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Raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del di(2-etilesil) ftalato sulla produzione di metaboliti

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

La secrezione di essudati radicali è di solito una strategia di disintossicazione esterna per le piante in condizioni di stress. Questo protocollo descrive come valutare l'impatto degli xenobiotici sull'erba medica attraverso un'analisi metabolomica non mirata.

Abstract

Gli essudati radicali sono i principali mezzi di comunicazione delle informazioni e di trasferimento di energia tra le radici delle piante e l'ambiente circostante. Il cambiamento nella secrezione degli essudati radicali è di solito una strategia di disintossicazione esterna per le piante in condizioni di stress. Questo protocollo mira a introdurre linee guida generali per la raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del bis (2-etilesil) ftalato (DEHP) sulla produzione di metaboliti. In primo luogo, le piantine di erba medica vengono coltivate sotto stress DEHP in un esperimento di coltura idroponica. In secondo luogo, le piante vengono trasferite in provette da centrifuga contenenti 50 ml di acqua ultrapura sterilizzata per 6 ore per raccogliere gli essudati radicali. Le soluzioni vengono quindi liofilizzate in un liofilizzatore sottovuoto. I campioni congelati vengono estratti e derivati con il reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetammide (BSTFA). Successivamente, gli estratti derivati vengono misurati utilizzando un sistema gascromatografico accoppiato con uno spettrometro di massa a tempo di volo (GC-TOF-MS). I dati dei metaboliti acquisiti vengono quindi analizzati sulla base di metodi bioinformatici. I metaboliti differenziali e le vie metaboliche significativamente modificate dovrebbero essere esplorati a fondo per rivelare l'impatto del DEHP sull'erba medica in vista degli essudati radicali.

Introduction

Il di(2-etilesil) ftalato (DEHP) è un composto chimico sintetico ampiamente utilizzato in varie materie plastiche e polimeri come plastificante per migliorarne la plasticità e la resistenza. Negli ultimi anni, un numero crescente di studi ha suggerito che il DEHP è un interferente endocrino e ha effetti negativi sui sistemi respiratorio, nervoso e riproduttivo dell'uomo e di altri animali 1,2,3. Considerando il suo rischio per la salute, l'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti, l'Unione europea e il Centro di monitoraggio ambientale della Cina hanno tutti classificato il DEHP nell'elenco degli inquinanti prioritari. Il suolo è stato considerato un importante pozzo di DEHP nell'ambiente, a causa dell'applicazione di pacciamatura plastica e fertilizzanti organici, irrigazione con acque reflue e applicazione di fanghi agricoli4. Come previsto, il DEHP è stato rilevato ovunque nei terreni agricoli, il cui contenuto raggiunge anche i milligrammi per chilogrammo di terreno essiccato in alcune regioni della Cina 5,6. Il DEHP può penetrare nelle piante principalmente attraverso le radici e subire biomagnificazione a diversi livelli trofici negli ecosistemi del suolo7. Pertanto, negli ultimi decenni è stata sollevata una notevole preoccupazione per lo stress indotto dal DEHP nelle piante.

Le piante sono solitamente vulnerabili all'esposizione al DEHP. È stato osservato che lo stress del DEHP esercita un effetto negativo sulla germinazione dei semi e sul normale metabolismo, inibendo così la crescita e lo sviluppo delle piante 8,9. Ad esempio, il DEHP può indurre danni ossidativi alle cellule mesofille, diminuire il contenuto di clorofilla e osmoliti ed elevare le attività degli enzimi antiossidanti, con conseguente declino della resa e della qualità delle piante commestibili10,11. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti sulla risposta delle piante allo stress DEHP si sono concentrati sullo stress ossidativo e sulle caratteristiche fisiologiche e biochimiche. I meccanismi corrispondenti associati al metabolismo delle piante sono meno studiati. Gli essudati radicali sono un termine generico che descrive i composti che le radici delle piante secernono e rilasciano nell'ambiente. Sono stati considerati come il mezzo di interazione tra le piante e il suolo della rizosfera, svolgendo un ruolo importante nel sostenere la crescita e lo sviluppo delle piante12. È noto che gli essudati radicali rappresentano circa il 30% -40% di tutto il carbonio fotosintetico13. In ambienti inquinati, gli essudati radicali sono coinvolti nel miglioramento della tolleranza delle piante allo stress degli inquinanti attraverso il metabolismo o l'esclusione esterna14. Di conseguenza, una profonda comprensione della risposta degli essudati delle radici delle piante allo stress da inquinamento può aiutare a rivelare i meccanismi sottostanti associati alla biochimica cellulare e ai fenomeni biologici15.

La tecnologia metabolomica fornisce una strategia efficiente per misurare un gran numero di metaboliti di piccole molecole contemporaneamente all'interno delle cellule 16,17, dei tessuti18 e persino degli essudati degli organismi 19, inclusi zuccheri, acidi organici, amminoacidi e lipidi. Rispetto ai metodi di analisi chimica tradizionali o classici, l'approccio metabolomico aumenta notevolmente il numero di metaboliti che possono essere rilevati20, il che può aiutare a identificare i metaboliti in modo più elevato e identificare le vie metaboliche chiave. La metabolomica è stata ampiamente utilizzata nel campo di ricerca della risposta biologica in ambienti stressati, come metalli pesanti21, inquinanti emergenti22 e nanoparticelle19. La maggior parte di questi studi sulle piante si sono concentrati sui cambiamenti metabolici nei tessuti vegetali interni, mentre pochi sono stati riportati sulla risposta degli essudati radicali allo stress ambientale. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di introdurre linee guida generali per la raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del DEHP sulla produzione di metaboliti. I risultati forniranno una guida metodologica per lo studio di follow-up della metabolomica vegetale da parte del DEHP.

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Protocol

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una pipeline generale, da un esperimento di coltura idroponica all'analisi metabolomica, quantificando l'effetto del DEHP sugli essudati delle radici di erba medica.

1. Esperimento di coltura idroponica

NOTA: Questo protocollo presenta un esempio di un esperimento di coltura idroponica di erba medica progettato per ottenere piantine di erba medica (Medicago sativa) sotto lo stress di diverse concentrazioni di DEHP. Sono stati istituiti tre trattamenti: il controllo senza alcuna aggiunta e la soluzione nutritiva con 1 mg kg-1 e 10 mg kg-1 di di(DEHP. Le concentrazioni di DEHP sono state fissate in base al contenuto reale di DEHP nel suolo23. Ogni trattamento aveva sei repliche.

  1. Sterilizzare i semi di erba medica con ipoclorito di sodio allo 0,1% per 10 minuti e alcool etilico al 75% per 30 minuti.
    1. Risciacquare più volte i semi sterilizzati con acqua distillata e poi germinare su carta da filtro umida in una capsula di Petri sterile a 30 °C al buio.
  2. Trasferire 20 semi uniformi, germinati, grossi e grossi su un cesto di attecchimento in una bottiglia di coltura riempita con soluzione nutritiva, composta da (in μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH 4 H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Acido Na2Fe-etilendiamminotetraacetico (EDTA), 75; H3 BO3, 46; MnSO4, 9.1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; e (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Regolare il pH della soluzione a 7,0 utilizzando 0,1 M KOH. Rinnova tutte le soluzioni settimanalmente.
  3. Porre tutti i flaconi di coltura in una camera di crescita controllata con un'intensità luminosa di 150-180 μmol m-2 s-1 con un fotoperiodo di 16 ore al giorno, a 27 °C e 20 °C che rappresentano rispettivamente il giorno (16 h) e la notte (8 h).
  4. Trasferire 15 piantine di erba medica uniformi in una nuova bottiglia di vetro per esperimenti di coltura sotto 1 mg kg-1 e 10 mg kg-1 DEHP stress dopo 2 settimane. Avvolgere le bottiglie di vetro con fogli di alluminio e parafilm per prevenire la fotolisi e la volatilizzazione del DEHP. Per applicare le stesse condizioni, avvolgere anche le bottiglie di controllo con foglio di alluminio e parafilm. Integrare la soluzione nutritiva ogni giorno per mantenere il livello del liquido.
  5. Posizionare e ruotare casualmente le bottiglie ogni 2 giorni per garantire condizioni di crescita coerenti per le piantine di erba medica.
  6. Dopo 7 giorni di coltivazione, rimuovere le piantine di erba medica dalle bottiglie e lavare con acqua ultrapura più volte, preparandosi per la raccolta degli essudati radicali.

2. Raccolta, estrazione e analisi metabolomica degli essudati radicali

NOTA: Questo protocollo è diviso in tre parti: un esperimento di raccolta, un esperimento di estrazione e l'analisi metabolomica degli essudati radicali. L'obiettivo dell'esperimento di raccolta è quello di trasferire i metaboliti secreti nei campioni vegetali al sistema di soluzione per la successiva estrazione.

  1. Esperimento di raccolta
    1. Trasferire 10 piantine di erba medica uniformi in provette da centrifuga riempite con 50 ml di acqua deionizzata sterilizzata. Immergere le radici in acqua per raccogliere gli essudati radicali per 6 ore; Tenere i tubi in posizione verticale. Eseguire almeno sei repliche per ogni trattamento.
    2. Avvolgere i tubi della centrifuga con un foglio di alluminio per proteggere le radici dalla luce.
    3. Rimuovere le piante e liofilizzare il liquido raccolto per la profilazione dei metaboliti.
  2. Esperimento di estrazione
    1. Aggiungere 1,8 mL di soluzione di estrazione (metanolo:H2O = 3:1, V/V) ai tubi e vortice per 30 s.
    2. Applicare le onde ultrasoniche ai tubi per 10 minuti a bagnomaria ghiacciata.
    3. Centrifugare i campioni a 4 °C e 11.000 × g per 15 minuti.
    4. Trasferire con cautela 200 μL di surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Prelevare 45 μL di surnatante da ciascun campione e mescolarlo in campioni di controllo qualità (QC) a un volume finale di 270 μL, che viene utilizzato per la calibrazione dei dati del metaboloma dei campioni.
    5. Liofilizzare gli estratti in un concentratore sottovuoto. Continuare l'asciugatura con 5 μL dello standard interno (ribonucleolo).
    6. Dopo l'evaporazione in un concentratore sotto vuoto, aggiungere 30 μL di metossiaminazione cloridrato (sciolto in piridina ad una concentrazione di 20 mg mL-1) alle provette e incubare le provette a 80 °C per 30 minuti. Quindi, aggiungere 40 μL di reagente bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide (BSTFA) (con 1% di trimetilclorosilano [TMC], V/V) ai campioni e posizionare le provette a 70 °C per 1,5 ore per la derivatizzazione.
    7. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 5 μL di esteri metilici degli acidi grassi (FAME) (in cloroformio) ai campioni di controllo qualità.
  3. Analisi metabolomica
    1. Iniettare 1,0 μL degli estratti derivati in un sistema gascromatografico accoppiato a uno spettrometro di massa a tempo di volo (GC-TOF-MS) per l'analisi del profilo metabolomico utilizzando una modalità splitless.
      1. Utilizzare una colonna capillare (30 m x 250 μm x 0,25 μm) per la separazione degli essudati radicali, con elio come gas vettore ad una portata di 1,0 mL min-1. Impostare la temperatura di iniezione su 280 °C e mantenere la temperatura della linea di trasferimento e la temperatura della sorgente di ioni rispettivamente a 280 °C e 250 °C.
      2. Per la separazione, utilizzare il seguente programma di forno: 1 min di riscaldamento isotermico a 50 °C, una rampa del forno di 10 °C/min-1 a 310 °C e un riscaldamento isotermico finale a 310 °C per 8 min.
      3. Eseguire la modalità di collisione elettronica con -70 eV di energia. Ottenere spettri di massa utilizzando la modalità di monitoraggio a scansione completa con un intervallo di scansione di massa di 50-500 m/z ad una velocità di 12,5 spettri/s.
    2. Filtrare i singoli picchi per rimuovere il rumore. Il valore di deviazione viene filtrato in base all'intervallo interquartile.
    3. Riempire i valori mancanti con metà dei valori minimi, standardizzare e normalizzare i dati.
    4. Importa i dati finali in formato .csv nel software di analisi statistica per l'analisi multivariata.
    5. Cerca i metaboliti nel database KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (una risorsa di database per comprendere le funzioni e le utilità di alto livello del sistema biologico) e classificare i metaboliti in diverse categorie, come carboidrati, acidi, lipidi, alcoli e ammine. Utilizzare un software di analisi statistica per costruire un grafico a torta per indicare la percentuale di ogni categoria in tutti gli essudati radice.
    6. Applicare proiezioni ortogonali supervisionate all'analisi discriminante delle strutture latenti (OPLS-DA) per dimostrare le differenze tra i gruppi.
    7. Lo screening ha cambiato significativamente i metaboliti come metaboliti differenziali sulla base di un'importanza variabile nella proiezione (VIP) > 1 e p < 0,05 (test t di Student).
    8. Utilizzare i dati del metaboloma per costruire mappe di calore con il software di analisi statistica e utilizzare i cambiamenti di piega sotto diversi trattamenti per costruire istogrammi.
    9. Cercare i metaboliti differenziali nel database KEGG e Pubchem e compilare le vie metaboliche contenenti i metaboliti differenziali. Eseguire l'analisi dell'arricchimento dei percorsi o della topologia.

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Representative Results

In questo esperimento, gli essudati delle radici di erba medica sono stati raccolti, estratti e analizzati secondo i metodi sopra riportati (Figura 1). Sono stati istituiti tre gruppi di trattamento: controllo, bassa concentrazione di DEHP (1 mg L-1) e alta concentrazione di DEHP (10 mg L-1).

Un totale di 778 picchi sono stati rilevati nel cromatografo del controllo, di cui 314 metaboliti potrebbero essere identificati in base agli spettri di massa. Come mostrato nella Figura 2, questi metaboliti potrebbero essere classificati in sei tipi in base all'abbondanza relativa: carboidrati (28,6%), acidi (15,58%), lipidi (13,87%), alcoli (3,91%), ammine (0,92%) e altri (37,12%). I metaboliti che rappresentavano meno dello 0,5% sono stati raggruppati come altre sostanze (Figura 2A). Gli acidi sono stati ulteriormente suddivisi in acidi grassi (56,09%), amminoacidi (26,62%), acidi organici (13,95%) e acidi fenolici (3,34%) (Figura 2B). Inoltre, alcune sostanze comuni negli essudati radicali della maggior parte delle piante potrebbero anche essere rilevate negli essudati delle radici di erba medica, tra cui pirimidine, idrossipiridine, flavonoidi, fenoli, chetoni, pirimidine, flavonoidi e diterpeni.

È stata tracciata una mappa di calore per visualizzare la variazione dei metaboliti differenziali tra i diversi trattamenti DEHP, in base al punteggio VIP (Figura 3). Rispetto al controllo, l'esposizione al DEHP ha modificato significativamente il contenuto di 50 metaboliti negli essudati delle radici di erba medica, includendo principalmente alcuni carboidrati e acidi organici a basso peso molecolare. Cinque tipi di carboidrati (lisosio, digitossosio, eritrosio, trealosio e fruttosio 2, 6-bifosfato) sono stati sovraregolati in presenza di DEHP e due di questi (lisosio e digitossosio) sono aumentati significativamente all'aumentare della concentrazione di DEHP. Inoltre, cinque metaboliti sono stati sottoregolati in presenza di DEHP, compresi monosaccaridi come D-tallosio e glucosio, disaccaridi come maltosio, cellobiosio e trealosio e alcoli di zucchero come D-arabitolo. Il contenuto di carboidrati è stato considerato un indicatore dello stato fisiologico delle piante24. Pertanto, la diminuzione dei livelli di monosaccaridi e disaccaridi qui indicati indica lo stress fisiologico causato dallo stress DEHP. Rispetto ai carboidrati, il DEHP ha esercitato un effetto maggiore sul metabolismo acido nelle piantine di erba medica. Sotto esposizione al DEHP, il contenuto di 11 metaboliti acidi è risultato significativamente aumentato, includendo principalmente acido 2-ammino-2-norbornanecarbossilico, acido 5-idrossiindolo-2-carbossilico, 3-idrossi-L-prolina, acido pelargonico e acido palmitico. Allo stesso tempo, il DEHP ha anche inibito il metabolismo di alcuni flavonoidi nelle piantine di erba medica, tra cui 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavone e neohesperidin.

Le vie metaboliche influenzate dal DEHP sono descritte nella Figura 4. Il DEHP ha inibito significativamente il metabolismo dei carboidrati, come alcuni monosaccaridi e disaccaridi, che sono prodotti della fotosintesi. Pertanto, il DEHP può sopprimere la fotosintesi dell'erba medica in una certa misura. Inoltre, il DEHP può promuovere il metabolismo degli acidi grassi, che sono utili per le piante per resistere allo stress da DEHP. Le principali vie metaboliche influenzate dal DEHP erano il metabolismo dei carboidrati e il metabolismo degli acidi grassi, mentre il metabolismo degli aminoacidi, il metabolismo dei lipidi e il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) erano influenzati in misura molto minore.

Figure 1
Figura 1: Un diagramma di flusso dell'analisi metabolomica non mirata per gli essudati delle radici di erba medica. BSTFA rappresenta il reagente bis(trimetilsilil)trifluoroacetammide (BSTFA) (con 1% di trimetilclorosilano [TMC], V/V). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Classificazione dei metaboliti. (A) Classificazione dei metaboliti noti e (B) acidi. La percentuale di ciascun tipo di materiale è divisa per la somma dell'area del picco di ciascuna categoria per la somma dell'area del picco di tutte le sostanze nel controllo. Le altre sostanze erano quelle a <0,5%. Gli altri acidi erano quelli a <0,5%. Questa cifra è stata modificata da Wang et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Mappa di calore dell'analisi del clustering gerarchico per gli essudati radicali (VIP > 1, p < 0.05) di piantine di erba medica con diversi trattamenti DEHP. Il rosso e il verde rappresentano rispettivamente l'abbondanza alta e bassa. ACK rappresenta il controllo; 1+AD rappresenta il trattamento con 1 mg di L−1 DEHP; 10+AD rappresenta il trattamento con 10 mg di L−1 DEHP. Questa cifra è stata modificata da Wang et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Relazioni tra il disturbo delle vie metaboliche e le alterazioni degli endpoint biologici (1 mg L-1 DEHP, 10 mg L-1 DEHP). Le vie metaboliche sono state stabilite sulla base del database KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). I metaboliti nel testo verde erano i metaboliti rilevati nel presente lavoro. I segni "caselle rosse" e "caselle blu" tra parentesi indicano che i metaboliti hanno aumentato (p < 0,05) o diminuito (p < 0,05) contributi agli endpoint biologici, rispettivamente. La figura è stata resa leggibile separando i metaboliti approssimativamente in carboidrati, acidi grassi e metabolismo proteico, come mostrato rispettivamente dalle caselle rettangolari verdi, rosse e nere. ACK rappresenta il controllo; 1+AD rappresenta il trattamento con 1 mg di L−1 DEHP; 10+AD rappresenta il trattamento con 10 mg di L−1 DEHP. Questa cifra è stata modificata da Wang et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo fornisce indicazioni generali su come raccogliere e misurare gli essudati radicali dell'erba medica sotto stress DEHP, nonché su come analizzare i dati del metaboloma. È necessario prestare molta attenzione ad alcuni passaggi critici di questo protocollo. Negli esperimenti di coltura idroponica, le piantine di erba medica sono state coltivate idroponicamente in bottiglie di vetro riempite con soluzioni nutritive con diverse concentrazioni di DEHP. Le bottiglie di vetro devono essere protette dalla luce coprendole con un foglio di alluminio per tutto il periodo di coltura, al fine di prevenire la fotolisi del DEHP e garantire l'uniformità delle concentrazioni di DEHP in tutte le soluzioni di coltura25,26. Le concentrazioni di DEHP sono state fissate a 1 mg L-1 e 10 mg L-1, secondo le concentrazioni solitamente riscontrate nei terreni contaminati da DEHP27,28. Durante la raccolta degli essudati radicali, i tubi della centrifuga devono ancora essere avvolti con un foglio di alluminio per proteggere le radici dalla luce. Qui, il tempo di raccolta è stato fissato per essere 6 h. Se il tempo di raccolta è troppo breve, la concentrazione di alcuni essudati radicali a bassa abbondanza potrebbe essere troppo bassa per essere rilevata, quindi la composizione degli essudati radicali potrebbe non riflettere la reale risposta delle piantine di erba medica sotto stress DEHP. Se il tempo di raccolta è troppo lungo, gli essudati radicali raccolti potrebbero essere degradati in una certa misura dai microbi nei sistemi di coltura. In questo caso, alcuni metaboliti microbici potrebbero anche essere rilevati, modificando la composizione degli essudati radicali29. Inoltre, devono essere eseguite almeno sei repliche per ciascun trattamento in modo da garantire un'accurata analisi dei dati del metaboloma.

Solo alcuni tipi di essudati radicali, come amminoacidi, acidi grassi, composti fenolici e altri acidi organici, possono essere determinati utilizzando metodi analitici mirati convenzionali (cioè la ricerca di composti noti)30,31,32, utilizzando metodi analitici standard, come spettrofotometria, cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), cromatografia ionica (IC), gascromatografia-spettrometria di massa tandem (GC-MS/MS) o cromatografia liquida combinata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Con lo sviluppo di tecniche di analisi strumentale, è emersa l'analisi metabolomica non mirata basata su GC-TOF-MS, cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HR-MS) e risonanza magnetica nucleare (NMR)33. Rispetto ad altri metodi analitici convenzionali di essudati radicali, l'analisi metabolomica non mirata espande notevolmente il numero di essudati radicali rilevati, il che facilita la comprensione profonda delle risposte metaboliche delle piante allo stress ambientale.

La tecnica nel presente studio ha alcune limitazioni, specialmente nell'analisi quantitativa dei metaboliti. L'analisi metabolomica non mirata dimostra solo le relazioni quantitative relative tra i diversi metaboliti, piuttosto che concentrazioni accurate. Ciò è sfavorevole per le indagini sui comportamenti ambientali o sugli effetti ecologici degli essudati radicali34. Per i terreni di crescita delle piantine di erba medica, nello studio attuale sono stati eseguiti esperimenti di coltura idroponica, che hanno i vantaggi di un facile controllo e di un facile funzionamento. Tuttavia, l'ambiente di crescita idroponica artificiale è diverso dall'ambiente reale del suolo, portando a una possibile sottostima dei tassi di essudazione lorda dovuti alla ricaptazione dei metaboliti da parte delle radici35. Rispetto alla coltura idroponica, la coltura della sabbia è un metodo relativamente più convincente perché è più vicino all'ambiente reale del suolo, facilitando la raccolta degli essudati radicali in un ambiente realistico36. Pertanto, sono in corso lavori per stabilire un metodo di coltura della sabbia o anche una vera coltura del suolo per rendere i risultati sperimentali più convincenti, che ci aiuteranno a condurre ricerche più approfondite, mostrando migliori risultati di significato pratico per spiegare la risposta alla tossicità.

Sulla base dell'analisi metabolica non mirata, possiamo non solo esplorare la risposta metabolica delle piante allo stress ambientale37, ma anche determinare i metaboliti differenziali e indagare ulteriormente l'importante ruolo dei metaboliti differenziali nel comportamento ambientale dei contaminanti38. Studi precedenti hanno dimostrato che il livello di acido pelargonico può essere utilizzato come indicatore del danno alla membrana radicale quando le piante sono sotto stress39. È stato anche scoperto che gli acidi grassi insaturi (acido palmitico) aumentano la fluidità della membrana40, che può proteggere le membrane delle radici di erba medica dai danni del DEHP. Alcuni flavonoidi inibiti dal DEHP possono partecipare all'interazione tra legumi e microrganismi. Inoltre, le interazioni tra le piante e la comunità biologica della rizosfera possono essere decifrate più profondamente con analisi metaboliche non mirate, specialmente sotto lo stress dei contaminanti41. Saranno identificati altri tipi di essudati radicali42 con lo sviluppo di strumenti analitici per l'analisi metabolica non mirata, che è utile per costruire l'impronta metabolomica degli essudati delle radici delle piante43.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (41877139), dai principali progetti della National Natural Science Foundation of China (41991335), dal National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), dalla Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (n. BK20161616), dal Piano "135" e dal Programma di frontiera dell'Accademia cinese delle scienze (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Scienze ambientali numero 196
Raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del di(2-etilesil) ftalato sulla produzione di metaboliti
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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