Summary
De menselijke schimmelpathogeen Cryptococcus neoformans produceert een verscheidenheid aan virulentiefactoren (bijv. Peptidases) om zijn overleving in de gastheer te bevorderen. Milieuniches vormen een veelbelovende bron van nieuwe natuurlijke peptidaseremmers. Dit protocol schetst de bereiding van extracten van weekdieren en de beoordeling van hun effect op de productie van schimmelvirulentiefactoren.
Abstract
Cryptococcus neoformans is een ingekapselde menselijke schimmelpathogeen met een wereldwijde verspreiding die voornamelijk immuungecompromitteerde individuen infecteert. Het wijdverbreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische omgevingen, hun gebruik in de landbouw en stamhybridisatie hebben geleid tot een verhoogde evolutie van resistentie. Deze stijgende mate van resistentie tegen antischimmelmiddelen is een groeiende zorg onder clinici en wetenschappers over de hele wereld, en er is een verhoogde urgentie om nieuwe antischimmeltherapieën te ontwikkelen. C. neoformans produceert bijvoorbeeld verschillende virulentiefactoren, waaronder intra- en extracellulaire enzymen (bijv. Peptidasen) met rollen in weefselafbraak, cellulaire regulatie en verwerving van voedingsstoffen. De verstoring van dergelijke peptidase-activiteit door remmers verstoort schimmelgroei en -proliferatie, wat suggereert dat dit een belangrijke strategie kan zijn om de ziekteverwekker te bestrijden. Belangrijk is dat ongewervelde dieren zoals weekdieren peptidaseremmers produceren met biomedische toepassingen en antimicrobiële activiteit, maar ze zijn onderbelicht in termen van hun gebruik tegen schimmelpathogenen. In dit protocol werd een wereldwijde extractie uit weekdieren uitgevoerd om potentiële peptidaseremmers in ruwe en geklaarde extracten te isoleren, en hun effecten tegen klassieke cryptokokkenvirulentiefactoren werden beoordeeld. Deze methode ondersteunt de prioritering van weekdieren met schimmelwerende eigenschappen en biedt mogelijkheden voor de ontdekking van antivirulentiemiddelen door gebruik te maken van de natuurlijke remmers die in weekdieren worden aangetroffen.
Introduction
Cryptococcus neoformans is een menselijke schimmelpathogeen die ernstige ziekten veroorzaakt bij immuungecompromitteerde gastheren, zoals personen die leven met HIV / AIDS1, en leidt tot ongeveer 19% van de AIDS-gerelateerde sterfgevallen2. De schimmel is gevoelig voor verschillende klassen van antischimmelmiddelen, waaronder azolen, polyenen en flucytosine, die fungicide en fungistatische activiteit uitoefenen met behulp van verschillende mechanismen 3,4. Het uitgebreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische en agrarische omgevingen in combinatie met stamhybridisatie heeft echter de evolutie van resistentie bij meerdere schimmelsoorten, waaronder C. neoformans5, versterkt.
Om de uitdagingen van antischimmelresistentie te overwinnen en de prevalentie van schimmelinfecties op wereldwijde schaal te verminderen, is een veelbelovende aanpak om de virulentiefactoren van Cryptococcus spp. (bijv. Temperatuuraanpassingsvermogen, polysaccharidecapsule, melanine en extracellulaire enzymen) te gebruiken als potentiële therapeutische doelen 4,6 . Deze aanpak heeft verschillende voordelen, omdat deze virulentiefactoren goed worden gekarakteriseerd in de literatuur, en het richten op deze factoren zou mogelijk de snelheid van antischimmelresistentie kunnen verminderen door een zwakkere selectieve druk op te leggen door de virulentie te verminderen in plaats van zich te richten op celgroei6. In deze context hebben talrijke studies de mogelijkheid beoordeeld om zich te richten op extracellulaire enzymen (bijv. Proteasen, peptidasen) om de virulentie van Cryptococcus spp.7,8,9 te verminderen of te remmen.
Organismen zoals ongewervelde dieren en planten beschikken niet over een adaptief immuunsysteem om zichzelf te beschermen tegen ziekteverwekkers. Ze vertrouwen echter op een sterk aangeboren immuunsysteem met een immens scala aan chemische verbindingen om micro-organismen en roofdieren aan te pakken10. Deze moleculen omvatten peptidaseremmers, die een belangrijke rol spelen in veel biologische systemen, waaronder de cellulaire processen van ongewervelde immuniteit, zoals de coagulatie van hemolymfe, de synthese van cytokines en antimicrobiële peptiden, en de bescherming van gastheren door de proteasen van pathogenen direct te inactiveren11. Peptidaseremmers van ongewervelde dieren zoals weekdieren hebben dus potentiële biomedische toepassingen, maar velen blijven onkarakteriseerd10,12,13. In deze context zijn er ongeveer 34 soorten landweekdieren in Ontario en 180 zoetwaterweekdieren in Canada14. Hun diepgaande profilering en karakterisering zijn echter nog steeds beperkt15. Deze organismen bieden een kans voor de identificatie van nieuwe verbindingen met potentiële antischimmelactiviteit10.
In dit protocol worden methoden beschreven om extracten van ongewervelde dieren (bijv. weekdieren) te isoleren en te verduidelijken (figuur 1), gevolgd door het meten van de vermeende peptidase-remmende activiteit. De antischimmeleigenschappen van deze extracten worden vervolgens beoordeeld door hun impact op de virulentiefactorproductie van C. neoformans te meten met behulp van fenotypische assays (figuur 2). Het is belangrijk op te merken dat verschillen in antischimmeleigenschappen tussen ruwe en geklaarde extracten indicatief kunnen zijn voor microbiële factoren (bijv. Secundaire metabolieten of toxines geproduceerd door het gastheermicrobioom) van het weekdier, die experimentele observaties kunnen beïnvloeden. Dergelijke bevindingen ondersteunen de noodzaak voor dit protocol om zowel ruwe als geklaarde extracten onafhankelijk te beoordelen om de werkingsmechanismen te ontrafelen. Bovendien is het extractieproces onbevooroordeeld en kan het de detectie van antimicrobiële eigenschappen tegen een overvloed aan schimmel- en bacteriële pathogenen mogelijk maken. Daarom biedt dit protocol een initiatiepunt voor de prioritering van weekdiersoorten met schimmelwerende eigenschappen tegen C. neoformans en een mogelijkheid om de verbindingen tussen enzymatische activiteit en virulentiefactorproductie te evalueren door middel van vermeende remmende mechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Eiwitextractie uit weekdieren
- Verzamel weekdieren uit een aangewezen en goedgekeurd natuurgebied (bijv. Speed River, Guelph, Ontario). Voor deze studie werden zowel inheemse als invasieve soorten geselecteerd om een breed scala aan potentiële antischimmeleffecten te beoordelen.
- Breek voorzichtig de schaal van de weekdieren (bijv. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi en Cipangopaludina chinensis) met behulp van een stamper en vijzel en verwijder de vaste stukken met een pincet. Over het algemeen worden 10 weekdieren samengevoegd voor gebruik in het hele protocol.
- Verzamel en weeg de organen. Ongeveer 15-20 g monster is optimaal. Gebruik een schaar om de organen in kleine stukjes van ongeveer 0,5-1 cm groot te knippen.
- Vries de ontleedde en gesneden orgaanmonsters met vloeibare stikstof in met flash-vries. Maal vervolgens de orgaanmonsters tot een fijn poeder met behulp van een stamper en vijzel.
- Voeg het orgaanmonsterpoeder (ongeveer 15 g) toe aan 30 ml koud gedestilleerd water (4 °C) om een verhouding van 1:2 (g/v) te bereiken.
- Giet 2 ml van het monster in krachtige buizen van 2 ml. Voeg een schep van 3 mm roestvrijstalen kralen (ongeveer 500 μg) toe aan elke buis en homogeniseer met behulp van een blender (zie materiaaltabel) gedurende 3 minuten bij 1.200 tpm en 4 °C.
- Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verzamel alle supernatanten met een pipet in een verse buis van 50 ml en gooi de pellet weg.
- Filtersteriliseer het supernatant met behulp van een membraan van 0,22 μm. Bewaar de monsters op ijs en ga verder met het zuiveringsprotocol (sectie 2), indien van toepassing.
OPMERKING: De monsters kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij −20 °C om te worden gebruikt als ruwe extracten.
2. Verduidelijking van het weekdierextract
- Plaats het supernatantmonster van stap 1.8 gedurende 30 minuten in een thermaal bad bij 60 °C. Koel de monsters vervolgens snel af door ze gedurende 20 minuten over te brengen in een emmer met ijs.
- Centrifugeer de monsters gedurende 45 minuten bij 45 °C bij 15.000 × g . Verzamel het supernatant in een verse buis van 50 ml en gooi de pellet weg. Filtersteriliseer de monsters met een membraanfilter van 0,22 μm en bewaar ze vervolgens op ijs.
- Bepaal de eiwitconcentratie in de monsters van stap 1.8 (d.w.z. het ruwe extract) en stap 2.2 (d.w.z. het geklaarde extract) met behulp van een kwantificeringstest (bijv. bicinchoninezuurtest17). Het optimale eiwitconcentratiebereik is 4-8 mg / ml.
- Bewaar de monsters maximaal 1 uur op ijs of bevries ze in vloeibare stikstof en bewaar ze bij −20 °C totdat ze nodig zijn.
3. Remmende activiteitstest
- Meet de remmende activiteit van de ruwe en geklaarde extracten met behulp van enzymatische assays in technisch drievoud.
OPMERKING: Elke enzymatische test bestaat uit een enzym (bijv. subtilisine A, dat betrokken is bij schimmelvirulentie 16,17,18; meestal ongeveer 1 x 10−9 mol / L voor chromogene assays), een buffer en een substraat. De reactie begint wanneer het substraat het enzym tegenkomt. De enzymatische activiteit is evenredig met de snelheid van substraatomzetting in het product. - Beoordeel het effect van enzymconcentratie (EC) op enzymatische activiteit (EA) totdat lineaire afhankelijkheid tussen beide parameters is verkregen. Gebruik voor de volgende stappen een enzymconcentratie binnen het gemeten lineaire bereik.
OPMERKING: De enzymatische test voor de peptidase subtilisine A wordt gedetailleerd beschreven in de volgende stappen. - Incubeer de ruwe (stap 1.11) of geklaarde (stap 2.5) weekdiereiwitextracten (bijv. 10 μL met 4 mg/ml eiwit) met 10 μL subtilisine A (concentratie bepaald vanaf stap 3.2) en 220 μL 100 mM Tris-HCl bij pH 8,6 (voeg voor de controle 230 μL Tris-buffer toe zonder toevoeging van het extract) gedurende 10 minuten bij 25 °C in een 96-well vlakbodemplaat.
- Voeg 10 μL N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, het substraat voor subtilisine A, toe in een eindconcentratie van 1 K m (Michaelis-Menten constante; 0,2mM voor dit substraat met subtilisine A) voor een eindreactievolume van 250 μL.
- Meet de enzymatische activiteit door het uiterlijk van het product in de loop van de tijd te controleren door de optische dichtheid (OD) bij 405 nm elke 15 s gedurende 3 minuten af te lezen.
- Bepaal de resterende enzymatische activiteit door de verhouding te berekenen tussen de enzymatische activiteit in aanwezigheid van het weekdierextract en die in afwezigheid van het extract.
- Als remmende activiteit wordt waargenomen (d.w.z. restactiviteit lager dan 1), meet dan de remmende concentratie 50 (IC50) met behulp van een reeks concentraties van de extracten (bv. een tweevoudige verdunningsreeks van 200 μg/ml tot 1 μg/ml) volgens standaardmethode19.
4. Effect van weekdierextracten op de groei van C. neoformans
- Gebruik een pipetpunt van 10 μL om een enkele kolonie C. neoformans var. grubii H99 wild-type (WT) in 5 ml gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium (10 g / L gistextract, 20 g / L pepton en 20 g / L dextrose, pH 6,5) te introduceren en incubeer gedurende 16-18 uur bij 30 °C en 200 tpm. Voer het experiment uit in biologisch drievoud en technisch duplicaat.
- Verzamel 500 μL van de cultuur in een cuvette en meet de groei door de OD bij 600 nm af te lezen. Verdun de cultuur met giststikstofbase (YNB) medium tot een uiteindelijke OD600 van 0,02.
- Co-cultuur C. neoformans cellen met verschillende concentraties (bijv. een drievoudige verdunningsreeks van 440 μg / ml tot 15 μg / ml eiwit) van de extracten (d.w.z. ruw en geklaard). Meng hiervoor 10 μL van de extracten met 190 μL van de verdunde C. neoformans-cultuur (stap 4.2) in een plaat met 96 putten.
- Meet de groei door de OD 600 af te lezen met behulp van een plaatlezer om de 15 minuten tot 1 uur gedurende 72 uur bij200 tpm en 37 °C.
5. Effect van weekdierextracten op de melanineproductie van C. neoformans
- Bereid L-3,4-dihydroxyfenylalanine (levodopa) platen.
- Autoclaaf 230 ml van 14 g/L agar en laat afkoelen tot het 50-60 °C bereikt.
- Voeg 3,25 ml 1 M glycine, 7,35 ml 1 M KH 2 PO 4, 2,5 ml 1 M MgSO4,7 H 2 O, 0,6 ml 40% glucose, 70 μl 10 mM thiamine en 2,5ml 100 mM L-DOPA (filter-gesteriliseerd) toe aan de vloeibare agar.
- Giet 15 ml van het mengsel in petriplaten, laat ze ongeveer 1 uur in het donker drogen en bewaar ze bij 2-4 °C gedurende maximaal 1 week. Zorg ervoor dat de deksels gedeeltelijk zijn opgetild zodat de agar goed kan drogen.
- Ent 5 ml YNB-medium met 50 μL C. neoformans-cultuur uit stap 4.1. Incubeer gedurende 16-18 uur bij 30 °C en 200 tpm.
- Draai de cellen bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Was de cellen 2x met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Resuspendeer de cellen in 1 ml PBS om een uiteindelijke concentratie van 106 cellen / ml te bereiken.
- Bereid een verdunningsreeks (bijvoorbeeld tweevoudig) van de ruwe en geklaarde weekdierextracten. Bereid op dezelfde manier een 10-voudige verdunningsreeks C. neoformans-cellen (stap 5.4) voor van 1 x 106 cellen / ml tot 1 x 101 cellen / ml met behulp van steriele PBS in 96-putplaten.
- Verdeel 200 μL van de extracten over petriplaten met levodopagar met behulp van een wattenstaafje en laat ze 15 minuten drogen.
- Spot 5 μL cultuur van elke put op de levodopaplaat en laat 1 cm tussen de druppels. Laat het in het donker 15 min drogen.
- Incubeer de platen bij 30 °C en 37 °C in een statische incubator gedurende 3-5 dagen, waarbij elke 24 uur beelden worden vastgelegd met een camera of plaatbeeldcamera (bijv. scanner).
OPMERKING: Twee temperatuurcondities worden hier gebruikt om de invloed van temperatuur op de groeiremmende effecten van de weekdierextracten te onderzoeken, waarbij 30 °C de omgevingstemperatuur vertegenwoordigt en 37 °C de menselijke fysiologische temperaturen.
6. Effect van weekdierextracten op de productie van C . neoformans polysaccharidecapsules
- Bereid ijzerarm medium (LIM) zoals hieronder beschreven.
- Los 5 g chelaathars (zie materiaaltabel) op in 60 ml ultrapuur water en verpak in een glazen kolom (2 cm diameter x 25 cm lengte). Was de kolom met 100 ml water en gooi het verzamelde water weg.
- Bereid ijzerarm water (LI-water) door 2 L steriel ultrapuur water door de chelaatvormende kolom te laten lopen. Bewaar het LI-water bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Los 5 g glucose op in 100 ml LI-water. Los 5 g L-asparagine op in 200 ml LI-water in een apart bekerglas.
- Voeg het volgende toe aan 500 ml LI-water in volgorde: 4,78 g HEPES, 0,4 g K 2 HPO 4,0,08 g MgSO4,7H 2 O, 1,85 g NaHCO3 en 0,25 g CaCl 2,2H 2 O.
- Combineer de oplossingen uit stap 6.1.3 en stap 6.1.4. Voeg 1 ml 100 mM bathofenantrolinedisulfonzuur natriumzout (BPS) toe aan een eindconcentratie van 100 μM.
- Stel de pH in op 7,2 met 1 M LI-MOPS. Voeg LI-water toe aan een eindvolume van 1 L en filter het medium door het door een membraan van 0,22 μm te laten gaan. Voeg 100 μL steriele thiamine (4 mg/ml) toe aan het medium.
- Ent 5 ml YNB-medium met 50 μL van de C. neoformans-cultuur uit stap 4.1. Incubeer gedurende 16-18 uur bij 30 °C en 200 tpm. Gebruik deze cultuur om 5 ml LIM te enten tot een uiteindelijke concentratie van 105 cellen / ml.
- Voeg de juiste volumes van de weekdierextracten toe (bijvoorbeeld een dubbele verdunning of het volume bepaald op basis van eerdere virulentietests) om de gewenste concentraties te bereiken. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 °C en 200 tpm met losgemaakte doppen. Verzamel na incubatie 1 ml cellen en was 2x met steriele PBS, pH 7,4, bij 1.500 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 ml PBS. Meng de cellen met India Ink in een verhouding van 1:1 (bijv. 4 μL India Ink met 4 μL celsuspensie) over een glazen microscoopglaasje. Plaats een coverslip bovenop de glijbaan.
- Visualiseer de monsters met behulp van een differentiële interferentiecontrast (DIC) microscoop met een 63x olieobjectief (zie materiaaltabel). Stel het contrast in op automatisch en stel handmatig scherp met behulp van de microscoopknop. Selecteer alle afbeeldingen en exporteer ze in TIFF-indeling. Er hoeven geen filters te worden toegepast.
- Kwantificeer met het gereedschap liniaal in AfbeeldingJ 20 de verhouding tussen de totale celgrootte (inclusief de capsule) en de lichaamsgrootte van de cel.
7. Effect van weekdierextracten op de biofilmproductie van C. neoformans
- Ent 5 ml YNB-medium met 50 μL C. neoformans-cultuur uit stap 4.1. Incubeer gedurende 16-18 uur bij 30 °C en 200 tpm.
- Oogst cellen uit de 5 ml cultuur. Was de cellen met steriele PBS, pH 7,4, bij 1.500 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Resuspendeer de cellen in 3 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) tot een uiteindelijke concentratie van 107 cellen / ml.
- Breng 300 μL van de celsuspensie over in de afzonderlijke putjes van een steriele, polystyreen plaat met een vlakke bodem van 24 putten. Gebruik putten met media alleen als controle.
- Voeg de juiste volumes van de weekdierextracten toe (bijvoorbeeld een tweevoudige verdunning of het volume bepaald met eerdere virulentietests) om een eindconcentratie van 10-20 μg / ml eiwit te bereiken. Zorg ervoor dat het extractvolume niet groter is dan 10% van het totale volume.
- Wikkel de platen met aluminiumfolie (om mediaverdamping te voorkomen) en incubeer gedurende 48 uur met behulp van een statische incubator bij 30 °C en 37 °C.
- Was de putjes met een fles of dispenser 2x met steriel water en laat ze 10-15 min aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 100 μL 0,3% kristalvioletoplossing toe aan elke put (inclusief de medium-only controleputten) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de putjes 3x grondig met steriel water (de biofilms worden niet verstoord tijdens het wassen). Voeg 200 μL 100% ethanol toe en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Breng 75 μL over op een nieuwe 96-well vlakbodemplaat en lees de OD550. Kwantificeer de biofilmvorming als (OD 550nm van monster - OD550nm van blanco).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hierin beschreven workflow maakt de isolatie mogelijk van eiwitten en peptiden uit weekdieren met potentiële antivirulentie-eigenschappen tegen C. neoformans. Evenzo maakt het beoordelen van verschillende vormen van extracten (d.w.z. ruw en geklaard) de semi-zuivering van de potentiële actieve verbindingen mogelijk en ondersteunt het downstream-beoordeling (bijv. Op massaspectrometrie gebaseerde proteomica). Doorgaans produceert de eiwitextractieworkflow gehomogeniseerde oplossingen met eiwitconcentraties van 4-8 mg / ml. Hier tonen de representatieve resultaten de beoordeling van de enzymatische activiteit en schimmelwerende eigenschappen van C. chinensis-extracten. De ruwe en geklaarde extracten waren in staat om de proteolytische activiteit van subtilisine A (gerelateerd aan virulentie in C. neoformans) te remmen (figuur 3), met IC 50-waarden van respectievelijk 5,3 μg / ml en4,53 μg / ml. De activiteit van de C. chinensis-extracten werd verder getest tegen processen die verband houden met de virulentiefactorproductie van C. neoformans, waaronder schimmelgroei, capsule- en melanineproductie en de vorming van biofilms. Er was een significante vermindering van de schimmelgroei bij 37 °C in aanwezigheid van de ruwe (figuur 4A) en geklaarde (figuur 4B) C. chinensis-extracten. Met name waren er geen veranderingen in de productie van capsules of melanine in de aanwezigheid van ruwe of geklaarde C. chinensis-extracten (figuur 4C, D). Er werd echter een significante vermindering van 70%-80% in biofilmvorming waargenomen bij hoge concentraties van de ruwe (figuur 4E) en geklaarde (figuur 4F) extracten ten opzichte van de onbehandelde controle.
Figuur 1: Workflow voor totale eiwitextractie uit weekdieren. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Algemene strategie die wordt gebruikt om de effecten van weekdierextracten op proteolytische activiteit, groei en virulentiefactorproductie in Cryptococcus neoformans te beoordelen. DIC = differentiële interferentie contrast microscopie. Optische dichtheidsmeting aangegeven met de golflengte in nanometers (nm). Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van de effecten van weekdiereiwitextracten op de proteolytische activiteit van subtilisine A. (A) Cipangopaludina chinensis ruwe extracten. b) C. chinensis verduidelijkte extracten. Elk punt vertegenwoordigt het gemiddelde van drie replicaties. Balken geven de standaardafwijking aan. IC50 = half-maximale remmende concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van de effecten van C. chinensis-extracten op de virulentiefactorproductie bij C. neoformans. (A,B) Groei van C. neoformans bij 37 °C in aanwezigheid van respectievelijk ruwe en geklaarde C. chinensis-extracten. (C) DIC-microscopiebeelden van C. neoformans die de capsuleproductie tonen in aanwezigheid van ruwe (50 μg/ml) en geklaarde (40 μg/ml) extracten. Schaalbalk = 10 μm. (D) Melineproductie van C. neoformans in aanwezigheid van ruwe (440 μg/ml) en geklaarde (410 μg/ml) extracten bij 30 °C en 37 °C. (E,F) Relatieve biofilmvorming van C. neoformans in aanwezigheid van respectievelijk ruwe en geklaarde extracten. Voor statistische analyse werden een eenrichtings-ANOVA-test en een Dunnett's meervoudige vergelijkingstest uitgevoerd. *p < 0,05; **p < 0,01; en ****p < 0,0001. Elke waarde komt overeen met een gemiddelde van ten minste vijf biologische replicaten en twee technische replicaties. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De getoonde melaninebeelden zijn representatief voor drie biologische replicaties en twee technische replicaties. De getoonde capsulebeelden zijn representatief voor 40-50 cellen per aandoening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven extractieprotocol schetst de isolatie van verbindingen uit weekdieren verzameld uit Ontario, Canada, en toont een nieuw onderzoek naar het gebruik van weekdierextracten tegen de menselijke schimmelpathogeen, C. neoformans. Dit protocol draagt bij aan een groeiend aantal onderzoeken naar de activiteit van peptidaseremmers van ongewervelde dieren13. Tijdens de extractie waren sommige extractmonsters moeilijk te filteren-steriliseren, mogelijk vanwege de aanwezigheid van oplosbare polysacchariden en / of pigmenten die het filtermembraan belemmerden. Om deze beperking te overwinnen, wordt aanbevolen om eerst door een membraan van 5 μm te filteren om grote verbindingen (bijv. Verstoorde celmembranen, genoom-DNA) uit te sluiten, waardoor de eiwitten door het filter kunnen gaan en vervolgens opnieuw door een membraan van 0,22 μm kunnen filteren. Deze stappen zijn van cruciaal belang voor het protocol omdat ze de aanwezigheid van microben beperken die de monsters kunnen besmetten en stroomafwaartse experimenten kunnen verstoren.
Tijdens dit onderzoek werden peptidaseremmers gedetecteerd tegen subtilisine A, een modelenzym voor de S8-familie van subtilisine. Leden van deze enzymfamilie zijn wijd verspreid over organismen en hebben verschillende rollen, zoals in eiwitverwerking, voeding en virulentiemechanismen21,22, die de fenotypische effecten ondersteunen die in deze studie zijn waargenomen. Er werd bijvoorbeeld een significante vermindering van de schimmelgroei waargenomen in de aanwezigheid van zowel ruwe als geklaarde extracten en bij relatief hoge en lage concentraties, wat suggereert dat de remmende activiteit robuust was in het geteste model. Het is opmerkelijk dat bij het meten van de OD met een plaatlezer, de aanwezigheid van de extracten klontering van de schimmelcellen op de bodem van de put veroorzaakte, waardoor de groeimeting werd verstoord. Deze beperking kan worden overwonnen door gebruik te maken van een high-speed schudincubator (bijv. 900 rpm), die celklontering zou voorkomen.
Er kunnen andere technische beperkingen bestaan die de verwachte fenotypische waarnemingen kunnen beïnvloeden. Subtilisine-achtige peptidasen zijn bijvoorbeeld geassocieerd met melaninesynthese en quorumdetectie in C. neoformans, maar de ruwe of geklaarde extracten van weekdieren vertonen geen significante effecten op de melanineproductie16,17,18. Dit is mogelijk te wijten aan het natuurlijke beschermende effect van melanine en capsule tegen externe agentia, die kunnen voorkomen dat de weekdierextracten de intracellulaire componenten van de schimmel beïnvloeden. Belangrijke factoren om te overwegen bij het werken met organische substraten zijn de noodzaak om ze op te lossen in dimethylsulfoxide (DMSO), wat oplosbaarheidsproblemen in de agarplaat kan opleveren (zoals gebruikt in de melaninetests). Om dit probleem op te lossen, kunnen de extracten langs het oppervlak van de agarplaat worden verspreid en laten drogen voordat de schimmelcellen op de plaat worden gezien.
Eerder werk toonde de gevoeligheid van C. neoformans biofilms voor twee antischimmelmiddelen in vitro, waaronder amfotericine B en caspofungine; De schimmel was echter resistent tegen fluconazol en voriconazol23. Gezien het belang van schimmelbiofilms in virulentie en antimicrobiële resistentie, zou het ontdekken van nieuwe strategieën om de vorming van biofilms te verstoren of te verstoren waardevol zijn. In de huidige studie verminderden ruwe en geklaarde extracten van C. chinensis de vorming van biofilms van cryptokokkencellen met schijnbaar dosis-responsgedrag. Deze resultaten ondersteunen de impact en nieuwheid van de aanpak. Met name werd de vorming van biofilms in grotere mate geremd bij behandeling met de ruwe olie in vergelijking met het geklaarde extract, wat te wijten kan zijn aan een verlies van remmende verbindingen tijdens het klaringsproces of een vermindering van de remmende functie onder de geteste omstandigheden. Het is mogelijk dat de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor deze remmende effecten een hoog molecuulgewicht hebben en verloren zijn gegaan tijdens het klaringsproces of gevoelig waren voor afbraak tijdens de thermische behandeling. Deze resultaten benadrukken het belang van het gebruik van zowel ruwe als geklaarde extracten om veranderingen in remmende functies te detecteren, omdat verschillen met betrekking tot de remmerbron de uitkomst kunnen beïnvloeden.
Over het algemeen maakt dit protocol de extractie van verbindingen uit weekdieren mogelijk en de meting van vermeende remmende activiteit tegen een geselecteerde peptidase met aangetoonde rollen in schimmelvirulentie. In dit protocol werden de hoge opbrengst en sterke peptidase-remmende activiteit van de extracten en hun effect tegen de groei van C. neoformans en biofilmvorming geëvalueerd. Hoewel verdere experimenten nodig zijn, benadrukken deze resultaten het belang van weekdieren als vermeende nieuwe bronnen van verbindingen tegen deze gevaarlijke schimmelpathogeen. Bovendien, terwijl dit protocol zich richt op de extractie van remmers uit weekdieren, is de methodologie aanpasbaar aan andere ongewervelde dieren en kan worden gebruikt om het effect van remmers afgeleid van verschillende ongewervelde dieren op de virulentiefactorproductie in een verscheidenheid aan micro-organismen, waaronder schimmels en bacteriënte beoordelen 24,25,2 6 . Uiteindelijk kan de extractie van verbindingen uit natuurlijke bronnen het repertoire van vermeende nieuwe antimicrobiële middelen vergroten en zo ons vermogen om infectieziekten te bestrijden verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken leden van het Geddes-McAlister Lab voor hun waardevolle steun tijdens dit onderzoek en hun manuscriptfeedback. De auteurs erkennen de financiële steun van de Ontario Graduate Scholarship en International Graduate Research Award - University of Guelph tot D. G.-G en van de Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) en Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award voor J. G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
