Summary
ينتج العامل الممرض الفطري البشري Cryptococcus neoformans مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة (مثل الببتيداز) لتعزيز بقائه داخل المضيف. تمثل المنافذ البيئية مصدرا واعدا لمثبطات الببتيداز الطبيعية الجديدة. يحدد هذا البروتوكول تحضير المستخلصات من الرخويات وتقييم تأثيرها على إنتاج عامل الفوعة الفطرية.
Abstract
Cryptococcus neoformans هو أحد مسببات الأمراض الفطرية البشرية المغلفة مع توزيع عالمي يصيب في المقام الأول الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. أدى الاستخدام الواسع النطاق لمضادات الفطريات في البيئات السريرية ، واستخدامها في الزراعة ، وتهجين السلالة إلى زيادة تطور المقاومة. هذا المعدل المتزايد للمقاومة ضد مضادات الفطريات هو مصدر قلق متزايد بين الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم ، وهناك حاجة ملحة متزايدة لتطوير علاجات جديدة مضادة للفطريات. على سبيل المثال ، تنتج C. neoformans العديد من عوامل الفوعة ، بما في ذلك الإنزيمات داخل وخارج الخلية (على سبيل المثال ، الببتيداز) مع أدوار في تدهور الأنسجة ، والتنظيم الخلوي ، واكتساب المغذيات. إن تعطيل نشاط الببتيداز هذا بواسطة مثبطات يزعج نمو الفطريات وتكاثرها ، مما يشير إلى أن هذه قد تكون استراتيجية مهمة لمكافحة العامل الممرض. الأهم من ذلك ، أن اللافقاريات مثل الرخويات تنتج مثبطات الببتيداز مع التطبيقات الطبية الحيوية والنشاط المضاد للميكروبات ، لكنها غير مستكشفة من حيث استخدامها ضد مسببات الأمراض الفطرية. في هذا البروتوكول ، تم إجراء استخراج عالمي من الرخويات لعزل مثبطات الببتيداز المحتملة في المستخلصات الخام والموضحة ، وتم تقييم آثارها ضد عوامل ضراوة المكورات العقدية الكلاسيكية. تدعم هذه الطريقة تحديد أولويات الرخويات ذات الخصائص المضادة للفطريات وتوفر فرصا لاكتشاف العوامل المضادة للضراوة من خلال تسخير المثبطات الطبيعية الموجودة في الرخويات.
Introduction
Cryptococcus neoformans هو أحد مسببات الأمراض الفطرية البشرية التي تنتج مرضا شديدا في المضيفين الذين يعانون من نقص المناعة ، مثل الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز1 ، ويؤدي إلى ما يقرب من 19 ٪ من الوفيات المرتبطة بالإيدز2. الفطر عرضة لعدة فئات من مضادات الفطريات ، بما في ذلك الأزول ، البوليين ، والفلوسيتوسين ، والتي تمارس نشاط مبيد للفطريات والفطريات باستخدام آليات متميزة 3,4. ومع ذلك ، فإن الاستخدام المكثف لمضادات الفطريات في البيئات السريرية والزراعية جنبا إلى جنب مع تهجين السلالة قد أدى إلى تضخيم تطور المقاومة في أنواع فطرية متعددة ، بما في ذلك C. neoformans5.
للتغلب على تحديات المقاومة المضادة للفطريات والحد من انتشار الالتهابات الفطرية على نطاق عالمي ، يتمثل النهج الواعد في استخدام عوامل الفوعة ل Cryptococcus spp. (على سبيل المثال ، القدرة على التكيف مع درجة الحرارة ، وكبسولة السكاريد ، والميلانين ، والإنزيمات خارج الخلية) كأهداف علاجية محتملة 4,6 . هذا النهج له العديد من المزايا ، حيث أن عوامل الفوعة هذه موصوفة جيدا في الأدبيات ، واستهداف هذه العوامل يمكن أن يقلل من معدلات المقاومة المضادة للفطريات عن طريق فرض ضغط انتقائي أضعف من خلال إضعاف الفوعة بدلا من استهداف نمو الخلايا6. في هذا السياق ، قيمت العديد من الدراسات إمكانية استهداف الإنزيمات خارج الخلية (على سبيل المثال ، البروتياز والببتيداز) لتقليل أو تثبيط ضراوة Cryptococcus spp.7،8،9.
الكائنات الحية مثل اللافقاريات والنباتات لا تمتلك جهاز مناعة تكيفي لحماية نفسها من مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإنهم يعتمدون على نظام مناعي فطري قوي مع مجموعة هائلة من المركبات الكيميائية للتعامل مع الكائنات الحية الدقيقة والحيوانات المفترسة10. تشمل هذه الجزيئات مثبطات الببتيداز ، والتي تلعب أدوارا مهمة في العديد من الأنظمة البيولوجية ، بما في ذلك العمليات الخلوية لمناعة اللافقاريات ، مثل تخثر الدملمف ، وتوليف السيتوكينات والببتيدات المضادة للميكروبات ، وحماية المضيفين عن طريق تعطيل البروتياز من مسببات الأمراض مباشرة11. وبالتالي ، فإن مثبطات الببتيداز من اللافقاريات مثل الرخويات تمتلك تطبيقات طبية حيوية محتملة ، لكن العديد منها لا يزال غير مميز10،12،13. في هذا السياق ، هناك ما يقرب من 34 نوعا من الرخويات الأرضية في أونتاريو و 180 من رخويات المياه العذبة في كندا14. ومع ذلك ، لا يزال تنميطها وتوصيفها المتعمق محدودين15. تقدم هذه الكائنات فرصة لتحديد مركبات جديدة ذات نشاط مضاد للفطرياتمحتمل 10.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف طرق عزل وتوضيح المستخلصات من اللافقاريات (مثل الرخويات) (الشكل 1) متبوعة بقياس النشاط المثبط للببتيداز المفترض. ثم يتم تقييم الخصائص المضادة للفطريات لهذه المستخلصات عن طريق قياس تأثيرها على إنتاج عامل ضراوة C. neoformans باستخدام مقايسات النمط الظاهري (الشكل 2). من المهم ملاحظة أن الاختلافات في الخصائص المضادة للفطريات بين المستخلصات الخام والموضحة قد تكون مؤشرا على العوامل الميكروبية (على سبيل المثال ، المستقلبات الثانوية أو السموم التي ينتجها الميكروبيوم المضيف) للرخويات ، والتي قد تؤثر على الملاحظات التجريبية. تدعم هذه النتائج الحاجة إلى هذا البروتوكول لتقييم كل من المستخلصات الخام والموضحة بشكل مستقل لكشف طرق العمل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عملية الاستخراج غير متحيزة وقد تمكن من اكتشاف الخصائص المضادة للميكروبات ضد عدد كبير من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق لتحديد أولويات أنواع الرخويات ذات الخصائص المضادة للفطريات ضد C. neoformans وفرصة لتقييم الروابط بين النشاط الأنزيمي وإنتاج عامل الفوعة من خلال آليات مثبطة مفترضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استخراج البروتين من الرخويات
- جمع الرخويات من منطقة طبيعية محددة ومعتمدة (على سبيل المثال ، نهر سبيد ، جيلف ، أونتاريو). في هذه الدراسة ، تم اختيار كل من الأنواع المحلية والغازية لتقييم مجموعة واسعة من التأثيرات المضادة للفطريات المحتملة.
- اكسر قشرة الرخويات برفق (على سبيل المثال ، Cepaea nemoralis و Planorbella pilsbryi و Cipangopaludina chinensis) باستخدام مدقة وملاط ، وقم بإزالة القطع الصلبة بزوج من الملقط. بشكل عام ، يتم تجميع 10 رخويات للاستخدام في جميع أنحاء البروتوكول.
- جمع ووزن الأعضاء. ما يقرب من 15-20 غرام من العينة هو الأمثل. استخدم المقص لتقطيع الأعضاء إلى قطع صغيرة بحجم 0.5-1 سم تقريبا.
- فلاش تجميد تشريح وقطع عينات الأعضاء مع النيتروجين السائل. ثم ، قم بطحن عينات الأعضاء إلى مسحوق ناعم باستخدام مدقة وقذائف هاون.
- أضف مسحوق عينة العضو (حوالي 15 جم) إلى 30 مل من الماء المقطر البارد (4 درجات مئوية) لتحقيق نسبة 1: 2 (وزن / حجم).
- صب 2 مل من العينة في أنابيب عالية التأثير سعة 2 مل. أضف مغرفة من حبات الفولاذ المقاوم للصدأ 3 مم (حوالي 500 ميكروغرام) إلى كل أنبوب ، وقم بالتجانس باستخدام خلاط (انظر جدول المواد) لمدة 3 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع كل المواد الطافية مع ماصة في أنبوب جديد 50 مل ، والتخلص من بيليه.
- قم بتعقيم المادة الطافية باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين العينات على الجليد ، وانتقل إلى بروتوكول التوضيح (القسم 2) ، حسب الاقتضاء.
ملاحظة: يمكن تجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها كمستخلصات خام.
2. توضيح مستخلص الرخويات
- ضع العينة الطافية من الخطوة 1.8 في حمام حراري على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات بسرعة عن طريق نقلها إلى دلو به ثلج لمدة 20 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي العينات عند 15000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب جديد سعة 50 مل ، وتخلص من الحبيبات. قم بتصفية العينات وتعقيمها باستخدام مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتخزينها على الجليد.
- حدد تركيز البروتين في العينات من الخطوة 1.8 (أي المستخلص الخام) والخطوة 2.2 (أي المستخلص الموضح) باستخدام مقايسة القياس الكمي (على سبيل المثال ، مقايسة حمض bicinchoninic17). نطاق تركيز البروتين الأمثل هو 4-8 مجم / مل.
- قم بتخزين العينات على الثلج لمدة تصل إلى 1 ساعة أو تجميدها في النيتروجين السائل ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
3. مقايسة النشاط المثبط
- قياس النشاط المثبط للمستخلصات الخام والموضحة باستخدام المقايسات الأنزيمية في ثلاث نسخ تقنية.
ملاحظة: يتكون كل اختبار إنزيمي من إنزيم (على سبيل المثال ، subtilisin A ، الذي يشارك في الفوعة الفطرية 16،17،18 ؛ عادة حوالي 1 × 10−9 مول / لتر للمقايسات القائمة على الكروموجينيك) ، ومخزن مؤقت ، وركيزة. يبدأ التفاعل عندما تواجه الركيزة الإنزيم. النشاط الأنزيمي يتناسب مع معدل تحويل الركيزة إلى المنتج. - تقييم تأثير تركيز الإنزيم (EC) على النشاط الأنزيمي (EA) حتى يتم الحصول على الاعتماد الخطي بين كلا المعلمتين. في الخطوات التالية، استخدم تركيز الإنزيم ضمن النطاق الخطي المقاس.
ملاحظة: يتم تفصيل الفحص الأنزيمي للببتيداز subtilisin A في الخطوات التالية. - احتضان مستخلصات بروتين الرخويات الخام (الخطوة 1.11) أو الموضحة (الخطوة 2.5) (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر تحتوي على 4 مجم / مل بروتين) مع 10 ميكرولتر من subtilisin A (التركيز المحدد من الخطوة 3.2) ، و 220 ميكرولتر من 100 mM Tris-HCl عند درجة الحموضة 8.6 (للتحكم ، أضف 230 ميكرولتر من محلول Tris دون إضافة المستخلص) لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا.
- أضف 10 ميكرولتر من N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide ، الركيزة للسبتيليزين A ، بتركيز نهائي قدره 1 Km (ثابت Michaelis-Menten ؛ 0.2 mM لهذه الركيزة مع subtilisin A) لحجم تفاعل نهائي يبلغ 250 ميكرولتر.
- قم بقياس النشاط الأنزيمي من خلال مراقبة مظهر المنتج بمرور الوقت عن طريق قراءة الكثافة الضوئية (OD) عند 405 نانومتر كل 15 ثانية لمدة 3 دقائق.
- تحديد النشاط الأنزيمي المتبقي عن طريق حساب نسبة النشاط الأنزيمي في وجود مستخلص الرخويات إلى ذلك في حالة عدم وجود المستخلص.
- إذا لوحظ نشاط مثبط (أي نشاط متبقي أقل من 1) ، فقم بقياس قيمة التركيز المثبط 50 (IC50) باستخدام مجموعة من تركيزات المستخلصات (على سبيل المثال ، سلسلة تخفيف مزدوجة من 200 ميكروغرام / مل إلى 1 ميكروغرام / مل) باتباع الطرق القياسية19.
4. تأثير مستخلصات الرخويات على نمو C. neoformans
- استخدم طرف ماصة 10 ميكرولتر لإدخال مستعمرة واحدة من C. neoformans var. grubii H99 من النوع البري (WT) في 5 مل من وسط مستخلص الخميرة - الببتون - سكر العنب (YPD) (10 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، 20 جم / لتر من الببتون ، و 20 جم / لتر سكر العنب ، درجة الحموضة 6.5) ، واحتضانها لمدة 16-18 ساعة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. إجراء التجربة في ثلاثية بيولوجية وتكرار تقني.
- اجمع 500 ميكرولتر من الثقافة في كوفيت ، وقم بقياس النمو من خلال قراءة OD عند 600 نانومتر. تمييع الثقافة باستخدام قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) المتوسطة إلى ODالنهائي 600 من 0.02.
- الخلايا المستزرعة المشتركة C. neoformans بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال ، سلسلة تخفيف ثلاثية من 440 ميكروغرام / مل إلى 15 ميكروغرام / مل بروتين) من المستخلصات (أي الخام والموضح). للقيام بذلك ، قم بخلط 10 ميكرولتر من المستخلصات مع 190 ميكرولتر من ثقافة C. neoformans المخففة (الخطوة 4.2) في لوحة 96 بئرا.
- قم بقياس النمو من خلال قراءة OD 600 باستخدام قارئ لوحة كل 15 دقيقة إلى 1 ساعة لمدة 72 ساعة عند200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
5. تأثير مستخلصات الرخويات على إنتاج الميلانين C. neoformans
- تحضير ألواح L-3،4-ثنائي هيدروكسي فينيل ألانين (L-DOPA).
- الأوتوكلاف 230 مل من 14 جم / لتر أجار ، واتركه يبرد حتى يصل إلى 50-60 درجة مئوية.
- أضف 3.25 مل من 1 M الجلايسين ، 7.35 مل من 1 M KH 2 PO 4 ، 2.5 مل من 1 M MgSO4.7H 2 O ، 0.6 مل من الجلوكوز 40٪ ، 70 ميكرولتر من 10 mM الثيامين ، و2.5مل من 100 mM L-DOPA (معقم بالمرشح) إلى أجار السائل.
- صب 15 مل من الخليط في أطباق بتري ، واتركها تجف لمدة 1 ساعة تقريبا في الظلام ، واحفظها في درجة حرارة 2-4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تأكد من رفع الأغطية جزئيا حتى يجف الآجار بشكل صحيح.
- تلقيح 5 مل من وسط YNB مع 50 ميكرولتر من C. ثقافة نيوفورمانس من الخطوة 4.1. احتضان لمدة 16-18 ساعة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
- قم بتدوير الخلايا على حرارة 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا 2x بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) عند درجة الحموضة 7.4.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS للوصول إلى تركيز نهائي قدره 106 خلايا / مل.
- تحضير سلسلة تخفيف (على سبيل المثال ، شقين) من مستخلصات الرخويات الخام والموضحة. وبالمثل ، قم بإعداد سلسلة تخفيف 10 أضعاف من خلايا C. neoformans (الخطوة 5.4) من 1 × 106 خلايا / مل إلى 1 × 10خلايا 1 / مل باستخدام PBS معقم في 96 لوحة بئر.
- انشر 200 ميكرولتر من المستخلصات على ألواح بتري التي تحتوي على أجار L-DOPA باستخدام مسحة ، واتركها تجف لمدة 15 دقيقة.
- ضع 5 ميكرولتر من المستنبتة من كل بئر على لوحة L-DOPA ، مع ترك 1 سم بين القطرات. اتركه يجف في الظلام لمدة 15 دقيقة.
- احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة لمدة 3-5 أيام ، والتقاط الصور كل 24 ساعة باستخدام كاميرا أو جهاز تصوير لوحة (على سبيل المثال ، الماسح الضوئي).
ملاحظة: يتم استخدام حالتين لدرجة الحرارة هنا لاستكشاف تأثير درجة الحرارة على التأثيرات المثبطة للنمو لمستخلصات الرخويات ، حيث تمثل 30 درجة مئوية درجات الحرارة البيئية و 37 درجة مئوية تمثل درجات الحرارة الفسيولوجية البشرية.
6. تأثير مستخلصات الرخويات على إنتاج كبسولات عديد السكاريد C. neoformans
- قم بإعداد وسط منخفض الحديد (LIM) كما هو موضح أدناه.
- قم بإذابة 5 جم من الراتنج المخلب (انظر جدول المواد) في 60 مل من الماء عالي النقاء ، وقم بتعبئته في عمود زجاجي (قطر 2 سم × طول 25 سم). اغسل العمود ب 100 مل من الماء ، وتخلص من الماء المجمع.
- قم بإعداد ماء منخفض الحديد (LI-water) عن طريق تمرير 2 لتر من الماء المعقم عالي النقاء عبر العمود المخلبي. قم بتخزين ماء LI في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- قم بإذابة 5 غرام من الجلوكوز في 100 مل من ماء LI. قم بإذابة 5 جم من L-asparagine في 200 مل من ماء LI في دورق منفصل.
- أضف ما يلي إلى 500 مل من ماء LI بالترتيب: 4.78 جم من HEPES ، و 0.4 جم من K 2 HPO 4 ،و 0.08 جم من MgSO4.7H 2 O ، و 1.85 جم من NaHCO3 ، و 0.25 جم من CaCl 2.2H2 O.
- اجمع بين الحلول من الخطوة 6.1.3 والخطوة 6.1.4. أضف 1 مل من 100 mM bathophenantrolinedisulfonic acid sodium salt (BPS) إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام 1 متر من المماسح الليزوية. أضف ماء LI إلى حجم نهائي قدره 1 لتر ، وقم بتصفية الوسط عن طريق تمريره عبر غشاء 0.22 ميكرومتر. أضف 100 ميكرولتر من الثيامين المعقم (4 مجم / مل) إلى الوسط.
- تلقيح 5 مل من وسط YNB مع 50 ميكرولتر من ثقافة C. neoformans من الخطوة 4.1. احتضان لمدة 16-18 ساعة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. استخدم هذه المزرعة لتلقيح 5 مل من LIM إلى تركيز نهائي قدره 105 خلايا / مل.
- أضف كميات مناسبة من مستخلصات الرخويات (على سبيل المثال ، تخفيف مزدوج أو الحجم المحدد من مقايسات الفوعة السابقة) للوصول إلى التركيزات المطلوبة. احتضان لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة مع أغطية مفكوكة. بعد الحضانة ، اجمع 1 مل من الخلايا ، واغسل 2x باستخدام PBS المعقم ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 1500 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الخلايا برفق في 1 مل من برنامج تلفزيوني. امزج الخلايا مع India Ink بنسبة 1: 1 (على سبيل المثال ، 4 ميكرولتر من الحبر الهندي مع 4 ميكرولتر من تعليق الخلية) فوق شريحة مجهر زجاجي. ضع غطاء أعلى الشريحة.
- تصور العينات باستخدام مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) مع هدف زيت 63x (انظر جدول المواد). اضبط التباين على تلقائي ، وركز يدويا باستخدام قرص المجهر. حدد جميع الصور وقم بتصديرها بتنسيق TIFF. لا حاجة لتطبيق المرشحات.
- باستخدام أداة المسطرة في ImageJ20 ، حدد نسبة الحجم الكلي للخلية (بما في ذلك الكبسولة) إلى حجم جسم الخلية.
7. تأثير مستخلصات الرخويات على إنتاج الأغشية الحيوية C. neoformans
- تلقيح 5 مل من وسط YNB مع 50 ميكرولتر من C. ثقافة نيوفورمانس من الخطوة 4.1. احتضان لمدة 16-18 ساعة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
- حصاد الخلايا من ثقافة 5 مل. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco إلى تركيز نهائي قدره 107 خلايا / مل.
- انقل 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الآبار الفردية للوحة معقمة من البوليسترين ذات قاع مسطح من 24 بئرا. استخدم الآبار مع الوسائط فقط كعنصر تحكم.
- أضف كميات مناسبة من مستخلصات الرخويات (على سبيل المثال ، تخفيف مزدوج أو الحجم المحدد من مقايسات الفوعة السابقة) للوصول إلى تركيز نهائي من 10-20 ميكروغرام / مل من البروتين. تأكد من أن حجم الاستخراج لا يزيد عن 10٪ من الحجم الكلي.
- لف الألواح بورق الألمنيوم (لتجنب تبخر الوسائط) ، واحتضانها لمدة 48 ساعة باستخدام حاضنة ثابتة عند 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية.
- باستخدام زجاجة أو موزع ، اغسل الآبار 2x بالماء المعقم ، واتركها تجف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول البنفسج البلوري 0.3٪ إلى كل بئر (بما في ذلك آبار التحكم المتوسطة فقط) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- اغسل الآبار جيدا 3 مرات بالماء المعقم (لن تتعطل الأغشية الحيوية أثناء الغسيل). أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في RT.
- انقل 75 ميكرولتر إلى لوحة جديدة ذات قاع مسطح 96 بئرا ، واقرأ OD550. تحديد تكوين الأغشية الحيوية على أنها (OD 550nm من العينة - OD550nm من الفراغ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتيح سير العمل الموصوف هنا عزل البروتينات والببتيدات من الرخويات ذات الخصائص المحتملة المضادة للضراوة ضد C. neoformans. وبالمثل ، فإن تقييم الأشكال المختلفة للمستخلصات (أي الخام والموضح) يسمح بشبه تنقية المركبات النشطة المحتملة ويدعم التقييم النهائي (مثل البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي). عادة ، ينتج سير عمل استخراج البروتين محاليل متجانسة بتركيزات بروتين من 4-8 مجم / مل. هنا ، توضح النتائج التمثيلية تقييم النشاط الأنزيمي والخصائص المضادة للفطريات لمستخلصات C. chinensis. كانت المستخلصات الخام والموضحة قادرة على تثبيط النشاط المحلل للبروتين للسوبتيليزين A (المرتبط بالفوعة في C. neoformans) (الشكل 3) ، مع قيم IC 50 تبلغ 5.3 ميكروغرام / مل و 4.53 ميكروغرام / مل ، على التوالي. تم اختبار نشاط مستخلصات C. chinensis بشكل أكبر ضد العمليات المرتبطة بإنتاج عامل ضراوة C. neoformans ، بما في ذلك نمو الفطريات ، وإنتاج الكبسولات والميلانين ، وتشكيل الأغشية الحيوية. كان هناك انخفاض كبير في نمو الفطريات عند 37 درجة مئوية في وجود الخام (الشكل 4 أ) وتوضيح (الشكل 4 ب) مستخلصات C. chinensis. والجدير بالذكر أنه لم تكن هناك تغييرات في إنتاج الكبسولات أو الميلانين في وجود مستخلصات C. chinensis الخام أو الموضحة (الشكل 4C ، D). ومع ذلك، لوحظ انخفاض كبير بنسبة 70٪ -80٪ في تكوين الأغشية الحيوية عند تركيزات عالية من الخام (الشكل 4E) والمستخلصات الموضحة (الشكل 4F) بالنسبة إلى المجموعة الضابطة غير المعالجة.
الشكل 1: سير العمل لاستخلاص البروتين الكلي من الرخويات. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الاستراتيجية العامة المستخدمة لتقييم آثار مستخلصات الرخويات على النشاط المحلل للبروتين والنمو وإنتاج عامل الفوعة في Cryptococcus neoformans. DIC = مجهر تباين التداخل التفاضلي. يشار إلى قياس الكثافة الضوئية بالطول الموجي بالنانومتر (نانومتر). تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لتأثيرات مستخلصات بروتين الرخويات على النشاط المحلل للبروتين للمستخلصات الخام ل subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis الخام. (ب) C. chinensis أوضح مقتطفات. تمثل كل نقطة متوسط ثلاث مكررات. تشير الأشرطة إلى الانحراف المعياري. IC50 = تركيز مثبط نصف الحد الأقصى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتأثيرات مستخلصات C. chinensis على إنتاج عامل الفوعة في C. neoformans. (أ، ب) نمو C. neoformans عند 37 درجة مئوية في وجود مستخلصات C. chinensis الخام والموضحة ، على التوالي. (ج) صور مجهرية لمدينة دبي للإنترنت ل C. neoformans تظهر إنتاج الكبسولة في وجود مستخلصات خام (50 ميكروغرام / مل) ومستخلصات موضحة (40 ميكروغرام / مل). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (د) إنتاج الميلانين من C. neoformans في وجود مستخلصات خام (440 ميكروغرام / مل) وموضح (410 ميكروغرام / مل) عند 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية. (E,F) تكوين الأغشية الحيوية النسبية ل C. neoformans في وجود مستخلصات خام ومستخلصات موضحة ، على التوالي. للتحليل الإحصائي ، تم إجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه واختبار مقارنة Dunnett المتعدد. * ص < 0.05 ؛ ** ع < 0.01 ؛ و **** p < 0.0001. تقابل كل قيمة في المتوسط ما لا يقل عن خمس مكررات بيولوجية ونسختين تقنيتين. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. تمثل صور الميلانين المعروضة ثلاث نسخ بيولوجية مكررة ونسختين تقنيتين. تمثل صور الكبسولة المعروضة 40-50 خلية لكل حالة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحدد بروتوكول الاستخراج الموصوف هنا عزل المركبات من الرخويات التي تم جمعها من أونتاريو ، كندا ، ويوضح تحقيقا جديدا في استخدام مستخلصات الرخويات ضد العامل الممرض الفطري البشري ، C. neoformans. يضيف هذا البروتوكول إلى مجموعة متزايدة من الأبحاث التي تبحث في نشاط مثبطات الببتيداز من اللافقاريات13. أثناء الاستخراج ، كان من الصعب ترشيح وتعقيم بعض عينات الاستخراج ، ربما بسبب وجود السكريات القابلة للذوبان و / أو الأصباغ التي أعاقت غشاء المرشح. للتغلب على هذا القيد ، يوصى بالترشيح أولا من خلال غشاء 5 ميكرومتر لاستبعاد المركبات الكبيرة (على سبيل المثال ، أغشية الخلايا المعطلة ، الحمض النووي للجينوم) ، مما يسمح للبروتينات بالمرور عبر المرشح ، ثم التصفية مرة أخرى من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر. هذه الخطوات ضرورية للبروتوكول لأنها تقيد وجود الميكروبات التي قد تلوث العينات وتتداخل مع التجارب النهائية.
خلال هذا التحقيق ، تم الكشف عن مثبطات الببتيداز ضد subtilisin A ، وهو إنزيم نموذجي لعائلة S8 من subtilisin. يتم توزيع أعضاء عائلة الإنزيم هذه على نطاق واسع بين الكائنات الحية ولهم أدوار مختلفة ، كما هو الحال في معالجة البروتين والتغذية وآليات الفوعة21،22 ، والتي تدعم تأثيرات النمط الظاهري التي لوحظت في هذه الدراسة. على سبيل المثال ، لوحظ انخفاض كبير في نمو الفطريات في وجود كل من المستخلصات الخام والموضحة وبتركيزات عالية ومنخفضة نسبيا ، مما يشير إلى أن النشاط المثبط كان قويا في النموذج المختبر. من الجدير بالذكر أنه عند قياس OD باستخدام قارئ لوحة ، تسبب وجود المستخلصات في تكتل الخلايا الفطرية في قاع البئر ، مما يتداخل مع قياس النمو. يمكن التغلب على هذا القيد باستخدام حاضنة اهتزاز عالية السرعة (على سبيل المثال ، 900 دورة في الدقيقة) ، والتي من شأنها تجنب تكتل الخلايا.
قد توجد قيود تقنية أخرى قد تؤثر على ملاحظات النمط الظاهري المتوقعة. على سبيل المثال ، ترتبط الببتيدات الشبيهة ب subtilisin بتخليق الميلانين واستشعار النصاب في C. neoformans ، لكن المستخلصات الخام أو الموضحة من أي رخويات لا تظهر تأثيرات كبيرة على إنتاج الميلانين16،17،18. ربما يرجع ذلك إلى التأثير الوقائي الطبيعي للميلانين والكبسولة ضد العوامل الخارجية ، مما قد يمنع مستخلصات الرخويات من التأثير على المكونات داخل الخلايا للفطريات. تشمل العوامل المهمة التي يجب مراعاتها عند العمل مع الركائز العضوية الحاجة إلى إذابتها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، مما قد يمثل مشكلات في الذوبان داخل صفيحة أجار (كما هو مستخدم في مقايسات الميلانين). للتغلب على هذه المشكلة ، قد تنتشر المستخلصات على طول سطح صفيحة أجار وتترك لتجف قبل اكتشاف الخلايا الفطرية على اللوحة.
وأظهرت الأعمال السابقة قابلية الأغشية الحيوية لبكتيريا C. neoformans لعاملين مضادين للفطريات في المختبر، بما في ذلك الأمفوتريسين B و caspofungin؛ ومع ذلك ، كان الفطر مقاوما للفلوكونازول وفوريكونازول23. ونظرا لأهمية الأغشية الحيوية الفطرية في الفوعة ومقاومة مضادات الميكروبات، فإن الكشف عن استراتيجيات جديدة للتدخل في تكوين الأغشية الحيوية أو تعطيلها سيكون ذا قيمة. في الدراسة الحالية ، أضعفت المستخلصات الخام والموضحة من C. chinensis تكوين الأغشية الحيوية لخلايا المكورات العقدية مع سلوك استجابة الجرعة الواضح. وتدعم هذه النتائج تأثير النهج وحداثته. والجدير بالذكر أن تكوين الأغشية الحيوية الرقيقة قد تم تثبيطه إلى حد كبير عند المعالجة بالخام مقارنة بالمستخلص الموضح ، والذي قد يكون بسبب فقدان المركبات المثبطة أثناء عملية التوضيح أو انخفاض الوظيفة المثبطة في ظل الظروف المختبرة. من الممكن أن تكون البروتينات المسؤولة عن هذه التأثيرات المثبطة ذات وزن جزيئي مرتفع وفقدت أثناء عملية التوضيح أو كانت عرضة للتدهور أثناء المعالجة الحرارية. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية استخدام كل من المستخلصات الخام والموضحة للكشف عن التغيرات في الوظائف المثبطة ، حيث أن الاختلافات المتعلقة بمصدر المثبط قد تؤثر على النتيجة.
بشكل عام ، يتيح هذا البروتوكول استخراج المركبات من الرخويات وقياس النشاط المثبط المفترض ضد الببتيداز المختار مع أدوار مثبتة في الفوعة الفطرية. في هذا البروتوكول ، تم تقييم الغلة العالية والنشاط المثبط القوي للببتيداز للمستخلصات وتأثيرها ضد نمو C. neoformans وتكوين الأغشية الحيوية. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من التجارب ، تؤكد هذه النتائج على أهمية الرخويات كمصادر جديدة مفترضة للمركبات ضد هذا العامل الفطري الخطير. علاوة على ذلك ، بينما يركز هذا البروتوكول على استخلاص المثبطات من الرخويات ، فإن المنهجية قابلة للتكيف مع اللافقاريات الأخرى ويمكن استخدامها لتقييم تأثير المثبطات المشتقة من اللافقاريات المختلفة على إنتاج عامل الفوعة في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك الفطريات والبكتيريا24،25،26 . في نهاية المطاف ، يمكن أن يؤدي استخراج المركبات من المصادر الطبيعية إلى زيادة ذخيرة العوامل المضادة للميكروبات الجديدة المفترضة ، وبالتالي تحسين قدراتنا على مكافحة الأمراض المعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر Geddes-McAlister على دعمهم القيم طوال هذا التحقيق وملاحظاتهم على المخطوطة. يقر المؤلفون بدعم التمويل من منحة أونتاريو للدراسات العليا وجائزة أبحاث الدراسات العليا الدولية - جامعة جيلف إلى D. G.-G ومن المؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) ووزارة أونتاريو للكليات والجامعات - جائزة الباحث المبكر ل J. G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
