2,3. Med tanke på dess hälsorisk har USA: s miljöskyddsbyrå, Europeiska unionen och Environmental Monitoring Center of China alla klassificerat DEHP i listan över prioriterade föroreningar. Jord har ansetts vara en viktig sänka för DEHP i miljön på grund av applicering av plastmassning och organiska gödningsmedel, bevattning med avloppsvatten och applicering av slamgård4. Som förväntat har DEHP upptäckts överallt i jordbruksmark, vars innehåll till och med når upp till milligram per kilo torkad jord i vissa regioner i Kina 5,6. DEHP kan komma in i växter huvudsakligen via rötterna och genomgå biomagnifiering på olika trofiska nivåer i markekosystem7. Därför har betydande oro väckts om DEHP-inducerad stress i växter under de senaste decennierna.
Växter är vanligtvis sårbara för DEHP-exponering. DEHP-stress har observerats utöva en negativ effekt på frögroning och normal metabolism, vilket hämmar växttillväxt och utveckling 8,9. Till exempel kan DEHP inducera oxidativ skada på mesofyllceller, minska innehållet i klorofyll och osmolyter och höja antioxidativa enzymaktiviteter, vilket så småningom resulterar i en minskning av utbytet och kvaliteten på ätbara växter10,11. De flesta av de tidigare studierna om växternas svar på DEHP-stress har dock fokuserat på oxidativ stress och fysiologiska och biokemiska egenskaper. Motsvarande mekanismer associerade med växtmetabolism är mindre studerade. Rotutsöndringar är en generisk term som beskriver föreningar som växtrötter utsöndrar och släpper ut i miljön. De har betraktats som interaktionsmedia mellan växter och rhizosfärjord och spelar en viktig roll för att stödja växttillväxt och utveckling12. Det har varit välkänt att rotutsöndringar står för cirka 30% -40% av allt fotosyntetiskt kol13. I förorenade miljöer är rotutsöndringar involverade i att förbättra växternas tolerans mot föroreningarnas stress genom metabolism eller extern uteslutning14. Som en konsekvens kan en djup förståelse av svaret från växtrotutsöndringar på föroreningsstress hjälpa till att avslöja de underliggande mekanismerna i samband med cellbiokemi och biologiska fenomen15.
Metabolomikteknik ger en effektiv strategi för att mäta ett stort antal småmolekylära metaboliter samtidigt i cellerna 16,17, vävnader18 och till och med utsöndringar av organismer 19, inklusive sockerarter, organiska syror, aminosyror och lipider. Jämfört med traditionella eller klassiska kemiska analysmetoder ökar metabolomikmetoden kraftigt antalet metaboliter som kan detekteras20, vilket kan hjälpa till att identifiera metaboliter på ett högre genomströmningssätt och identifiera viktiga metaboliska vägar. Metabolomik har använts i stor utsträckning inom forskningsområdet biologisk respons i stressmiljöer, såsom tungmetaller21, nya föroreningar22 och nanopartiklar19. De flesta av dessa studier på växter har fokuserat på de metaboliska förändringarna i inre växtvävnader, medan få har rapporterats om rotutsöndringarnas svar på miljöstress. Därför är syftet med denna studie att införa allmänna riktlinjer för insamling av alfalfa rotutsöndringar för att studera effekterna av DEHP på metabolitproduktionen. Resultaten kommer att ge en metodvägledning för uppföljningsstudien av växtmetabolomik med DEHP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en allmän pipeline, från ett hydroponiskt odlingsexperiment till metabolomisk analys, kvantifiera effekten av DEHP på alfalfarotutsöndringar.
1. Hydroponiskt odlingsexperiment
OBS: Detta protokoll presenterar ett exempel på ett alfalfa hydroponiskt odlingsexperiment utformat för att erhålla alfalfa (Medicago sativa) plantor under stress av olika koncentrationer av DEHP. Tre behandlingar inrättades: kontrollen utan några tillsatser, och näringslösningen spetsad med 1 mg kg-1 och 10 mg kg-1 av di (DEHP. Koncentrationerna av DEHP fastställdes i enlighet med det verkliga innehållet av DEHP i jord23. Varje behandling hade sex replikat.
- Sterilisera alfalfa frön med 0,1% natriumhypoklorit i 10 min och 75% etylalkohol i 30 min.
- Skölj de steriliserade fröna flera gånger med destillerat vatten och gro sedan på fuktigt filterpapper i en steril petriskål vid 30 °C i mörkret.
- Överför 20 enhetliga, grodda, fylliga frön till en graveringskorg i en odlingsflaska fylld med näringslösning, bestående av (i μM): Ca(NO 3)2, 3,500; NH4H2PO4, 1,000; KNO3, 6,000; MgSO4, 2,000; Na2Fe-etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 75; H3BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; och (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Justera lösningens pH till 7,0 med 0,1 M KOH. Förnya alla lösningar varje vecka.
- Placera alla odlingsflaskor i en kontrollerad tillväxtkammare med en ljusintensitet på 150-180 μmol m-2 s-1 med en fotoperiod på 16 timmar varje dag, vid 27 °C och 20 °C som representerar dag (16 timmar) respektive natt (8 timmar).
- Överför 15 enhetliga alfalfa plantor till en ny glasflaska för odlingsexperiment under 1 mg kg-1 och 10 mg kg-1 DEHP stress efter 2 veckor. Förpacka glasflaskorna med aluminiumfolie och parafilm för att förhindra fotolys och förångning av DEHP. För att tillämpa samma villkor, linda också kontrollflaskorna med aluminiumfolie och parafilm. Komplettera näringslösningen dagligen för att bibehålla vätskenivån.
- Placera och rotera flaskorna slumpmässigt var 2: e dag för att säkerställa konsekventa tillväxtförhållanden för alfalfaplantorna.
- Efter 7 dagars odling, ta bort alfalfaplantorna från flaskorna och tvätta med ultrarent vatten flera gånger och förbered dig för insamling av rotutsöndringar.
2. Insamling, extraktion och metabolomisk analys av rotutsöndringar
OBS: Detta protokoll är uppdelat i tre delar: ett samlingsexperiment, ett extraktionsexperiment och metabolomisk analys av rotutsöndringarna. Målet med insamlingsexperimentet är att överföra metaboliterna som utsöndras i växtprover till lösningssystemet för efterföljande extraktion.
- Insamling experiment
- Överför 10 enhetliga alfalfa plantor till centrifugrör fyllda med 50 ml steriliserat avjoniserat vatten. Sänk ner rötterna i vatten för att samla rotutsöndringar i 6 timmar; Håll rören upprätt. Utför minst sex replikat för varje behandling.
- Vik centrifugrören med aluminiumfolie för att skydda rötterna från ljus.
- Ta bort växterna och frystorka den uppsamlade vätskan för metabolitprofilering.
- Extraktionsexperiment
- Tillsätt 1,8 ml extraktionslösning (metanol:H2O= 3: 1, V / V) till rören och virveln i 30 s.
- Applicera ultraljudsvågor på rören i 10 minuter i ett isvattenbad.
- Centrifugera proverna vid 4 °C och 11 000 × g i 15 minuter.
- Överför försiktigt 200 μl supernatant till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Ta 45 μl supernatant från varje prov och blanda det i kvalitetskontrollprover (QC) vid en slutlig volym på 270 μl, som används för kalibrering av metabolomdata för prover.
- Frystorka extrakten i en vakuumkoncentrator. Fortsätt torkningen med 5 μL av den interna standarden (ribonukleol).
- Efter indunstning i vakuumkoncentrator, tillsätt 30 μl metoxiamineringshydroklorid (upplöst i pyridin i en koncentration av 20 mg ml-1) till rören och inkubera rören vid 80 °C i 30 minuter. Tillsätt sedan 40 μL bis(trimetylsilyl)trifluororacetamid (BSTFA)reagens (med 1 % trimetylklorsilan [TMC], V/V) till proverna och placera rören vid 70 °C i 1,5 timmar för derivatisering.
- Kyl proverna till rumstemperatur och tillsätt 5 μL fettsyrametylestrar (FAME) (i kloroform) till QC-proverna.
- Metabolomisk analys
- Injicera 1,0 μl av de derivatiserade extrakten i ett gaskromatografsystem kopplat till en masspektrometer (GC-TOF-MS) för metabolomisk profileringsanalys i splittlöst läge.
- Använd en kapillärkolonn (30 m x 250 μm x 0,25 μm) för separation av rotutsöndringar, med helium som bärgas med en flödeshastighet av 1,0 ml min-1. Ställ in insprutningstemperaturen på 280 °C och håll överföringsledningens temperatur och jonkällans temperatur på 280 °C respektive 250 °C.
- För separation, använd följande ugnsprogram: 1 min isotermisk uppvärmning vid 50 °C, en 10 °C/min-1 ugnsramp till 310 °C och en slutlig isotermisk uppvärmning vid 310 °C i 8 min.
- Utför elektronkollisionsläge med -70 eV energi. Erhåll masspektra med hjälp av fullskanningsövervakningsläge med ett massskanningsområde på 50-500 m / z med en hastighet av 12,5 spektra / s.
- Filtrera enskilda toppar för att ta bort brus. Avvikelsevärdet filtreras baserat på interkvartilområdet.
- Fyll de saknade värdena med hälften av minimivärdena, standardisera och normalisera data.
- Importera slutliga data i .csv format till statistisk analysprogramvara för multivariat analys.
- Slå upp metaboliterna i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databas (en databasresurs för att förstå funktioner och verktyg på hög nivå i det biologiska systemet) och klassificera metaboliterna i olika kategorier, såsom kolhydrater, syror, lipider, alkoholer och aminer. Använd statistisk analysprogramvara för att konstruera ett cirkeldiagram för att ange procentandelen av varje kategori i alla rotutsöndringar.
- Applicera övervakade ortogonala projektioner på latent struktur-diskriminerande analys (OPLS-DA) för att visa skillnaderna mellan grupper.
- Screena signifikant förändrade metaboliter som differentiella metaboliter baserat på en variabel betydelse i projektion (VIP) > 1 och p < 0,05 (Students t-test ).
- Använd metabolomdata för att konstruera värmekartor med programvaran för statistisk analys och använd vikningsförändringarna under olika behandlingar för att konstruera histogram.
- Slå upp differentialmetaboliterna i KEGG-databasen och Pubchem och sammanställ de metaboliska vägarna som innehåller differentialmetaboliterna. Utför väganrikningsanalys eller topologianalys.
- Injicera 1,0 μl av de derivatiserade extrakten i ett gaskromatografsystem kopplat till en masspektrometer (GC-TOF-MS) för metabolomisk profileringsanalys i splittlöst läge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta experiment samlades alfalfa rotutsöndringar, extraherades och analyserades enligt ovanstående metoder (figur 1). Tre behandlingsgrupper inrättades: kontroll, låg koncentration av DEHP (1 mg L−1) och hög koncentration av DEHP (10 mg L−1).
Totalt 778 toppar detekterades i kontrollens kromatograf, varav 314 metaboliter kunde identifieras enligt masspektra. Som visas i figur 2 kan dessa metaboliter klassificeras i sex typer baserat på den relativa förekomsten: kolhydrater (28,6%), syror (15,58%), lipider (13,87%), alkoholer (3,91%), aminer (0,92%) och andra (37,12%). Metaboliter som stod för mindre än 0,5 % grupperades som andra substanser (figur 2A). Syrorna delades vidare in i fettsyror (56,09%), aminosyror (26,62%), organiska syror (13,95%) och fenolsyror (3,34%) (figur 2B). Dessutom kan vissa vanliga ämnen i rotutsöndringarna hos de flesta växter också detekteras i alfalfa rotutsöndringar, inklusive pyrimidiner, hydroxipyridiner, flavonoider, fenoler, ketoner, pyrimidiner, flavonoider och diterpener.
En värmekarta ritades för att visualisera variationen i differentiella metaboliter mellan olika DEHP-behandlingar, baserat på VIP-poängen (figur 3). Jämfört med kontrollen förändrade exponeringen för DEHP signifikant innehållet av 50 metaboliter i alfalfarotutsöndringar, huvudsakligen inklusive vissa kolhydrater och organiska syror med låg molekylvikt. Fem typer av kolhydrater (lyxos, digitoxos, erytros, trehalos och fruktos 2, 6-bihosfat) uppreglerades i närvaro av DEHP, och två av dessa (lyxos och digitoxos) ökade signifikant när koncentrationen av DEHP ökade. Dessutom nedreglerades fem metaboliter i närvaro av DEHP, inklusive monosackarider såsom D-talose och glukos, disackarider såsom maltos, cellobios och trehalos och sockeralkoholer såsom D-arabitol. Kolhydratinnehåll har ansetts vara en indikator på växtfysiologisk status24. Därför indikerade minskningen av monosackarid- och disackaridnivåer här fysiologisk stress orsakad av DEHP-stress. Jämfört med kolhydrater utövade DEHP en större effekt på syrametabolismen i alfalfaplantor. Vid exponering för DEHP ökade innehållet av 11 syrametaboliter signifikant, huvudsakligen inklusive 2-amino-2-norbornankarboxylsyra, 5-hydroxiindol-2-karboxylsyra, 3-hydroxi-L-prolin, pelargonsyra och palmitinsyra. Samtidigt hämmade DEHP också metabolismen av vissa flavonoider i alfalfaplantor, inklusive 4', 5-dihyrroxi-7-metoxiisoflavon och neohesperidin.
De metaboliska vägar som påverkas av DEHP beskrivs i figur 4. DEHP hämmade signifikant metabolismen av kolhydrater, såsom vissa monosackarider och disackarider, som är produkter av fotosyntes. Därför kan DEHP undertrycka fotosyntesen av alfalfa i viss utsträckning. Dessutom kan DEHP främja metabolismen av fettsyror, vilket är till hjälp för växter att motstå stress från DEHP. De viktigaste metaboliska vägarna som påverkades av DEHP var kolhydratmetabolism och fettsyrametabolism, medan aminosyrametabolism, lipidmetabolism och trikarboxylsyracykeln (TCA) påverkades i mycket mindre utsträckning.
Figur 1: Ett flödesschema över icke-riktad metabolomisk analys för alfalfarotexsudat. BSTFA representerar bis(trimetylsilyl)trifluororacetamid (BSTFA)-reagens (med 1% trimetylklorsilan [TMC], V/V). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Klassificering av metaboliter. a) Klassificering av kända metaboliter och B) syror. Procentandelen av varje typ av material divideras med summan av topparean för varje kategori med summan av topparean för alla ämnen i kontrollen. Andra ämnen var de på <0,5%. Andra syror var de på <0,5%. Denna siffra har modifierats från Wang et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Värmekarta över hierarkisk klustringsanalys för rotutsöndringar (VIP > 1, p < 0,05) av alfalfaplantor med olika DEHP-behandlingar. Rött och grönt representerar hög respektive låg överflöd. ACK representerar kontrollen; 1+AD representerar behandlingen med 1 mg L−1 DEHP; 10+AD representerar behandlingen med 10 mg L−1 DEHP. Denna siffra har modifierats från Wang et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Samband mellan störning av metaboliska vägar och förändringar i biologiska effektmått (1 mg L−1 DEHP, 10 mg L−1 DEHP). De metaboliska vägarna fastställdes baserat på Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databas. Metaboliterna i grön text var de metaboliter som detekterades i det aktuella arbetet. Tecknen "röda rutor" och "blå rutor" inom parentes indikerar att metaboliterna ökade (p < 0,05) respektive minskade (p < 0,05) bidrag till de biologiska effektmåtten. Figuren har gjorts läsbar genom att separera metaboliterna grovt i kolhydrat-, fettsyra- och proteinmetabolism, vilket visas av de gröna, röda respektive svarta rektangulära rutorna. ACK representerar kontrollen; 1+AD representerar behandlingen med 1 mg L−1 DEHP; 10+AD representerar behandlingen med 10 mg L−1 DEHP. Denna siffra har modifierats från Wang et al.25. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger allmän vägledning om hur man samlar in och mäter rotutsöndringarna av alfalfa under DEHP-stress, samt hur man analyserar metabolomdata. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt några kritiska steg i detta protokoll. I hydroponiska odlingsexperiment odlades alfalfa plantor hydroponiskt i glasflaskor fyllda med näringslösningar med olika koncentrationer av DEHP. Glasflaskorna bör skyddas mot ljus genom att täcka dem med aluminiumfolie under hela odlingsperioden för att förhindra DEHP från fotolys och säkerställa enhetligheten i DEHP-koncentrationerna i alla odlingslösningar25,26. DEHP-koncentrationerna fastställdes till 1 mg L-1 och 10 mg L-1, enligt de koncentrationer som vanligtvis finns i jordar förorenade med DEHP27,28. Under insamlingen av rotutsöndringar måste centrifugrören fortfarande lindas med aluminiumfolie för att skydda rötterna från ljus. Här var insamlingstiden satt till 6 timmar. Om insamlingstiden är för kort kan koncentrationen av vissa rotutsöndringar med låg förekomst vara för låg för att detekteras, så sammansättningen av rotutsöndringarna kanske inte återspeglar det verkliga svaret från alfalfaplantor under DEHP-stress. Om insamlingstiden är för lång kan de insamlade rotutsöndringarna i viss utsträckning brytas ned av mikrober i odlingssystemen. I detta fall kan vissa mikrobiella metaboliter också detekteras, vilket ändrar sammansättningen av rotutsöndringarna29. Dessutom bör minst sex replikat utföras för varje behandling för att säkerställa korrekt analys av metabolomdata.
Endast vissa typer av rotutsöndringar, såsom aminosyror, fettsyror, fenolföreningar och andra organiska syror, kan bestämmas med konventionella riktade analysmetoder (dvs. sökning efter kända föreningar)30,31,32, med hjälp av standardanalysmetoder, såsom spektrofotometri, högtrycksvätskekromatografi (HPLC), jonkromatografi (IC), gaskromatografi-tandemmasspektrometri (GC-MS / MS) eller vätskekromatografi kombinerad med tandemmasspektrometri (LC-MS/MS). Med utvecklingen av instrumentanalystekniker har icke-riktad metabolomisk analys uppstått baserat på GC-TOF-MS, vätskekromatografi-högupplöst masspektrometri (LC-HR-MS) och kärnmagnetisk resonans (NMR)33. Jämfört med andra konventionella analysmetoder för rotutsöndringar expanderar icke-riktad metabolomisk analys kraftigt antalet detekterade rotutsöndringar, vilket underlättar djup förståelse av växtmetaboliska svar på miljöstress.
Tekniken i den aktuella studien har vissa begränsningar, särskilt i den kvantitativa analysen av metaboliter. Icke-riktad metabolomisk analys visar endast de relativa kvantitativa relationerna mellan olika metaboliter, snarare än exakta koncentrationer. Detta är ogynnsamt för undersökningar av miljöbeteenden eller ekologiska effekter av rotutsöndringar34. För tillväxtmedia av alfalfa plantor utfördes hydroponiska odlingsexperiment i den aktuella studien, som har fördelarna med enkel kontroll och enkel användning. Den artificiella hydroponiska tillväxtmiljön skiljer sig emellertid från den verkliga markmiljön, vilket leder till möjlig underskattning av bruttoutsöndringshastigheterna på grund av metabolitåterupptag av rötter35. Jämfört med hydroponisk kultur är sandkultur en relativt mer övertygande metod eftersom den ligger närmare den verkliga markmiljön, vilket underlättar insamlingen av rotutsöndringar i en realistisk miljö36. Därför pågår arbete för att etablera en metod för sandodling eller till och med verklig jordkultur för att göra de experimentella resultaten mer övertygande, vilket kommer att hjälpa oss att genomföra mer djupgående forskning och visa bättre resultat av praktisk betydelse för att förklara toxicitetsresponsen.
Baserat på den icke-riktade metaboliska analysen kan vi inte bara utforska växternas metaboliska respons på miljöstress37, utan också bestämma differentiella metaboliter och ytterligare undersöka den viktiga rollen för differentialmetaboliterna i miljöbeteendet hos föroreningar38. Tidigare studier har visat att pelargonsyranivån kan användas som en indikator på rotmembranskador när växter är stressade39. Omättade fettsyror (palmitinsyra) visade sig också öka membranfluiditeten40, vilket kan skydda alfalfarotmembran från DEHP-skador. Vissa flavonoider hämmade av DEHP kan delta i interaktionen mellan baljväxter och mikroorganismer. Dessutom kan interaktionerna mellan växter och det rhizosfäriska biologiska samhället dechiffreras djupare med icke-riktad metabolisk analys, särskilt under stress av föroreningar41. Fler typer av rotutsöndringar kommer att identifieras42 med utvecklingen av analytiska instrument för icke-riktad metabolisk analys, vilket är till hjälp för att konstruera metabolomisk fingeravtryck av växtrotutsöndringar43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kan ha tyckts påverka det arbete som rapporteras i denna uppsats.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes gemensamt av National Natural Science Foundation of China (41877139), de stora projekten från National Natural Science Foundation of China (41991335), Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2016YFD0800204), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (nr BK20161616), "135" -planen och Frontiers-programmet för den kinesiska vetenskapsakademin (ISSASIP1615).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L.
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E.
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L.
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
