Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

De afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld via niet-gerichte metabolomische analyse.

Abstract

Wortelexsudaten zijn de belangrijkste media van informatiecommunicatie en energieoverdracht tussen plantenwortels en de omgeving. De verandering in afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol heeft tot doel algemene richtlijnen in te voeren voor het verzamelen van alfalfawortelexsudaten om de impact van di(2-ethylhexyl)ftalaat (DEHP) op de productie van metabolieten te bestuderen. Ten eerste worden alfalfa-zaailingen gekweekt onder DEHP-stress in een hydroponisch cultuurexperiment. Ten tweede worden de planten overgebracht naar centrifugebuizen met 50 ml gesteriliseerd ultrapuur water gedurende 6 uur om wortelexsudaten te verzamelen. De oplossingen worden vervolgens gevriesdroogd in een vacuümvriesdroger. De ingevroren monsters worden geëxtraheerd en gederivatiseerd met bis (trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagens. Vervolgens worden de gederivatiseerde extracten gemeten met behulp van een gaschromatograafsysteem gekoppeld aan een time-of-flight massaspectrometer (GC-TOF-MS). De verkregen metabolietgegevens worden vervolgens geanalyseerd op basis van bioinformatische methoden. Differentiële metabolieten en significant veranderde metabolismeroutes moeten grondig worden onderzocht om de impact van DEHP op alfalfa te onthullen met het oog op wortelexsudaten.

Introduction

Di (2-ethylhexyl) ftalaat (DEHP) is een synthetische chemische verbinding die veel wordt gebruikt in verschillende kunststoffen en polymeren als weekmaker om hun plasticiteit en sterkte te verbeteren. In de afgelopen jaren hebben steeds meer studies gesuggereerd dat DEHP een hormoonontregelaar is en een nadelig effect heeft op de ademhalings-, zenuw- en voortplantingssystemen van mensen en andere dieren 1,2,3. Gezien het gezondheidsrisico hebben het Environmental Protection Agency van de Verenigde Staten, de Europese Unie en het Environmental Monitoring Center of China allemaal DEHP geclassificeerd in de lijst met prioritaire verontreinigende stoffen. De bodem wordt beschouwd als een belangrijke put van DEHP in het milieu, vanwege de toepassing van plastic mulchen en organische meststoffen, irrigatie met afvalwater en toepassing van slibbedrijven4. Zoals verwacht is DEHP alomtegenwoordig gedetecteerd in landbouwgronden, waarvan het gehalte in sommige regio's in China zelfs tot milligram per kilogram gedroogde grond reikt 5,6. DEHP kan planten voornamelijk via de wortels binnendringen en biomagnificatie ondergaan op verschillende trofische niveaus in bodemecosystemen7. Daarom is er de afgelopen decennia grote bezorgdheid geuit over door DEHP veroorzaakte stress in planten.

Planten zijn meestal kwetsbaar voor DEHP-blootstelling. Van DEHP-stress is waargenomen dat het een nadelig effect heeft op de kieming van zaden en het normale metabolisme, waardoor de groei en ontwikkeling van planten wordt geremd 8,9. DEHP kan bijvoorbeeld oxidatieve schade aan mesofylcellen veroorzaken, het gehalte aan chlorofyl en osmolyten verlagen en antioxidatieve enzymactiviteiten verhogen, wat uiteindelijk resulteert in een afname van de opbrengst en kwaliteit van eetbare planten10,11. De meeste eerdere studies over de reactie van planten op DEHP-stress hebben zich echter gericht op oxidatieve stress en fysiologische en biochemische kenmerken. De overeenkomstige mechanismen die verband houden met het metabolisme van planten zijn minder bestudeerd. Wortelexsudaten is een algemene term die verbindingen beschrijft die plantenwortels afscheiden en afgeven in het milieu. Ze worden beschouwd als de interactiemedia tussen planten en rhizosfeergrond en spelen een belangrijke rol bij het ondersteunen van plantengroei en -ontwikkeling12. Het is bekend dat wortelexsudaten goed zijn voor ongeveer 30% -40% van alle fotosynthetische koolstof13. In vervuilde omgevingen zijn wortelexsudaten betrokken bij het verbeteren van de tolerantie van planten voor de stress van verontreinigende stoffen door metabolisme of externe uitsluiting14. Als gevolg hiervan kan een diepgaand begrip van de reactie van plantenwortelexsudaten op vervuilingsstress helpen bij het onthullen van de onderliggende mechanismen die verband houden met celbiochemie en biologische verschijnselen15.

Metabolomics-technologie biedt een efficiënte strategie voor het gelijktijdig meten van een groot aantal metabolieten van kleine moleculen in cellen 16,17, weefsels18 en zelfs exsudaten van organismen 19, waaronder suikers, organische zuren, aminozuren en lipiden. In vergelijking met traditionele of klassieke chemische analysemethoden verhoogt de metabolomics-benadering het aantal metabolieten dat kan worden gedetecteerd20, wat kan helpen bij het identificeren van metabolieten op een manier met een hogere doorvoer en het identificeren van belangrijke metabole routes. Metabolomics is op grote schaal gebruikt in het onderzoeksgebied van biologische respons in stressomgevingen, zoals zware metalen21, opkomende verontreinigende stoffen22 en nanodeeltjes19. De meeste van deze studies op planten hebben zich gericht op de metabole veranderingen in inwendige plantenweefsels, terwijl er weinig zijn gerapporteerd over de reactie van wortelexsudaten op omgevingsstress. Daarom is het doel van deze studie om algemene richtlijnen te introduceren voor het verzamelen van alfalfawortelexsudaten om de impact van DEHP op de productie van metabolieten te bestuderen. De resultaten zullen een methodeleidraad bieden voor de vervolgstudie van plantenmetabolomica door DEHP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het doel van dit protocol is om een algemene pijplijn te bieden, van een hydroponisch cultuurexperiment tot metabolomische analyse, waarbij het effect van DEHP op alfalfawortelexsudaten wordt gekwantificeerd.

1. Hydroponisch cultuurexperiment

OPMERKING: Dit protocol presenteert een voorbeeld van een alfalfa hydroponisch cultuurexperiment dat is ontworpen om alfalfa (Medicago sativa) zaailingen te verkrijgen onder de stress van verschillende concentraties DEHP. Er werden drie behandelingen opgezet: de controle zonder toevoegingen en de voedingsoplossing met 1 mg kg-1 en 10 mg kg-1 di(DEHP. De concentraties van DEHP werden vastgesteld op basis van het werkelijke gehalte aan DEHP in bodem23. Elke behandeling had zes replica's.

  1. Steriliseer alfalfazaden met 0,1% natriumhypochloriet gedurende 10 minuten en 75% ethylalcohol gedurende 30 minuten.
    1. Spoel de gesteriliseerde zaden meerdere keren af met gedestilleerd water en ontkiem vervolgens op vochtig filtreerpapier in een steriele petrischaal bij 30 °C in het donker.
  2. Breng 20 uniforme, ontkiemde, dik-mollige zaden over op een engraftmentmand in een kweekfles gevuld met voedingsoplossing, bestaande uit (in μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 75; H3 BO3, 46; Mnso4, 9.1; ZnSO4, 0,8; Cuso4, 0,3; en (NH4 )6ma7O24, 0,02. Stel de pH van de oplossing in op 7,0 met 0,1 M KOH. Vernieuw alle oplossingen wekelijks.
  3. Plaats alle kweekflessen in een gecontroleerde groeikamer met een lichtintensiteit van 150-180 μmol m-2 s-1 met een fotoperiode van 16 uur per dag, bij 27 °C en 20 °C die respectievelijk dag (16 uur) en nacht (8 uur) vertegenwoordigen.
  4. Breng 15 uniforme alfalfa-zaailingen over in een nieuwe glazen fles voor kweekexperimenten onder 1 mg kg-1 en 10 mg kg-1 DEHP-stress na 2 weken. Wikkel de glazen flessen in met aluminiumfolie en parafilm om fotolyse en vervluchtiging van de DEHP te voorkomen. Om dezelfde voorwaarden toe te passen, wikkelt u de controleflessen ook in met aluminiumfolie en parafilm. Vul de voedingsoplossing dagelijks aan om het vloeistofniveau te handhaven.
  5. Plaats en draai de flessen willekeurig om de 2 dagen om consistente groeiomstandigheden voor de alfalfa-zaailingen te garanderen.
  6. Verwijder na 7 dagen van de teelt de alfalfa-zaailingen uit de flessen en was ze meerdere keren met ultrapuur water, ter voorbereiding op het verzamelen van wortelexsudaten.

2. Verzameling, extractie en metabolomische analyse van wortelexsudaten

OPMERKING: Dit protocol is verdeeld in drie delen: een verzamelexperiment, een extractie-experiment en metabolomische analyse van de wortelexsudaten. Het doel van het verzamelexperiment is om de metabolieten die in plantenmonsters worden uitgescheiden over te brengen naar het oplossingssysteem voor latere extractie.

  1. Collectie-experiment
    1. Breng 10 uniforme alfalfa-zaailingen over naar centrifugebuizen gevuld met 50 ml gesteriliseerd gedeïoniseerd water. Dompel de wortels onder in water om wortelexsudaten gedurende 6 uur te verzamelen; Houd de buizen rechtop. Voer ten minste zes replicaties uit voor elke behandeling.
    2. Wikkel de centrifugebuizen met aluminiumfolie om de wortels tegen licht te beschermen.
    3. Verwijder de planten en vriesdroog de verzamelde vloeistof voor metabolietprofilering.
  2. Extractie-experiment
    1. Voeg 1,8 ml extractieoplossing (methanol:H2O = 3:1, V/V) toe aan de buizen en vortex gedurende 30 s.
    2. Breng ultrasone golven aan op de buizen gedurende 10 minuten in een ijswaterbad.
    3. Centrifugeer de monsters bij 4 °C en 11.000 × g gedurende 15 minuten.
    4. Breng voorzichtig 200 μL supernatant over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Neem 45 μL supernatant van elk monster en meng het in kwaliteitscontrole (QC) monsters met een eindvolume van 270 μL, dat wordt gebruikt voor de kalibratie van de metaboloomgegevens van monsters.
    5. Vriesdroog de extracten in een vacuümconcentrator. Verder drogen met 5 μL van de interne standaard (ribonucleol).
    6. Voeg na verdamping in een vacuümconcentrator 30 μL methoxyaminatiehydrochloride (opgelost in pyridine in een concentratie van 20 mg ml-1) toe aan de buizen en incubeer de buizen bij 80 °C gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 40 μL bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA)-reagens (met 1% trimethylchloorsilaan [TMC], V/V) toe aan de monsters en plaats de buizen gedurende 1,5 uur bij 70 °C voor derivatisatie.
    7. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en voeg 5 μL vetzuurmethylesters (FAME's) (in chloroform) toe aan de QC-monsters.
  3. Metabolomische analyse
    1. Injecteer 1,0 μL van de gederivatiseerde extracten in een gaschromatograafsysteem gekoppeld aan een time-of-flight massaspectrometer (GC-TOF-MS) voor metabolomische profileringsanalyse met behulp van een splitless modus.
      1. Gebruik een capillaire kolom (30 m x 250 μm x 0,25 μm) voor de scheiding van wortelexsudaten, met helium als dragergas met een stroomsnelheid van 1,0 ml min-1. Stel de injectietemperatuur in op 280 °C en houd de temperatuur van de overdrachtsleiding en de ionenbrontemperatuur op respectievelijk 280 °C en 250 °C.
      2. Gebruik voor de scheiding het volgende ovenprogramma: 1 min isothermische verwarming bij 50 °C, een ovenhelling van 10 °C/min-1 bij 310 °C en een laatste isotherme verwarming bij 310 °C gedurende 8 minuten.
      3. Voer de elektronenbotsingsmodus uit met -70 eV energie. Verkrijg massaspectra met behulp van de volledige scanbewakingsmodus met een massascanbereik van 50-500 m/z met een snelheid van 12,5 spectra/s.
    2. Filter individuele pieken om ruis te verwijderen. De afwijkingswaarde wordt gefilterd op basis van het interkwartielbereik.
    3. Vul de ontbrekende waarden met de helft van de minimumwaarden, standaardiseer en normaliseer de gegevens.
    4. Importeer de uiteindelijke gegevens in .csv formaat in statistische analysesoftware voor multivariate analyse.
    5. Zoek de metabolieten op in de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -database (een databasebron voor het begrijpen van functies en hulpprogramma's op hoog niveau van het biologische systeem) en classificeer de metabolieten in verschillende categorieën, zoals koolhydraten, zuren, lipiden, alcoholen en amines. Gebruik statistische analysesoftware om een cirkeldiagram te maken om het percentage van elke categorie in alle wortelexsudaten aan te geven.
    6. Pas gesuperviseerde orthogonale projecties toe op latente structuren-discriminatieanalyse (OPLS-DA) om de verschillen tussen groepen aan te tonen.
    7. Screening significant veranderde metabolieten als differentiële metabolieten op basis van een variabel belang in projectie (VIP) > 1 en p < 0,05 (Student's t-test ).
    8. Gebruik de metaboloomgegevens om heatmaps te construeren met de statistische analysesoftware en gebruik de vouwveranderingen onder verschillende behandelingen om histogrammen te construeren.
    9. Zoek de differentiële metabolieten op in de KEGG-database en Pubchem en stel de metabole routes samen die de differentiële metabolieten bevatten. Voer pathway-verrijkingsanalyse of topologieanalyse uit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In dit experiment werden alfalfawortelexsudaten verzameld, geëxtraheerd en geanalyseerd volgens de bovenstaande methoden (figuur 1). Er werden drie behandelingsgroepen opgezet: controle, lage concentratie DEHP (1 mg L−1) en hoge concentratie DEHP (10 mg L−1).

In totaal werden 778 pieken gedetecteerd in de chromatograaf van de controlegroep, waarvan 314 metabolieten konden worden geïdentificeerd volgens de massaspectra. Zoals te zien is in figuur 2, kunnen deze metabolieten worden ingedeeld in zes soorten op basis van de relatieve abundantie: koolhydraten (28,6%), zuren (15,58%), lipiden (13,87%), alcoholen (3,91%), amines (0,92%) en anderen (37,12%). Metabolieten die minder dan 0,5% uitmaakten, werden gegroepeerd als andere stoffen (figuur 2A). De zuren werden verder onderverdeeld in vetzuren (56,09%), aminozuren (26,62%), organische zuren (13,95%) en fenolzuren (3,34%) (figuur 2B). Bovendien kunnen enkele veel voorkomende stoffen in de wortelexsudaten van de meeste planten ook worden gedetecteerd in alfalfa-wortelexsudaten, waaronder pyrimidines, hydroxypyridines, flavonoïden, fenolen, ketonen, pyrimidines, flavonoïden en diterpenen.

Een heatmap werd uitgezet om de variatie in differentiële metabolieten tussen verschillende DEHP-behandelingen te visualiseren, op basis van de VIP-score (figuur 3). In vergelijking met de controle veranderde de blootstelling aan DEHP het gehalte aan 50 metabolieten in alfalfawortelexsudaten aanzienlijk, voornamelijk inclusief enkele koolhydraten en organische zuren met een laag molecuulgewicht. Vijf soorten koolhydraten (lyxose, digitoxose, erythrose, trehalose en fructose 2, 6-bihospfaat) werden geupreguleerd in aanwezigheid van DEHP, en twee hiervan (lyxose en digitoxose) werden significant verhoogd naarmate de concentratie van DEHP toenam. Bovendien werden vijf metabolieten gedownreguleerd in aanwezigheid van DEHP, waaronder monosachariden zoals D-talose en glucose, disachariden zoals maltose, cellobiose en trehalose en suikeralcoholen zoals D-arabitol. Het koolhydraatgehalte is beschouwd als een indicator voor de fysiologische status van de plant24. Daarom duidde de afname van monosacharide- en disacharideniveaus hierin op fysiologische stress veroorzaakt door DEHP-stress. In vergelijking met koolhydraten oefende DEHP een groter effect uit op het zuurmetabolisme in alfalfa-zaailingen. Bij blootstelling aan DEHP waren de gehalten aan 11 zuurmetabolieten significant verhoogd, voornamelijk waaronder 2-amino-2-norbornaancarbonzuur, 5-hydroxyindool-2-carbonzuur, 3-hydroxy-L-proline, pelargonzuur en palmitinezuur. Tegelijkertijd remde DEHP ook het metabolisme van sommige flavonoïden in alfalfa-zaailingen, waaronder 4', 5-dihyrroxy-7-methoxyisoflavon en neohesperidin.

De metabole routes beïnvloed door DEHP zijn beschreven in figuur 4. DEHP remde aanzienlijk het metabolisme van koolhydraten, zoals sommige monosachariden en disachariden, die producten zijn van fotosynthese. Daarom kan DEHP de fotosynthese van alfalfa tot op zekere hoogte onderdrukken. Bovendien kan DEHP het metabolisme van vetzuren bevorderen, die nuttig zijn voor planten om stress van DEHP te weerstaan. De belangrijkste metabole routes beïnvloed door DEHP waren koolhydraatmetabolisme en vetzuurmetabolisme, terwijl aminozuurmetabolisme, lipidenmetabolisme en de tricarbonzuur (TCA) -cyclus in veel mindere mate werden beïnvloed.

Figure 1
Figuur 1: Een stroomschema van niet-gerichte metabolomische analyse voor alfalfawortelexsudaten. BSTFA staat voor bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) reagens (met 1% trimethylchloorsilaan [TMC], V/V). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Classificatie van metabolieten. (A) Classificatie van de bekende metabolieten en (B) zuren. Het percentage van elk type materiaal wordt gedeeld door de som van het piekoppervlak van elke categorie door de som van het piekoppervlak van alle stoffen in de controlegroep. Andere stoffen waren die met <0,5%. Andere zuren waren die met <0,5%. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Heatmap van hiërarchische clusteranalyse voor wortelexsudaten (VIP > 1, p < 0,05) van luzernezaailingen met verschillende DEHP-behandelingen. Rood en groen vertegenwoordigen respectievelijk een hoge en lage abundantie. ACK vertegenwoordigt de controle; 1+AD staat voor de behandeling met 1 mg L−1 DEHP; 10+AD staat voor de behandeling met 10 mg L−1 DEHP. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Relaties tussen de verstoring van metabole routes en de veranderingen in biologische eindpunten (1 mg L−1 DEHP, 10 mg L−1 DEHP). De metabole routes werden vastgesteld op basis van de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database. De metabolieten in groene tekst waren de metabolieten die in dit werk werden gedetecteerd. De tekens "rode vakken" en "blauwe vakken" tussen haakjes geven aan dat metabolieten respectievelijk een verhoogde (p < 0,05) of verminderde (p < 0,05) bijdrage aan de biologische eindpunten. De figuur is leesbaar gemaakt door de metabolieten ruwweg te scheiden in koolhydraat-, vetzuur- en eiwitmetabolisme, zoals blijkt uit respectievelijk de groene, rode en zwarte rechthoekige vakken. ACK vertegenwoordigt de controle; 1+AD staat voor de behandeling met 1 mg L−1 DEHP; 10+AD staat voor de behandeling met 10 mg L−1 DEHP. Dit cijfer is aangepast van Wang et al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol biedt algemene richtlijnen voor het verzamelen en meten van de wortelexsudaten van alfalfa onder DEHP-stress, evenals voor het analyseren van de metaboloomgegevens. Er moet veel aandacht worden besteed aan enkele kritieke stappen in dit protocol. In hydroponische cultuurexperimenten werden alfalfa-zaailingen hydroponisch gekweekt in glazen flessen gevuld met voedingsoplossingen met verschillende concentraties DEHP. De glazen flessen moeten worden beschermd tegen licht door ze gedurende de hele kweekperiode met aluminiumfolie te bedekken, om fotolyse van DEHP te voorkomen en de uniformiteit van DEHP-concentraties in alle kweekoplossingente garanderen 25,26. DEHP-concentraties werden vastgesteld als 1 mg L-1 en 10 mg L-1, volgens de concentraties die gewoonlijk worden aangetroffen in bodems die verontreinigd zijn met DEHP 27,28. Tijdens het verzamelen van wortelexsudaten moeten de centrifugebuizen nog steeds worden omwikkeld met aluminiumfolie om de wortels tegen licht te beschermen. Hier was de ophaaltijd ingesteld op 6 uur. Als de verzameltijd te kort is, kan de concentratie van sommige wortelexsudaten met een lage abundantie te laag zijn om te worden gedetecteerd, dus de samenstelling van de wortelexsudaten weerspiegelt mogelijk niet de echte reactie van alfalfa-zaailingen onder DEHP-stress. Als de verzameltijd te lang is, kunnen de verzamelde wortelexsudaten tot op zekere hoogte worden afgebroken door microben in de kweeksystemen. In dit geval kunnen ook enkele microbiële metabolieten worden gedetecteerd, waardoor de samenstelling van de wortelexsudatenverandert 29. Bovendien moeten voor elke behandeling ten minste zes replicaties worden uitgevoerd om een nauwkeurige analyse van metaboloomgegevens te garanderen.

Slechts enkele bepaalde soorten wortelexsudaten, zoals aminozuren, vetzuren, fenolverbindingen en andere organische zuren, kunnen worden bepaald met behulp van conventionele gerichte analysemethoden (d.w.z. zoeken naar bekende verbindingen)30,31,32, met behulp van standaard analytische methoden, zoals spectrofotometrie, hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), ionchromatografie (IC), gaschromatografie-tandem massaspectrometrie (GC-MS / MS) of vloeistofchromatografie gecombineerd met tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Met de ontwikkeling van instrumentele analysetechnieken is niet-gerichte metabolomische analyse ontstaan op basis van GC-TOF-MS, vloeistofchromatografie-hoge resolutie massaspectrometrie (LC-HR-MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR)33. In vergelijking met andere conventionele analytische methoden van wortelexsudaten, breidt niet-gerichte metabolomische analyse het aantal gedetecteerde wortelexsudaten aanzienlijk uit, wat een diepgaand begrip van de metabolische reacties van planten op omgevingsstress vergemakkelijkt.

De techniek in de huidige studie heeft enkele beperkingen, vooral in de kwantitatieve analyse van metabolieten. Niet-gerichte metabolomische analyse toont alleen de relatieve kwantitatieve relaties tussen verschillende metabolieten aan, in plaats van nauwkeurige concentraties. Dit is ongunstig voor onderzoek naar het milieugedrag of de ecologische effecten van wortelexsudaten34. Voor de groeimedia van alfalfa-zaailingen werden hydroponische cultuurexperimenten uitgevoerd in de huidige studie, die de voordelen hebben van eenvoudige controle en eenvoudige bediening. De kunstmatige hydroponische groeiomgeving verschilt echter van de echte bodemomgeving, wat leidt tot mogelijke onderschatting van de bruto exsudatiesnelheden als gevolg van de heropname van metabolieten door wortels35. In vergelijking met hydrocultuur is zandcultuur een relatief overtuigender methode omdat het dichter bij het echte bodemmilieu staat, waardoor het verzamelen van wortelexsudaten in een realistische omgeving wordt vergemakkelijkt36. Daarom wordt gewerkt aan een methode van zandkweek of zelfs echte bodemcultuur om de experimentele resultaten overtuigender te maken, wat ons zal helpen meer diepgaand onderzoek uit te voeren, met betere resultaten van praktische betekenis voor het verklaren van de toxiciteitsrespons.

Op basis van de niet-gerichte metabole analyse kunnen we niet alleen de metabole reactie van planten op omgevingsstress37 onderzoeken, maar ook differentiële metabolieten bepalen en de belangrijke rol van de differentiële metabolieten in het milieugedrag van contaminanten verder onderzoeken38. Eerdere studies hebben aangetoond dat het pelargonzuurniveau kan worden gebruikt als een indicator van wortelmembraanbeschadiging wanneer planten onder stress staan39. Onverzadigde vetzuren (palmitinezuur) bleken ook de membraanvloeibaarheid40 te verhogen, wat alfalfa-wortelmembranen kan beschermen tegen DEHP-schade. Sommige flavonoïden geremd door DEHP kunnen deelnemen aan de interactie tussen peulvruchten en micro-organismen. Bovendien kunnen de interacties tussen planten en de biologische gemeenschap van de rhizosfeer dieper worden ontcijferd met niet-gerichte metabole analyse, vooral onder de stress van verontreinigingen41. Meer soorten wortelexsudaten zullen worden geïdentificeerd42 met de ontwikkeling van analytische instrumenten voor niet-gerichte metabole analyse, wat nuttig is voor het construeren van de metabolomische fingerprinting van plantenwortelexsudaten43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Acknowledgments

Dit werk werd gezamenlijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (41877139), de Major Projects van de National Natural Science Foundation of China (41991335), het National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20161616), het "135" Plan en het Frontiers Program van de Chinese Academy of Sciences (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
  2. Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
  3. van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
  4. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  5. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  6. Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
  7. Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
  8. Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
  9. Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
  10. Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
  11. Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
  12. Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
  13. Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
  14. Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
  15. Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
  16. Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
  17. vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
  18. Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
  19. Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
  20. Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
  21. Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
  22. Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
  23. He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
  24. Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  25. Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
  26. Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
  27. Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
  28. Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
  29. Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
  30. Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
  31. Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
  32. Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
  33. van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
  34. Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
  35. Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
  36. Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , Wuhan, China. 319-321 (2003).
  37. Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
  38. Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
  39. Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
  40. Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
  41. Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
  42. Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
  43. Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).

Tags

Milieuwetenschappen Nummer 196
Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter