Summary
Det humane svampepatogen Cryptococcus neoformans producerer en række virulensfaktorer (fx peptidaser) for at fremme dets overlevelse i værten. Miljønicher repræsenterer en lovende kilde til nye naturlige peptidasehæmmere. Denne protokol beskriver fremstillingen af ekstrakter fra bløddyr og vurderingen af deres virkning på produktionen af svampevirulensfaktor.
Abstract
Cryptococcus neoformans er et indkapslet humant svampepatogen med en global fordeling, der primært inficerer immunkompromitterede individer. Den udbredte anvendelse af svampemidler i kliniske omgivelser, deres anvendelse i landbruget og stammehybridisering har ført til øget udvikling af resistens. Denne stigende resistens over for svampemidler er en voksende bekymring blandt klinikere og forskere over hele verden, og der er øget presserende behov for at udvikle nye svampedræbende behandlinger. For eksempel producerer C. neoformans flere virulensfaktorer, herunder intra- og ekstracellulære enzymer (fx peptidaser) med roller i vævsnedbrydning, cellulær regulering og næringsstofoptagelse. Forstyrrelsen af en sådan peptidaseaktivitet af inhibitorer forstyrrer svampevækst og spredning, hvilket tyder på, at dette kan være en vigtig strategi til bekæmpelse af patogenet. Det er vigtigt, at hvirvelløse dyr som bløddyr producerer peptidasehæmmere med biomedicinske anvendelser og antimikrobiel aktivitet, men de er underudforsket med hensyn til deres anvendelse mod svampepatogener. I denne protokol blev en global ekstraktion fra bløddyr udført for at isolere potentielle peptidasehæmmere i rå og klarede ekstrakter, og deres virkninger mod klassiske kryptokokvirulensfaktorer blev vurderet. Denne metode understøtter prioriteringen af bløddyr med svampedræbende egenskaber og giver mulighed for opdagelse af antivirulensmidler ved at udnytte de naturlige hæmmere, der findes i bløddyr.
Introduction
Cryptococcus neoformans er et humant svampepatogen, der producerer alvorlig sygdom hos immunkompromitterede værter, såsom personer, der lever med hiv / aids1, og fører til ca. 19% af aids-relaterede dødsfald2. Svampen er modtagelig for flere klasser af svampemidler, herunder azoler, polyener og flucytosin, som udøver fungicid og fungistatisk aktivitet ved anvendelse af forskellige mekanismer 3,4. Imidlertid har den omfattende anvendelse af svampemidler i kliniske og landbrugsmæssige omgivelser kombineret med stammehybridisering forstærket udviklingen af resistens i flere svampearter, herunder C. neoformans5.
For at overvinde udfordringerne ved svamperesistens og reducere forekomsten af svampeinfektioner på globalt plan er en lovende tilgang at bruge virulensfaktorerne for Cryptococcus spp. (f.eks. temperaturtilpasningsevne, polysaccharidkapsel, melanin og ekstracellulære enzymer) som potentielle terapeutiske mål 4,6 . Denne tilgang har flere fordele, da disse virulensfaktorer er velkarakteriserede i litteraturen, og målretning af disse faktorer kan potentielt reducere hastigheden af svampedræbende resistens ved at pålægge et svagere selektivt tryk ved at forringe virulens snarere end at målrette cellevækst6. I denne sammenhæng har adskillige undersøgelser vurderet muligheden for at målrette ekstracellulære enzymer (f.eks. proteaser, peptidaser) for at reducere eller hæmme virulensen af Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som hvirvelløse dyr og planter har ikke et adaptivt immunsystem til at beskytte sig mod patogener. De er imidlertid afhængige af et stærkt medfødt immunsystem med et enormt udvalg af kemiske forbindelser til at håndtere mikroorganismer og rovdyr10. Disse molekyler indbefatter peptidasehæmmere, som spiller vigtige roller i mange biologiske systemer, herunder de cellulære processer af hvirvelløse immuniteter, såsom koagulation af hæmolymfe, syntese af cytokiner og antimikrobielle peptider og beskyttelse af værter ved direkte inaktivering af proteaser af patogener11. Således har peptidasehæmmere fra hvirvelløse dyr som bløddyr potentielle biomedicinske anvendelser, men mange forbliver ukarakteriserede10,12,13. I denne sammenhæng er der ca. 34 arter af terrestriske bløddyr i Ontario og 180 ferskvandsbløddyr i Canada14. Deres dybdegående profilering og karakterisering er dog stadig begrænset15. Disse organismer udgør en mulighed for identifikation af nye forbindelser med potentiel svampedræbende aktivitet10.
I denne protokol beskrives metoder til isolering og klaring af ekstrakter fra hvirvelløse dyr (f.eks. bløddyr) (figur 1) efterfulgt af måling af den formodede peptidasehæmmende aktivitet. De antifungale egenskaber af disse ekstrakter vurderes derefter ved at måle deres indvirkning på C. neoformans virulensfaktorproduktion ved hjælp af fænotypiske assays (figur 2). Det er vigtigt at bemærke, at forskelle i svampedræbende egenskaber mellem rå og klarede ekstrakter kan være tegn på mikrobielle faktorer (f.eks. sekundære metabolitter eller toksiner produceret af værtsmikrobiomet) hos bløddyret, som kan påvirke eksperimentelle observationer. Sådanne resultater understøtter behovet for, at denne protokol vurderer både rå og afklarede ekstrakter uafhængigt for at optrævle virkningsmekanismerne. Derudover er ekstraktionsprocessen upartisk og kan muliggøre påvisning af antimikrobielle egenskaber mod en overflod af svampe- og bakteriepatogener. Derfor giver denne protokol et initieringspunkt for prioritering af bløddyrarter med svampedræbende egenskaber mod C. neoformans og en mulighed for at evaluere forbindelserne mellem enzymatisk aktivitet og virulensfaktorproduktion gennem formodede hæmmende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinekstraktion fra bløddyr
- Saml bløddyr fra et udpeget og godkendt naturområde (f.eks. Speed River, Guelph, Ontario). Til denne undersøgelse blev både indfødte og invasive arter udvalgt til at vurdere en bred vifte af potentielle svampedræbende virkninger.
- Bryd forsigtigt bløddyrskallen (f.eks. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi og Cipangopaludina chinensis) ved hjælp af en støder og mørtel, og fjern de faste stykker med en pincet. Generelt samles 10 bløddyr til brug i hele protokollen.
- Saml og vej organerne. Ca. 15-20 g prøve er optimal. Brug en saks til at skære organerne i små stykker ca. 0,5-1 cm i størrelse.
- Flash-frys de dissekerede og skårne organprøver med flydende nitrogen. Slib derefter organprøverne til et fint pulver ved hjælp af en stød og mørtel.
- Organprøvepulveret (ca. 15 g) tilsættes i 30 ml koldt destilleret vand (4 °C) for at opnå et forhold på 1:2 (w/v).
- Hæld 2 ml af prøven i kraftige 2 ml rør. Der tilsættes en skefuld 3 mm perler af rustfrit stål (ca. 500 μg) til hvert rør, og homogeniser ved hjælp af en blender (se materialetabellen) i 3 minutter ved 1.200 o/min og 4 °C.
- Der centrifugeres ved 12.000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Alle supernatanterne samles med en pipette i et friskt 50 ml rør, og pelletsen kasseres.
- Supernatanten filtreres, og der anvendes en 0,22 μm membran. Opbevar prøverne på is, og fortsæt til afklaringsprotokollen (afsnit 2), alt efter hvad der er relevant.
BEMÆRK: Prøverne kan lynfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -20 °C for at blive brugt som råekstrakter.
2. Afklaring af bløddyrekstraktet
- Supernatantprøven fra trin 1.8 anbringes i et termisk bad ved 60 °C i 30 minutter. Derefter afkøles prøverne hurtigt ved at overføre dem til en spand med is i 20 minutter.
- Prøverne centrifugeres ved 15.000 × g i 45 minutter ved 4 °C. Supernatanten opsamles i et friskt 50 ml rør, og pelletsen kasseres. Filtrer prøverne ved hjælp af et 0,22 μm membranfilter, og opbevar dem derefter på is.
- Proteinkoncentrationen i prøverne bestemmes fra trin 1.8 (dvs. råekstraktet) og trin 2.2 (dvs. det klarede ekstrakt) ved hjælp af et kvantificeringsassay (f.eks. bicinchoninsyreassay17). Det optimale proteinkoncentrationsområde er 4-8 mg/ml.
- Opbevar prøverne på is i op til 1 time eller lynfrys dem i flydende nitrogen, og opbevar dem ved -20 °C, indtil de skal bruges.
3. Hæmmende aktivitetsanalyse
- Den hæmmende aktivitet af de rå og klarede ekstrakter måles ved hjælp af enzymatiske assays i teknisk triplicat.
BEMÆRK: Hvert enzymatisk assay består af et enzym (fx subtilisin A, som er involveret i svampevirulens 16,17,18; normalt omkring 1 x 10-9 mol / L for kromogene baserede assays), en buffer og et substrat. Reaktionen starter, når substratet møder enzymet. Den enzymatiske aktivitet er proportional med hastigheden af substratomdannelsen til produktet. - Vurder effekten af enzymkoncentration (EC) over enzymatisk aktivitet (EA), indtil lineær afhængighed er opnået mellem begge parametre. Til de næste trin skal du bruge en enzymkoncentration inden for det målte lineære område.
BEMÆRK: Det enzymatiske assay for peptidasesubtilisin A er detaljeret i de følgende trin. - Rådyrproteinekstrakterne (trin 1.11) eller klaret (trin 2.5) bløddyrproteinekstrakter (f.eks. 10 μL indeholdende 4 mg/ml protein) inkuberes med 10 μL subtilisin A (koncentration bestemt fra trin 3.2) og 220 μL 100 mM Tris-HCl ved pH 8,6 (til kontrollen tilsættes 230 μL Tris-buffer uden tilsætning af ekstraktet) i 10 minutter ved 25 °C i en fladbundet plade med 96 huller.
- Der tilsættes 10 μL N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, substratet for subtilisin A, ved en slutkoncentration på 1 K m (Michaelis-Menten-konstant; 0,2mM for dette substrat med subtilisin A) til et slutreaktionsvolumen på 250 μL.
- Den enzymatiske aktivitet måles ved at overvåge produktets udseende over tid ved at aflæse den optiske densitet (OD) ved 405 nm hver 15. sek. i 3 minutter.
- Den resterende enzymatiske aktivitet bestemmes ved at beregne forholdet mellem den enzymatiske aktivitet i nærvær af bløddyrekstraktet og den i fravær af ekstraktet.
- Hvis der observeres hæmmende aktivitet (dvs. restaktivitet under 1), måles værdien for den hæmmende koncentration 50 (IC50) ved hjælp af et koncentrationsinterval af ekstrakterne (f.eks. en tofoldsfortyndingsserie fra 200 μg/ml til 1 μg/ml) efter standardmetode19.
4. Virkning af bløddyrekstrakter på C. neoformans vækst
- Brug en 10 μL pipettespids til at indføre en enkelt koloni af C. neoformans var. grubii H99 vildtype (WT) i 5 ml gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) medium (10 g / L gærekstrakt, 20 g / L pepton og 20 g / L dextrose, pH 6,5) og inkuber i 16-18 timer ved 30 ° C og 200 rpm. Udfør eksperimentet i biologisk tredobbelt og teknisk duplikat.
- Saml 500 μL af kulturen i en kuvette, og mål væksten ved at aflæse OD ved 600 nm. Fortynd kulturen med gærnitrogenbase (YNB) medium til en endelig OD600 på 0,02.
- Co-kultur C. neoformans celler med forskellige koncentrationer (fx en tredobbelt fortyndingsserie fra 440 μg/ml til 15 μg/ml protein) af ekstrakterne (dvs. rå og klaret). For at gøre dette blandes 10 μL af ekstrakterne med 190 μL af den fortyndede C. neoformans kultur (trin 4.2) i en 96-brøndplade.
- Mål væksten ved at aflæse OD 600 ved hjælp af en pladelæser hvert 15. minut til 1 time i 72 timer ved200 o/min og 37 °C.
5. Virkning af bløddyrekstrakter på C. neoformans melaninproduktion
- Forbered L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) plader.
- Autoklave 230 ml 14 g/l agar, og lad det køle af, indtil det når 50-60 °C.
- Tilsæt 3,25 ml 1 M glycin, 7,35 ml 1 M KH 2 PO 4, 2,5 ml 1 M MgSO4,7H 2 O, 0,6 ml 40% glucose, 70 μL 10 mM thiamin og 2,5ml 100 mM L-DOPA (filtersteriliseret) til flydende agar.
- Hæld 15 ml af blandingen i petriplader, lad dem tørre i ca. 1 time i mørke og opbevar ved 2-4 °C i op til 1 uge. Sørg for, at lågene er delvist løftet, så agaren tørrer ordentligt.
- 5 ml YNB-substrat podes med 50 μL C. neoformans-kultur fra trin 4.1. Der inkuberes i 16-18 timer ved 30 °C og 200 omdr./min.
- Drej cellerne ned ved 1.000 × g i 5 minutter ved 4 °C. Cellerne vaskes 2x med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) ved pH 7,4.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Resuspender cellerne i 1 ml PBS for at nå en slutkoncentration på 10,6 celler/ml.
- Der fremstilles en fortyndingsserie (f.eks. to dele) af de rå og klarede bløddyrekstrakter. På samme måde fremstilles en 10 gange fortyndingsserie af C. neoformans-celler (trin 5.4) fra 1 x 106 celler/ml til 1 x 101 celler/ml ved hjælp af steril PBS i plader med 96 brønde.
- Spred 200 μL af ekstrakterne på petriplader indeholdende L-DOPA agar ved hjælp af en vatpind, og lad dem tørre i 15 min.
- Spot 5 μL kultur fra hvert hul på L-DOPA pladen, så der er 1 cm mellem dråberne. Lad det tørre i mørke i 15 min.
- Pladerne inkuberes ved 30 °C og 37 °C i en statisk inkubator i 3-5 dage, idet der tages billeder hver 24. time med et kamera eller pladekamera (f.eks. scanner).
BEMÆRK: To temperaturforhold anvendes her til at undersøge temperaturens indflydelse på bløddyrekstrakternes væksthæmmende virkninger, hvor 30 °C repræsenterer miljømæssige og 37 °C repræsenterer menneskelige fysiologiske temperaturer.
6. Virkning af bløddyrekstrakter på C. neoformans polysaccharidkapselproduktion
- Forbered lavt jernmedium (LIM) som beskrevet nedenfor.
- 5 g chelateringsharpiks (se materialetabel) opløses i 60 ml ultrarent vand og pakkes i en glassøjle (2 cm diameter x 25 cm længde). Vask kolonnen med 100 ml vand, og kassér det opsamlede vand.
- Forbered lavt jernvand (LI-vand) ved at føre 2 liter sterilt ultrarent vand gennem chelateringskolonnen. Opbevar LI-vandet ved 4 °C i op til 3 måneder.
- 5 g glucose opløses i 100 ml LI-vand. 5 g L-asparagin opløses i 200 ml LI-vand i et separat bægerglas.
- Der tilsættes følgende til 500 ml LI-vand i rækkefølge: 4,78 g HEPES, 0,4 gK2HPO4, 0,08 gMgSO4,7H 2O, 1,85 g NaHCO3 og0,25g CaCl 2,2H2 O.
- Kombiner løsningerne fra trin 6.1.3 og trin 6.1.4. Der tilsættes 1 ml 100 mM bathophenanthrolindisulfonsyrenatriumsalt (BPS) til en slutkoncentration på 100 μM.
- Juster pH-værdien til 7,2 med 1 M LI-MOPS. Tilsæt LI-vand til et endeligt volumen på 1 L, og filtrer - steriliser mediet ved at føre det gennem en 0,22 μm membran. Der tilsættes 100 μL steril thiamin (4 mg/ml) til mediet.
- 5 ml YNB-substrat podes med 50 μL C. neoformans-kulturen fra trin 4.1. Der inkuberes i 16-18 timer ved 30 °C og 200 omdr./min. Brug denne kultur til at inokulere 5 ml LIM til en endelig koncentration på 105 celler / ml.
- Der tilsættes passende mængder bløddyrekstrakter (f.eks. en dobbelt fortynding eller det volumen, der er bestemt ud fra tidligere virulensanalyser) for at nå de ønskede koncentrationer. Der inkuberes i 72 timer ved 37 °C og 200 o/min med løsnede hætter. Efter inkubation opsamles 1 ml celler, og 2x vaskes med steril PBS, pH 7,4, ved 1.500 × g i 2 minutter ved 4 °C.
- Opslæmp forsigtigt cellerne i 1 ml PBS. Bland cellerne med India Ink i forholdet 1:1 (f.eks. 4 μL India Ink med 4 μL cellesuspension) over et glasmikroskopglas. Placer en dæksel oven på diaset.
- Visualiser prøverne ved hjælp af et differentialinterferenskontrastmikroskop (DIC) med et 63x oliemål (se materialetabel). Indstil kontrasten til automatisk, og fokuser manuelt ved hjælp af mikroskophjulet. Vælg alle billederne, og eksporter dem i TIFF-format. Det er ikke nødvendigt at anvende filtre.
- Brug linealværktøjet i ImageJ20 til at kvantificere forholdet mellem den samlede cellestørrelse (inklusive kapslen) og cellekropsstørrelsen.
7. Virkning af bløddyrekstrakter på C. neoformans biofilmproduktion
- 5 ml YNB-substrat podes med 50 μL C. neoformans-kultur fra trin 4.1. Der inkuberes i 16-18 timer ved 30 °C og 200 omdr./min.
- Høst celler fra 5 ml kulturen. Cellerne vaskes med steril PBS, pH 7,4, ved 1.500 × g i 2 minutter ved 4 °C.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Resuspender cellerne i 3 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) til en slutkoncentration på 107 celler / ml.
- 300 μL af cellesuspensionen overføres til de enkelte brønde i en steril, polystyren, fladbundet plade med 24 brønde. Brug kun brønde med medier som kontrol.
- Der tilsættes passende mængder bløddyrekstrakter (f.eks. en dobbelt fortynding eller det volumen, der er bestemt ud fra tidligere virulensanalyser) for at nå en slutkoncentration på 10-20 μg/ml protein. Sørg for, at ekstraktvolumenet ikke er større end 10% af det samlede volumen.
- Pladerne pakkes ind med aluminiumsfolie (for at undgå mediefordampning) og inkuberes i 48 timer ved hjælp af en statisk inkubator ved 30 °C og 37 °C.
- Brug en flaske eller dispenser til at vaske brøndene 2x med sterilt vand, og lad dem lufttørre i 10-15 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 100 μL 0,3% krystalviolet opløsning til hvert hul (inklusive kontrolhullerne kun med medium) og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Vask brøndene grundigt 3x med sterilt vand (biofilmene forstyrres ikke under vask). Tilsæt 200 μL 100% ethanol, og inkuber i 10 minutter ved RT.
- Overfør 75 μL til en ny fladbundet plade med 96 brønde, og læs OD550. Kvantificer biofilmdannelsen som (OD 550nm af prøve - OD550nm af blindprøve).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den arbejdsgang, der er beskrevet heri, muliggør isolering af proteiner og peptider fra bløddyr med potentielle antivirulensegenskaber mod C. neoformans. På samme måde giver vurdering af forskellige former for ekstrakter (dvs. rå og klargjort) mulighed for semirensning af de potentielle aktive forbindelser og understøtter downstream-vurdering (f.eks. massespektrometribaseret proteomics). Typisk producerer proteinekstraktionsarbejdsgangen homogeniserede opløsninger med proteinkoncentrationer på 4-8 mg / ml. Her viser de repræsentative resultater vurderingen af den enzymatiske aktivitet og svampedræbende egenskaber af C. chinensis-ekstrakter. De rå og klarede ekstrakter var i stand til at hæmme den proteolytiske aktivitet af subtilisin A (relateret til virulens i C. neoformans) (figur 3) med IC 50-værdier på henholdsvis 5,3 μg / ml og4,53 μg / ml. Aktiviteten af C. chinensis ekstrakterne blev yderligere testet mod processer forbundet med C. neoformans virulensfaktor produktion, herunder svampevækst, kapsel og melanin produktion, og dannelsen af biofilm. Der var en signifikant reduktion i svampevæksten ved 37 °C ved tilstedeværelse af de rå (figur 4A) og klarede (figur 4B) C. chinensis-ekstrakter. Især var der ingen ændringer i kapsel- eller melaninproduktionen ved tilstedeværelse af rå eller klarede C. chinensis-ekstrakter (figur 4C, D). Imidlertid blev der observeret en signifikant reduktion på 70%-80% i biofilmdannelse ved høje koncentrationer af råstoffet (figur 4E) og klarede (figur 4F) ekstrakter i forhold til den ubehandlede kontrol.
Figur 1: Arbejdsproces for total proteinekstraktion fra bløddyr. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Generel strategi anvendt til at vurdere virkningerne af bløddyrekstrakter på proteolytisk aktivitet, vækst og virulensfaktorproduktion i Cryptococcus neoformans. DIC = differentiel interferenskontrastmikroskopi. Optisk densitetsmåling angivet med bølgelængden i nanometer (nm). Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af virkningerne af bløddyrproteinekstrakter på subtilisins proteolytiske aktivitet. (B) C. chinensis klarede ekstrakter. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af tre replikater. Søjler angiver standardafvigelse. IC50 = halv maksimal hæmmende koncentration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af virkningerne af C. chinensis-ekstrakter på virulensfaktorproduktion i C. neoformans. (A,B) Vækst af C. neoformans ved 37 °C under tilstedeværelse af henholdsvis rå og klarede C. chinensis-ekstrakter. C) DIC-mikroskopibilleder af C. neoformans, der viser kapselproduktion under tilstedeværelse af rå (50 μg/ml) og klarede (40 μg/ml) ekstrakter. Skalastang = 10 μm. (D) Melaninproduktion af C. neoformans ved tilstedeværelse af rå (440 μg/ml) og klarede (410 μg/ml) ekstrakter ved 30 °C og 37 °C. (E,F) Relativ biofilmdannelse af C. neoformans ved tilstedeværelse af henholdsvis rå og klarede ekstrakter. Til statistisk analyse blev der udført en envejs ANOVA test og en Dunnetts multiple sammenligningstest. *p < 0,05; **p < 0,01; og ****p < 0,0001. Hver værdi svarer til et gennemsnit på mindst fem biologiske replikater og to tekniske replikater. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. De viste melaninbilleder er repræsentative for tre biologiske replikater og to tekniske replikater. De viste kapselbilleder er repræsentative for 40-50 celler pr. Tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekstraktionsprotokollen beskrevet her skitserer isoleringen af forbindelser fra bløddyr indsamlet fra Ontario, Canada, og demonstrerer en ny undersøgelse af anvendelse af bløddyrekstrakter mod det humane svampepatogen, C. neoformans. Denne protokol føjer sig til en voksende mængde forskning, der undersøger peptidasehæmmeraktivitet fra hvirvelløse dyr13. Under ekstraktionen var nogle ekstraktprøver vanskelige at filtrere-sterilisere, muligvis på grund af tilstedeværelsen af opløselige polysaccharider og / eller pigmenter, der blokerede filtermembranen. For at overvinde denne begrænsning anbefales det først at filtrere gennem en 5 μm membran for at udelukke store forbindelser (f.eks. Forstyrrede cellemembraner, genom-DNA), hvilket tillader proteinerne at passere gennem filteret og derefter filtrere igen gennem en 0,22 μm membran. Disse trin er afgørende for protokollen, da de begrænser tilstedeværelsen af mikrober, der kan forurene prøverne og forstyrre nedstrømseksperimenter.
Under denne undersøgelse blev peptidasehæmmere påvist mod subtilisin A, et modelenzym for S8-familien af subtilisin. Medlemmer af denne enzymfamilie er bredt fordelt blandt organismer og har forskellige roller, såsom i proteinforarbejdning, ernæring og virulensmekanismer21,22, som understøtter de fænotypiske virkninger, der observeres i denne undersøgelse. For eksempel blev der observeret en signifikant reduktion i svampevækst i nærvær af både rå og klarede ekstrakter og ved relativt høje og lave koncentrationer, hvilket tyder på, at den hæmmende aktivitet var robust i den testede model. Det er bemærkelsesværdigt, at når man måler OD med en pladelæser, forårsagede tilstedeværelsen af ekstrakterne klumpning af svampecellerne i bunden af brønden, hvilket forstyrrer vækstmålingen. Denne begrænsning kan overvindes ved at bruge en højhastighedsrysteinkubator (f.eks. 900 o / min), som ville undgå celleklumpning.
Der kan være andre tekniske begrænsninger, som kan påvirke de forventede fænotypiske observationer. For eksempel er subtilisinlignende peptidaser forbundet med melaninsyntese og quorum-sensing i C. neoformans, men de rå eller klarede ekstrakter fra bløddyr viser ikke signifikante virkninger på melaninproduktionen16,17,18. Dette skyldes muligvis den naturlige beskyttende virkning af melanin og kapsel mod eksterne stoffer, hvilket kan forhindre bløddyrekstrakterne i at påvirke svampens intracellulære komponenter. Vigtige faktorer, der skal overvejes, når man arbejder med organiske substrater, omfatter behovet for at opløse dem i dimethylsulfoxid (DMSO), hvilket kan give opløselighedsproblemer i agarpladen (som anvendt i melaninanalyserne). For at overvinde dette problem kan ekstrakterne spredes langs overfladen af agarpladen og få lov til at tørre, før svampecellerne opdages på pladen.
Tidligere arbejde viste følsomheden af C. neoformans biofilm for to svampedræbende midler in vitro, herunder amphotericin B og caspofungin; Svampen var imidlertid resistent over for fluconazol og voriconazol23. I betragtning af betydningen af svampebiofilm i virulens og antimikrobiel resistens ville det være værdifuldt at afdække nye strategier til at forstyrre eller forstyrre dannelsen af biofilm. I den aktuelle undersøgelse svækkede rå og klarede ekstrakter fra C. chinensis dannelsen af biofilm af kryptokokceller med tilsyneladende dosisresponsadfærd. Disse resultater understøtter tilgangens virkning og nyhed. Især blev biofilmdannelsen hæmmet i højere grad ved behandling med råstoffet sammenlignet med det klarede ekstrakt, hvilket kan skyldes tab af hæmmende forbindelser under klaringsprocessen eller en reduktion i hæmmende funktion under de testede betingelser. Det er muligt, at de proteiner, der er ansvarlige for disse hæmmende virkninger, har høj molekylvægt og gik tabt under klaringsprocessen eller var modtagelige for nedbrydning under den termiske behandling. Disse resultater fremhæver vigtigheden af at bruge både rå og klarede ekstrakter til at detektere ændringer i hæmmende funktioner, da forskelle relateret til inhibitorkilden kan påvirke resultatet.
Samlet set muliggør denne protokol ekstraktion af forbindelser fra bløddyr og måling af formodet hæmmende aktivitet mod en udvalgt peptidase med demonstrerede roller i svampevirulens. I denne protokol blev ekstrakternes høje udbytte og stærke peptidasehæmmende aktivitet og deres virkning mod C. neoformans vækst og biofilmdannelse evalueret. Mens der er behov for yderligere forsøg, understreger disse resultater bløddyrs betydning som formodede nye kilder til forbindelser mod dette farlige svampepatogen. Selv om denne protokol fokuserer på ekstraktion af inhibitorer fra bløddyr, kan metoden desuden tilpasses andre hvirvelløse dyr og kan anvendes til at vurdere virkningen af inhibitorer afledt af forskellige hvirvelløse dyr på virulensfaktorproduktion i en række mikroorganismer, herunder svampe og bakterier24,25,2 6 . I sidste ende kan udvinding af forbindelser fra naturlige kilder øge repertoiret af formodede nye antimikrobielle midler og dermed forbedre vores evne til at bekæmpe infektionssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer af Geddes-McAlister Lab for deres værdifulde støtte gennem hele denne undersøgelse og deres manuskriptfeedback. Forfatterne anerkender finansieringsstøtten fra Ontario Graduate Scholarship og International Graduate Research Award - University of Guelph til D. G.-G og fra Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) og Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award for J. G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
