Summary
Den humana svamppatogenen Cryptococcus neoformans producerar en mängd olika virulensfaktorer (t.ex. peptidaser) för att främja dess överlevnad inom värden. Miljönischer utgör en lovande källa till nya naturliga peptidashämmare. I detta protokoll beskrivs beredningen av extrakt från blötdjur och bedömningen av deras effekt på produktionen av svampvirulensfaktor.
Abstract
Cryptococcus neoformans är en inkapslad mänsklig svamppatogen med en global distribution som främst infekterar immunsupprimerade individer. Den utbredda användningen av antimykotika i kliniska miljöer, deras användning inom jordbruket och stamhybridisering har lett till ökad resistensutveckling. Denna ökande resistens mot antimykotika är ett växande problem bland kliniker och forskare över hela världen, och det finns ökad brådska att utveckla nya svampdödande terapier. Till exempel producerar C. neoformans flera virulensfaktorer, inklusive intra- och extracellulära enzymer (t.ex. peptidaser) med roller i vävnadsnedbrytning, cellulär reglering och näringsförvärv. Störningen av sådan peptidasaktivitet av hämmare stör svamptillväxt och proliferation, vilket tyder på att detta kan vara en viktig strategi för att bekämpa patogenen. Det är viktigt att ryggradslösa djur som blötdjur producerar peptidashämmare med biomedicinska tillämpningar och antimikrobiell aktivitet, men de är underutforskade när det gäller deras användning mot svamppatogener. I detta protokoll utfördes en global extraktion från blötdjur för att isolera potentiella peptidashämmare i råa och klarade extrakt, och deras effekter mot klassiska kryptokockvirulensfaktorer utvärderades. Denna metod stöder prioriteringen av blötdjur med svampdödande egenskaper och ger möjligheter till upptäckt av antivirulensmedel genom att utnyttja de naturliga hämmare som finns i blötdjur.
Introduction
Cryptococcus neoformans är en mänsklig svamppatogen som producerar allvarlig sjukdom hos immunsupprimerade värdar, såsom individer som lever med hiv / aids1, och leder till cirka 19% av AIDS-relaterade dödsfall2. Svampen är mottaglig för flera klasser av svampdödande medel, inklusive azoler, polyener och flucytosin, som utövar fungicid och fungistatisk aktivitet med hjälp av distinkta mekanismer 3,4. Den omfattande användningen av antimykotika i kliniska och jordbruksmiljöer i kombination med stamhybridisering har dock förstärkt utvecklingen av resistens hos flera svamparter, inklusive C. neoformans5.
För att övervinna utmaningarna med antimykotisk resistens och minska förekomsten av svampinfektioner på global nivå är ett lovande tillvägagångssätt att använda virulensfaktorerna för Cryptococcus spp. (t.ex. temperaturanpassningsförmåga, polysackaridkapsel, melanin och extracellulära enzymer) som potentiella terapeutiska mål 4,6 . Detta tillvägagångssätt har flera fördelar, eftersom dessa virulensfaktorer är väl karakteriserade i litteraturen, och inriktning på dessa faktorer kan potentiellt minska graden av svampdödande resistens genom att införa ett svagare selektivt tryck genom att försämra virulensen snarare än att rikta celltillväxt6. I detta sammanhang har många studier bedömt möjligheten att rikta extracellulära enzymer (t.ex. proteaser, peptidaser) för att minska eller hämma virulensen hos Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som ryggradslösa djur och växter har inte ett adaptivt immunförsvar för att skydda sig mot patogener. De förlitar sig dock på ett starkt medfött immunförsvar med ett enormt utbud av kemiska föreningar för att hantera mikroorganismer och rovdjur10. Dessa molekyler innefattar peptidashämmare, som spelar viktiga roller i många biologiska system, inklusive cellulära processer av ryggradslösa immunitet, såsom koagulering av hemolymf, syntes av cytokiner och antimikrobiella peptider och skydd av värdar genom direkt inaktivering av proteaserna av patogener11. Således har peptidashämmare från ryggradslösa djur som blötdjur potentiella biomedicinska tillämpningar, men många förblir okarakteriserade10,12,13. I detta sammanhang finns det cirka 34 arter av landlevande blötdjur i Ontario och 180 sötvattenblötdjur i Kanada14. Men deras djupgående profilering och karakterisering är fortfarande begränsad15. Dessa organismer utgör en möjlighet att identifiera nya föreningar med potentiell anti-svampaktivitet10.
I detta protokoll beskrivs metoder för att isolera och klargöra extrakt från ryggradslösa djur (t.ex. blötdjur) (figur 1) följt av mätning av den förmodade peptidashämmande aktiviteten. De antimykotiska egenskaperna hos dessa extrakt bedöms sedan genom att mäta deras inverkan på produktionen av C. neoformans virulensfaktor med hjälp av fenotypiska analyser (figur 2). Det är viktigt att notera att skillnader i svampdödande egenskaper mellan råa och klarade extrakt kan tyda på mikrobiella faktorer (t.ex. sekundära metaboliter eller toxiner som produceras av värdmikrobiomet) hos blötdjuret, vilket kan påverka experimentella observationer. Sådana fynd stöder behovet av att detta protokoll bedömer både råa och klarade extrakt oberoende för att avslöja verkningssätten. Dessutom är extraktionsprocessen opartisk och kan möjliggöra detektion av antimikrobiella egenskaper mot en uppsjö av svamp- och bakteriepatogener. Därför ger detta protokoll en initieringspunkt för prioritering av blötdjursarter med svampdödande egenskaper mot C. neoformans och en möjlighet att utvärdera sambanden mellan enzymatisk aktivitet och virulensfaktorproduktion genom förmodade hämmande mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinextraktion från blötdjur
- Samla blötdjur från ett utsett och godkänt naturområde (t.ex. Speed River, Guelph, Ontario). För denna studie valdes både inhemska och invasiva arter för att bedöma ett brett spektrum av potentiella antifungala effekter.
- Bryt försiktigt skalet på blötdjuren (t.ex. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi och Cipangopaludina chinensis) med en stöt och mortel och ta bort de fasta bitarna med en pincett. I allmänhet samlas 10 blötdjur för användning i hela protokollet.
- Samla och väga organen. Cirka 15-20 g prov är optimalt. Använd sax för att skära organen i små bitar ca 0,5-1 cm i storlek.
- Flash-frys de dissekerade och skurna organproverna med flytande kväve. Mal sedan organproverna till ett fint pulver med hjälp av en stöt och murbruk.
- Tillsätt organprovspulvret (ca 15 g) i 30 ml kallt destillerat vatten (4 °C) för att uppnå förhållandet 1:2 (w/v).
- Häll 2 ml av provet i 2 ml rör med hög effekt. Tillsätt en skopa 3 mm kulor av rostfritt stål (ca 500 μg) till varje rör och homogenisera med en mixer (se Materialförteckning) i 3 minuter vid 1 200 varv/min och 4 °C.
- Centrifugera vid 12 000 × g i 20 min vid 4 °C. Samla alla supernatanter med en pipett i ett nytt 50 ml rör och kassera pelleten.
- Filtersterilisera supernatanten med ett membran på 0,22 μm. Förvara proverna på is och fortsätt till klarningsprotokollet (avsnitt 2), beroende på vad som är tillämpligt.
OBS: Proverna kan snabbfrysas i flytande kväve och förvaras vid −20 °C för att användas som råextrakt.
2. Förtydligande av blötdjursextraktet
- Placera supernatantprovet från steg 1.8 i ett termalbad vid 60 °C i 30 minuter. Kyl sedan proverna snabbt genom att överföra dem till en hink med is i 20 minuter.
- Centrifugera proverna vid 15 000 × g i 45 min vid 4 °C. Samla supernatanten i ett nytt 50 ml rör och kassera pelleten. Filtersterilisera proverna med ett 0,22 μm membranfilter och förvara dem sedan på is.
- Bestäm proteinkoncentrationen i proverna från steg 1.8 (dvs. råextraktet) och steg 2.2 (dvs. det klarade extraktet) med hjälp av en kvantifieringsanalys (t.ex. bicinkoninsyratest17). Det optimala proteinkoncentrationsområdet är 4-8 mg / ml.
- Förvara proverna på is i upp till 1 timme eller frys i flytande kväve och förvara dem vid −20 °C tills de behövs.
3. Analys av hämmande aktivitet
- Mät den hämmande aktiviteten hos råa och klarade extrakt med hjälp av enzymatiska analyser i tekniska tre exemplar.
OBS: Varje enzymatisk analys består av ett enzym (t.ex. subtilisin A, som är involverat i svampvirulens 16,17,18; vanligtvis runt 1 x 10−9 mol / L för kromogena analyser), en buffert och ett substrat. Reaktionen startar när substratet möter enzymet. Den enzymatiska aktiviteten är proportionell mot hastigheten för substratomvandling till produkten. - Bedöm effekten av enzymkoncentration (EC) över enzymatisk aktivitet (EA) tills linjärt beroende erhålls mellan båda parametrarna. För nästa steg, använd en enzymkoncentration inom det uppmätta linjära området.
OBS: Den enzymatiska analysen för peptidaset subtilisin A beskrivs i följande steg. - Inkubera de råa (steg 1.11) eller klarade (steg 2.5) molluskproteinextrakten (t.ex. 10 μL innehållande 4 mg/ml protein) med 10 μl subtilisin A (koncentration bestämd från steg 3.2) och 220 μl 100 mM Tris-HCl vid pH 8,6 (tillsätt 230 μl Tris-buffert utan tillsats av extraktet) i 10 minuter vid 25 °C i en platta med 96 brunnar med platt botten.
- Tillsätt 10 μL N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, substratet för subtilisin A, vid en slutlig koncentration av 1 Km (Michaelis-Menten konstant; 0,2 mM för detta substrat med subtilisin A) för en slutlig reaktionsvolym på 250 μl.
- Mät den enzymatiska aktiviteten genom att övervaka produktens utseende över tid genom att läsa av den optiska densiteten (OD) vid 405 nm var 15:e sekund i 3 minuter.
- Bestäm den återstående enzymatiska aktiviteten genom att beräkna förhållandet mellan den enzymatiska aktiviteten i närvaro av blötdjursextraktet och den i frånvaro av extraktet.
- Om hämmande aktivitet observeras (dvs. restaktivitet under 1), mät värdet för den hämmande koncentrationen 50 (IC50) med hjälp av ett koncentrationsintervall av extrakten (t.ex. en tvåfaldig utspädningsserie från 200 μg/ml till 1 μg/ml) enligt standardmetod19.
4. Effekt av blötdjursextrakt på C. neoformans tillväxt
- Använd en 10 μL pipettspets för att införa en enda koloni av C. neoformans var. grubii H99 vildtyp (WT) i 5 ml jästextrakt-pepton-dextros (YPD) medium (10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton och 20 g / L dextros, pH 6,5) och inkubera i 16-18 timmar vid 30 ° C och 200 rpm. Utför experimentet i biologisk triplikat och teknisk duplikat.
- Samla 500 μL av kulturen i en kyvett och mät tillväxten genom att läsa OD vid 600 nm. Späd kulturen med jästkvävebasmedium (YNB) till en slutlig OD600 på 0,02.
- Samodling av C. neoformans-celler med olika koncentrationer (t.ex. en trefaldig utspädningsserie från 440 μg/ml till 15 μg/ml protein) av extrakten (dvs. råa och klarade). För att göra detta, blanda 10 μL av extrakten med 190 μL av den utspädda C. neoformans-kulturen (steg 4.2) i en 96-brunnsplatta.
- Mät tillväxten genom att läsa av OD 600 med en plattläsare var 15:e minut till 1:e timme i 72 timmar vid200 rpm och 37 °C.
5. Effekt av blötdjursextrakt på C. neoformans melaninproduktion
- Förbered L-3,4-dihydroxifenylalanin (L-DOPA) plattor.
- Autoklav 230 ml 14 g/L agar och låt svalna tills den når 50-60 °C.
- Tillsätt 3,25 ml 1 M glycin, 7,35 ml 1 M KH 2 PO 4, 2,5 ml 1 M MgSO4,7H 2 O, 0,6 ml 40% glukos, 70 μL 10 mM tiamin och 2,5ml 100 mM L-DOPA (filtersteriliserad) till den flytande agaren.
- Häll 15 ml av blandningen i petriskålar, låt dem torka i cirka 1 timme i mörkret och förvara vid 2-4 °C i upp till 1 vecka. Se till att locken är delvis lyft för att agar ska torka ordentligt.
- Inokulera 5 ml YNB-medium med 50 μL C. neoformans-kultur från steg 4.1. Inkubera i 16–18 timmar vid 30 °C och 200 rpm.
- Snurra ner cellerna vid 1 000 × g i 5 minuter vid 4 °C. Tvätta cellerna 2x med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid pH 7,4.
- Räkna cellerna med en hemocytometer. Resuspendera cellerna i 1 ml PBS för att nå en slutlig koncentration på 106 celler/ml.
- Bered en spädningsserie (t.ex. tvåfaldig) av råoljeextrakt och klarat blötdjursextrakt. Bered på liknande sätt en 10-faldig spädningsserie av C. neoformans celler (steg 5.4) från 1 x 106 celler/ml till 1 x 101 celler/ml med steril PBS i 96-brunnsplattor.
- Sprid 200 μL av extrakten på petriskålar innehållande L-DOPA-agar med hjälp av en vattpinne och låt dem torka i 15 minuter.
- Placera 5 μL kultur från varje brunn på L-DOPA-plattan och lämna 1 cm mellan dropparna. Låt det torka i mörkret i 15 min.
- Inkubera plattorna vid 30 °C och 37 °C i en statisk inkubator i 3–5 dagar och ta bilder var 24:e timme med en kamera eller plattkamera (t.ex. skanner).
OBS: Två temperaturförhållanden används här för att undersöka temperaturens inverkan på de tillväxthämmande effekterna av blötdjursextrakten, där 30 °C representerar miljön och 37 °C representerar människans fysiologiska temperaturer.
6. Effekt av blötdjursextrakt på C. neoformans polysackaridkapselproduktion
- Förbered lågt järnmedium (LIM) enligt beskrivningen nedan.
- Lös 5 g kelaterande harts (se materialtabell) i 60 ml ultrarent vatten och packa i en glaskolonn (2 cm diameter x 25 cm längd). Tvätta kolonnen med 100 ml vatten och kassera det uppsamlade vattnet.
- Förbered lågt järnvatten (LI-vatten) genom att leda 2 liter sterilt ultrarent vatten genom kelaterkolonnen. Förvara LI-vattnet vid 4 °C i upp till 3 månader.
- Lös upp 5 g glukos i 100 ml LI-vatten. Lös 5 g L-asparagin i 200 ml LI-vatten i en separat bägare.
- Tillsätt följande till 500 ml LI-vatten i ordning: 4,78 g HEPES, 0,4 g K2HPO4, 0,08 gMgSO4,7H2O, 1,85 g NaHCO 3 och 0,25 g CaCl2,2H2O.
- Kombinera lösningarna från steg 6.1.3 och steg 6.1.4. Tillsätt 1 ml 100 ml bathophenanthrolinedisulfonic acid sodium salt (BPS) till en slutlig koncentration på 100 μM.
- Justera pH till 7,2 med 1 M LI-MOPS. Tillsätt LI-vatten till en slutlig volym på 1 liter och filtrera mediet genom att leda det genom ett 0,22 μm membran. Tillsätt 100 μl steril tiamin (4 mg/ml) till mediet.
- Inokulera 5 ml YNB-medium med 50 μL av C. neoformans-kulturen från steg 4.1. Inkubera i 16–18 timmar vid 30 °C och 200 rpm. Använd denna kultur för att inokulera 5 ml LIM till en slutlig koncentration av 105 celler/ml.
- Tillsätt lämpliga volymer av blötdjursextrakten (t.ex. en dubbel utspädning eller den volym som bestämts från tidigare virulensanalyser) för att uppnå önskade koncentrationer. Inkubera i 72 timmar vid 37 °C och 200 rpm med lossade lock. Efter inkubation, samla upp 1 ml celler och tvätta 2 gånger med sterilt PBS, pH 7,4, vid 1 500 × g i 2 min vid 4 °C.
- Resuspendera försiktigt cellerna i 1 ml PBS. Blanda cellerna med India Ink i förhållandet 1:1 (t.ex. 4 μL India Ink med 4 μL cellsuspension) över ett glasmikroskopglas. Placera ett täckglas ovanpå bilden.
- Visualisera proverna med hjälp av ett DIC-mikroskop (differential interference contrast) med ett 63x oljemål (se materialförteckning). Ställ in kontrasten på automatisk och fokusera manuellt med hjälp av mikroskopratten. Markera alla bilder och exportera dem i TIFF-format. Inga filter behöver appliceras.
- Använd linjalverktyget i BildJ20 och kvantifiera förhållandet mellan den totala cellstorleken (inklusive kapseln) och cellkroppsstorleken.
7. Effekt av blötdjursextrakt på C. neoformans biofilmproduktion
- Inokulera 5 ml YNB-medium med 50 μL C. neoformans-kultur från steg 4.1. Inkubera i 16–18 timmar vid 30 °C och 200 rpm.
- Skörda celler från 5 ml kultur. Tvätta cellerna med sterilt PBS, pH 7,4, vid 1 500 × g i 2 minuter vid 4 °C.
- Räkna cellerna med en hemocytometer. Resuspendera cellerna i 3 ml av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) till en slutlig koncentration av 107 celler/ml.
- Överför 300 μL av cellsuspensionen till de enskilda brunnarna på en steril, polystyren, flatbottnad 24-brunnsplatta. Använd brunnar med media endast som kontroll.
- Tillsätt lämpliga volymer av blötdjursextrakten (t.ex. en dubbel utspädning eller den volym som bestämts från tidigare virulensanalyser) för att uppnå en slutlig koncentration av 10-20 μg/ml protein. Se till att extraktvolymen inte är större än 10% av den totala volymen.
- Förpacka plattorna med aluminiumfolie (för att undvika mediaavdunstning) och inkubera i 48 timmar med en statisk inkubator vid 30 °C och 37 °C.
- Tvätta brunnarna 2x med sterilt vatten med en flaska eller dispenser och låt dem lufttorka i 10-15 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sedan 100 μL 0,3% kristallviolett lösning till varje brunn (inklusive de medelstora kontrollbrunnarna) och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Tvätta brunnarna noggrant 3x med sterilt vatten (biofilmerna störs inte under tvätt). Tillsätt 200 μl 100 % etanol och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Överför 75 μL till en ny platta med 96 brunnar och läs OD550. Kvantifiera biofilmbildningen som (OD 550nm prov - OD550nm blind).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet som beskrivs här möjliggör isolering av proteiner och peptider från blötdjur med potentiella antivirulensegenskaper mot C. neoformans. På samma sätt möjliggör bedömning av olika former av extrakt (dvs. rå och klarad) halvrening av de potentiella aktiva föreningarna och stöder nedströmsbedömning (t.ex. masspektrometribaserad proteomik). Vanligtvis producerar proteinextraktionsarbetsflödet homogeniserade lösningar med proteinkoncentrationer på 4-8 mg / ml. Här visar de representativa resultaten bedömningen av den enzymatiska aktiviteten och antifungala egenskaperna hos C. chinensis-extrakt. De råa och klarade extrakten kunde hämma den proteolytiska aktiviteten hos subtilisin A (relaterad till virulens hos C. neoformans) (figur 3), med IC 50-värden på 5,3 μg / ml respektive4,53 μg / ml. Aktiviteten av C. chinensis extrakt testades ytterligare mot processer associerade med C. neoformans virulensfaktorproduktion, inklusive svamptillväxt, kapsel- och melaninproduktion och bildandet av biofilmer. Det fanns en signifikant minskning av svamptillväxten vid 37 °C i närvaro av råa (figur 4A) och klarade (figur 4B) C. chinensis-extrakt. I synnerhet fanns det inga förändringar i kapsel- eller melaninproduktionen i närvaro av råa eller klarade C. chinensis-extrakt (figur 4C, D). En signifikant minskning av biofilmbildningen med 70–80 % observerades dock vid höga koncentrationer av råa extrakt (figur 4E) och klarade extrakt (figur 4F) jämfört med den obehandlade kontrollgruppen.
Figur 1: Arbetsflöde för total proteinextraktion från blötdjur. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Allmän strategi som används för att bedöma effekterna av blötdjursextrakt på proteolytisk aktivitet, tillväxt och virulensfaktorproduktion hos Cryptococcus neoformans. DIC = differentiell interferenskontrastmikroskopi. Optisk densitetsmätning indikerad med våglängden i nanometer (nm). Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat av effekterna av extrakt av blötdjursprotein på den proteolytiska effekten av subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis råa extrakt. b) C. chinensis klarade extrakt. Varje punkt representerar genomsnittet av tre replikat. Staplar indikerar standardavvikelse. IC50 = halv maximal hämmande koncentration. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av effekterna av C. chinensis-extrakt på produktion av virulensfaktor hos C. neoformans. (A,B) Tillväxt av C. neoformans vid 37 °C i närvaro av råa respektive klarade C. chinensis-extrakt. C) DIC-mikroskopibilder av C. neoformans som visar kapselproduktion i närvaro av råa (50 μg/ml) och klarade (40 μg/ml) extrakt. Skalstapel = 10 μm. (D) Melaninproduktion av C. neoformans i närvaro av råa (440 μg/ml) och klarade (410 μg/ml) extrakt vid 30 °C och 37 °C. (E,F) Relativ biofilmbildning av C. neoformans i närvaro av råa respektive klarade extrakt. För statistisk analys utfördes ett enkelriktat ANOVA-test och ett Dunnetts multipeljämförelsetest. *p < 0,05; **p < 0,01; och ****p < 0,0001. Varje värde motsvarar ett genomsnitt av minst fem biologiska replikat och två tekniska replikat. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Melaninbilderna som visas är representativa för tre biologiska replikat och två tekniska replikat. Kapselbilder som visas är representativa för 40-50 celler per tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Extraktionsprotokollet som beskrivs här beskriver isoleringen av föreningar från blötdjur som samlats in från Ontario, Kanada, och visar en ny undersökning av användning av blötdjursextrakt mot den mänskliga svamppatogenen, C. neoformans. Detta protokoll bidrar till en växande mängd forskning som undersöker peptidashämmare aktivitet från ryggradslösa djur13. Under extraktionen var vissa extraktprover svåra att filtersterilisera, möjligen på grund av närvaron av lösliga polysackarider och/eller pigment som blockerade filtermembranet. För att övervinna denna begränsning rekommenderas att man först filtrerar genom ett 5 μm-membran för att utesluta stora föreningar (t.ex. störda cellmembran, genom-DNA), vilket gör att proteinerna kan passera genom filtret och sedan filtrera igen genom ett 0,22 μm-membran. Dessa steg är kritiska för protokollet eftersom de begränsar förekomsten av mikrober som kan förorena proverna och störa nedströmsexperiment.
Under denna undersökning detekterades peptidashämmare mot subtilisin A, ett modellenzym för S8-familjen av subtilisin. Medlemmar av denna enzymfamilj är utbredda bland organismer och har varierande roller, såsom i proteinbearbetning, näring och virulensmekanismer21,22, som stöder de fenotypiska effekterna som observerats i denna studie. Till exempel observerades en signifikant minskning av svamptillväxt i närvaro av både råa och klarade extrakt och vid relativt höga och låga koncentrationer, vilket tyder på att den hämmande aktiviteten var robust i den testade modellen. Det är anmärkningsvärt att vid mätning av OD med en plattläsare orsakade närvaron av extrakten klumpning av svampcellerna i botten av brunnen, vilket störde tillväxtmätningen. Denna begränsning kan övervinnas genom att använda en höghastighets skakinkubator (t.ex. 900 rpm), vilket skulle undvika cellklumpning.
Det kan finnas andra tekniska begränsningar som kan påverka de förväntade fenotypiska observationerna. Till exempel är subtilisinliknande peptidaser associerade med melaninsyntes och kvorumavkänning i C. neoformans, men de råa eller klarade extrakten från några blötdjur visar inte signifikanta effekter på melaninproduktionen16,17,18. Detta beror möjligen på den naturliga skyddande effekten av melanin och kapsel mot externa medel, vilket kan förhindra att blötdjursextrakten påverkar svampens intracellulära komponenter. Viktiga faktorer att tänka på när man arbetar med organiska substrat inkluderar behovet av att lösa upp dem i dimetylsulfoxid (DMSO), vilket kan ge löslighetsproblem inom agarplattan (som används i melaninanalyserna). För att lösa detta problem kan extrakten spridas längs agarplattans yta och får torka innan svampcellerna spottas på plattan.
Tidigare arbete visade känsligheten hos C. neoformans biofilmer för två svampdödande medel in vitro, inklusive amfotericin B och kaspofungin; Svampen var dock resistent mot flukonazol och vorikonazol23. Med tanke på betydelsen av svampbiofilmer i virulens och antimikrobiell resistens skulle det vara värdefullt att avslöja nya strategier för att störa eller störa biofilmbildning. I den aktuella studien försämrade råa och klarade extrakt från C. chinensis bildandet av biofilmer av kryptokockceller med uppenbart dos-responsbeteende. Dessa resultat stöder metodens inverkan och nyhet. I synnerhet hämmades biofilmbildningen i större utsträckning vid behandling med råoljan jämfört med det klarade extraktet, vilket kan bero på en förlust av hämmande föreningar under klarningsprocessen eller en minskning av hämmande funktion under de testade betingelserna. Det är möjligt att proteinerna som är ansvariga för dessa hämmande effekter är av hög molekylvikt och förlorades under klarningsprocessen eller var mottagliga för nedbrytning under värmebehandlingen. Dessa resultat belyser vikten av att använda både råa och klarade extrakt för att upptäcka förändringar i hämmande funktioner, eftersom skillnader relaterade till inhibitorkällan kan påverka resultatet.
Sammantaget möjliggör detta protokoll extraktion av föreningar från blötdjur och mätning av förmodad hämmande aktivitet mot ett utvalt peptidas med påvisade roller i svampvirulens. I detta protokoll utvärderades extraktens höga utbyte och starka peptidashämmande aktivitet och deras effekt mot C. neoformans tillväxt och biofilmbildning. Medan ytterligare experiment behövs, betonar dessa resultat vikten av blötdjur som förmodade nya källor till föreningar mot denna farliga svamppatogen. Även om detta protokoll fokuserar på extraktion av hämmare från blötdjur, är metoden anpassningsbar till andra ryggradslösa djur och kan användas för att bedöma effekten av hämmare härledda från olika ryggradslösa djur på virulensfaktorproduktion i en mängd olika mikroorganismer, inklusive svampar och bakterier24,25,2 6 . I slutändan kan utvinning av föreningar från naturliga källor öka repertoaren av förmodade nya antimikrobiella medel och därmed förbättra vår förmåga att bekämpa infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar medlemmarna i Geddes-McAlister Lab för deras värdefulla stöd under hela denna undersökning och deras manuskriptåterkoppling. Författarna erkänner finansieringsstödet från Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph till DG-G och från Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) och Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award för JG-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
