Summary
הפתוגן הפטרייתי האנושי Cryptococcus neoformans מייצר מגוון גורמים אלימים (למשל, פפטידאזות) כדי לקדם את הישרדותו בתוך הפונדקאי. נישות סביבתיות מייצגות מקור מבטיח של מעכבי פפטידאז טבעיים חדשים. פרוטוקול זה מתאר את הכנת התמציות מרכיכות ואת הערכת השפעתן על ייצור גורמי אלימות פטרייתיים.
Abstract
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי עטוף עם תפוצה עולמית המדביקה בעיקר אנשים מדוכאי חיסון. השימוש הנרחב בתרופות אנטי-פטרייתיות במסגרות קליניות, השימוש בהן בחקלאות והכלאת זנים הובילו לאבולוציה מוגברת של עמידות. שיעור עולה זה של עמידות נגד אנטי פטרייתיות הוא דאגה גוברת בקרב רופאים ומדענים ברחבי העולם, ויש דחיפות מוגברת לפתח טיפולים אנטי פטרייתיים חדשניים. לדוגמה, C. neoformans מייצר מספר גורמי אלימות, כולל אנזימים תוך-תאיים וחוץ-תאיים (למשל, פפטידאזות) עם תפקידים בפירוק רקמות, ויסות תאי ורכישת חומרים מזינים. ההפרעה לפעילות פפטידאז כזו על ידי מעכבים מפריעה לגדילה ולשגשוג של פטריות, מה שמרמז על כך שזו עשויה להיות אסטרטגיה חשובה למאבק בפתוגן. חשוב לציין, חסרי חוליות כגון רכיכות מייצרים מעכבי פפטידאז עם יישומים ביו-רפואיים ופעילות אנטי-מיקרוביאלית, אך הם אינם נחקרים מספיק במונחים של השימוש בהם נגד פתוגנים פטרייתיים. בפרוטוקול זה, בוצע מיצוי גלובלי מרכיכות כדי לבודד מעכבי פפטידאז פוטנציאליים בתמציות גולמיות ומזוקקות, והוערכו השפעתם נגד גורמי אלימות קריפטוקוקליים קלאסיים. שיטה זו תומכת בתעדוף רכיכות בעלות תכונות אנטי פטרייתיות ומספקת הזדמנויות לגילוי חומרים אנטי-אלימים על ידי רתימת המעכבים הטבעיים הנמצאים ברכיכות.
Introduction
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי המייצר מחלה קשה אצל מארחים מדוכאי חיסון, כגון אנשים החיים עם HIV / איידס1, ומוביל לכ -19% ממקרי המוות הקשורים לאיידס2. הפטרייה רגישה למספר סוגים של אנטי פטרייתיות, כולל אזולים, פולינים ופלוציטוזין, המפעילים פעילות קוטלת פטריות ופטריות באמצעות מנגנונים נפרדים 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב באנטי-פטרייתיות בסביבה קלינית וחקלאית בשילוב עם הכלאת זנים הגבירו את התפתחות העמידות במינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans5.
כדי להתגבר על האתגרים של עמידות נגד פטריות ולהפחית את השכיחות של זיהומים פטרייתיים בקנה מידה עולמי, גישה מבטיחה היא להשתמש בגורמי האלימות של Cryptococcus spp. (למשל, יכולת הסתגלות לטמפרטורה, כמוסה רב-סוכרית, מלנין ואנזימים חוץ-תאיים) כמטרות טיפוליות פוטנציאליות 4,6 . לגישה זו מספר יתרונות, שכן גורמי אלימות אלה מאופיינים היטב בספרות, ומיקוד גורמים אלה עשוי להפחית את שיעורי העמידות האנטי פטרייתית על ידי הטלת לחץ סלקטיבי חלש יותר באמצעות פגיעה באלימות במקום להתמקד בצמיחת תאים6. בהקשר זה, מחקרים רבים העריכו את האפשרות להתמקד באנזימים חוץ-תאיים (למשל, פרוטאזות, פפטידאזות) כדי להפחית או לעכב את האלימות של Cryptococcus spp.7,8,9.
לאורגניזמים כמו חסרי חוליות וצמחים אין מערכת חיסון נרכשת שתגן על עצמם מפני פתוגנים. עם זאת, הם מסתמכים על מערכת חיסון מולדת חזקה עם מגוון עצום של תרכובות כימיות כדי להתמודד עם מיקרואורגניזמים וטורפים10. מולקולות אלה כוללות מעכבי פפטידאז, הממלאים תפקידים חשובים במערכות ביולוגיות רבות, כולל תהליכים תאיים של חסינות חסרי חוליות, כגון קרישה של המולימפה, סינתזה של ציטוקינים ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים, והגנה על פונדקאים על ידי השבתה ישירה של פרוטאזות של פתוגנים11. לפיכך, מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות כגון רכיכות הם בעלי יישומים ביו-רפואיים פוטנציאליים, אך רבים מהם נותרים בלתי מאופיינים10,12,13. בהקשר זה, ישנם כ-34 מינים של רכיכות יבשתיות באונטריו ו-180 רכיכות מים מתוקים בקנדה14. עם זאת, הפרופיל והאפיון המעמיקים שלהם עדיין מוגבלים15. אורגניזמים אלה מהווים הזדמנות לזיהוי תרכובות חדשות בעלות פעילות אנטי-פטרייתית פוטנציאלית10.
בפרוטוקול הזה מתוארות שיטות לבודד ולהבהיר תמציות מחסרי חוליות (למשל רכיכות) (איור 1), ולאחר מכן למדוד את הפעילות המעכבת המשוערת של הפפטידאז. לאחר מכן מעריכים את התכונות האנטי-פטרייתיות של התמציות האלה על-ידי מדידת ההשפעה שלהן על ייצור פקטורי אלימות של C. neoformans באמצעות בדיקות פנוטיפיות (איור 2). חשוב לציין כי הבדלים בתכונות האנטי-פטרייתיות בין תמציות גולמיות ומזוקקות עשויים להצביע על גורמים מיקרוביאליים (למשל, מטבוליטים משניים או רעלנים המיוצרים על-ידי המיקרוביום המארח) של הרכיכה, אשר עשויים להשפיע על תצפיות ניסיוניות. ממצאים אלה תומכים בצורך של פרוטוקול זה להעריך תמציות גולמיות והבהרות באופן עצמאי כדי לפענח את דרכי הפעולה. בנוסף, תהליך המיצוי אינו מוטה ועשוי לאפשר זיהוי תכונות מיקרוביאליות כנגד שפע של פתוגנים פטרייתיים וחיידקיים. לכן, פרוטוקול זה מספק נקודת התחלה לתעדוף מיני רכיכות בעלות תכונות אנטי-פטרייתיות כנגד C. neoformans והזדמנות להעריך את הקשרים בין פעילות אנזימטית לייצור גורמי אלימות באמצעות מנגנוני עיכוב משוערים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מיצוי חלבון מרכיכות
- אספו רכיכות מאזור טבעי ייעודי ומאושר (למשל, ספיד ריבר, גואלף, אונטריו). עבור מחקר זה, הן מינים מקומיים והן מינים פולשים נבחרו כדי להעריך מגוון רחב של השפעות אנטי פטרייתיות פוטנציאליות.
- שברו בעדינות את קליפת הרכיכות (למשל, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi ו-Cipangopaludina chinensis) באמצעות מזיק וטיט, והוציאו את החתיכות המוצקות בעזרת זוג פינצטה. בדרך כלל, 10 רכיכות מאוגדות לשימוש לאורך כל הפרוטוקול.
- לאסוף ולשקול את האיברים. כ 15-20 גרם של מדגם הוא אופטימלי. השתמש מספריים לחתוך את האיברים לחתיכות קטנות על 0.5-1 ס"מ בגודל.
- להקפיא במהירות הבזק את דגימות האיברים שנותחו ולחתוך עם חנקן נוזלי. לאחר מכן, טחנו את דגימות האיברים לאבקה דקה באמצעות מזיק וטיט.
- הוסיפו את אבקת דגימת האיברים (כ-15 גרם) ל-30 מ"ל מים מזוקקים קרים (4°C) כדי להשיג יחס של 1:2 (w/v).
- יוצקים 2 מ"ל של המדגם לתוך צינורות השפעה גבוהה 2 מ"ל. הוסיפו כף מדידה של חרוזי נירוסטה בקוטר 3 מ"מ (כ-500 מיקרוגרם) לכל צינור, ובצעו הומוגניות באמצעות בלנדר (ראו טבלת חומרים) למשך 3 דקות ב-1,200 סל"ד וב-4°C.
- צנטריפוגה ב 12,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. לאסוף את כל supernatants עם פיפטה בצינור טרי 50 מ"ל, לזרוק את הכדור.
- מסננים ומעקרים את הסופרנאטנט באמצעות קרום של 0.22 מיקרומטר. אחסנו את הדגימות על קרח, והמשיכו לפרוטוקול ההבהרה (סעיף 2), לפי העניין.
הערה: ניתן להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי במהירות של -20°C כדי להשתמש בהן כתמציות גולמיות.
2. הבהרה של תמצית רכיכות
- הניחו את דגימת הסופרנאטנט משלב 1.8 באמבט תרמי בטמפרטורה של 60°C למשך 30 דקות. לאחר מכן, קררו את הדגימות במהירות על ידי העברתן לדלי עם קרח למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה הדגימות ב 15,000 × גרם במשך 45 דקות ב 4 ° C. אוספים את הסופרנאטנט בצינור טרי של 50 מ"ל, ומשליכים את הכדור. סנן וחטא את הדגימות באמצעות מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן אחסן אותן על קרח.
- קבע את ריכוז החלבון בדגימות משלב 1.8 (כלומר, תמצית גולמית) ושלב 2.2 (כלומר, תמצית מזוקקת) באמצעות בדיקת כימות (למשל, בדיקת חומצה ביכונינגית17). טווח ריכוז החלבון האופטימלי הוא 4-8 מ"ג/מ"ל.
- אחסנו את הדגימות על קרח עד שעה או הקפאת הבזק בחנקן נוזלי, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20°C עד לצורך.
3. בדיקת פעילות מעכבת
- למדוד את הפעילות המעכבת של התמציות הגולמיות והמזוקקות באמצעות בדיקות אנזימטיות בשלשה טכנית.
הערה: כל בדיקה אנזימטית מורכבת מאנזים (למשל, סובטיליסין A, המעורב באלימות פטרייתית 16,17,18; בדרך כלל בסביבות 1 x 10-9 mol/L עבור בדיקות מבוססות כרומוגניות), חיץ ומצע. התגובה מתחילה כאשר הסובסטרט פוגש את האנזים. הפעילות האנזימטית פרופורציונלית לקצב המרת המצע למוצר. - להעריך את ההשפעה של ריכוז אנזים (EC) על פעילות אנזימטית (EA) עד לקבלת תלות ליניארית בין שני הפרמטרים. עבור השלבים הבאים, השתמש בריכוז אנזים בטווח הליניארי הנמדד.
הערה: הבדיקה האנזימטית עבור peptidase subtilisin A מפורטת בשלבים הבאים. - יש לדגור על תמציות חלבון הרכיכות הגולמי (שלב 1.11) או המזוקק (שלב 2.5) (למשל, 10 מיקרוליטר המכיל 4 מ"ג/מ"ל חלבון) עם 10 מיקרוליטר של סובטיליסין A (ריכוז נקבע משלב 3.2), ו-220 מיקרוליטר של 100 מילימטר Tris-HCl ב-pH 8.6 (לביקורת, הוסף 230 מיקרוליטר של חיץ Tris מבלי להוסיף את התמצית) למשך 10 דקות ב-25°C בצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.
- הוסף 10 μL של N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, המצע עבור subtilisin A, בריכוז סופי של 1 Km (קבוע Michaelis-Menten; 0.2 mM עבור מצע זה עם subtilisin A) לקבלת נפח תגובה סופי של 250 μL.
- מדוד את הפעילות האנזימטית על ידי ניטור מראה המוצר לאורך זמן על ידי קריאת הצפיפות האופטית (OD) ב- 405 ננומטר כל 15 שניות למשך 3 דקות.
- לקבוע את הפעילות האנזימטית השיורית על ידי חישוב היחס בין הפעילות האנזימטית בנוכחות תמצית הרכיכה לזו שבהיעדר התמצית.
- אם נצפתה פעילות מעכבת (כלומר, פעילות שיורית מתחת ל-1), יש למדוד את ערך הריכוז המעכב 50 (IC50) באמצעות טווח ריכוזים של התמציות (למשל, סדרת דילול כפולה מ-200 מיקרוגרם/מ"ל עד 1 מק"ג/מ"ל) בשיטות סטנדרטיות19.
4. השפעת תמציות רכיכות על צמיחת C. neoformans
- השתמש בקצה פיפטה של 10 μL כדי להכניס מושבה אחת של C. neoformans var. grubii H99 wild-type (WT) לתוך 5 מ"ל של תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD) בינוני (10 גרם / ליטר תמצית שמרים, 20 גרם / ליטר פפטון, ו 20 גרם / ליטר דקסטרוז, pH 6.5), ודגור במשך 16-18 שעות ב 30 ° C ו 200 סל"ד. בצע את הניסוי בשכפול ביולוגי משולש וטכני.
- לאסוף 500 μL של התרבית בקובט, ולמדוד את הצמיחה על ידי קריאת OD ב 600 ננומטר. לדלל את התרבית עם בסיס חנקן שמרים (YNB) בינוני OD600 סופי של 0.02.
- תרבית משותפת של תאי C. neoformans בעלי ריכוזים שונים (למשל, סדרת דילול משולשת מ-440 מיקרוגרם/מ"ל ל-15 מק"ג/מ"ל חלבון) של התמציות (כלומר, גולמיות ומזוקקות). כדי לעשות זאת, מערבבים 10 μL של תמציות עם 190 μL של תרבות C. neoformans מדולל (שלב 4.2) בצלחת 96 באר.
- מדוד את הצמיחה על-ידי קריאת OD600 באמצעות קורא לוחות כל 15 דקות עד שעה למשך 72 שעות ב-200 סל"ד וב-37°C.
5. השפעת תמציות רכיכות על ייצור מלנין C. neoformans
- הכינו צלחות L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA).
- Autoclave 230 מ"ל של 14 גרם / ליטר אגר, ולתת לו להתקרר עד שהוא מגיע 50-60 ° C.
- הוסף 3.25 מ"ל של 1 M גליצין, 7.35 מ"ל של 1 M KH 2 PO 4, 2.5 מ"ל של 1 M MgSO4.7H 2 O, 0.6 מ"ל של 40% גלוקוז, 70 μL של 10 mM תיאמין, ו2.5מ"ל של 100 mM L-DOPA (מעוקר) לאגר נוזלי.
- יוצקים 15 מ"ל מהתערובת לצלחות פטרי, נותנים להם להתייבש כשעה בחושך, ומאחסנים ב 2-4 מעלות צלזיוס עד שבוע אחד. ודא שהמכסים מורמים חלקית כדי שהאגר יתייבש כראוי.
- חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד.
- סובבו את התאים בטמפרטורה של 1,000 × למשך 5 דקות ב-4°C. שטפו את התאים פי 2 עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ב-pH 7.4.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS כדי להגיע לריכוז סופי של 106 תאים / מ"ל.
- הכינו סדרת דילול (למשל, כפולה) של תמציות הרכיכות הגולמיות והמזוקקות. באופן דומה, הכינו סדרת דילול פי 10 של תאי C. neoformans (שלב 5.4) מ-1 x 106 תאים/מ"ל ל-1 x 101 תאים /מ"ל באמצעות PBS סטרילי בלוחות 96 בארות.
- מורחים 200 מיקרוליטר מהתמציות על צלחות פטרי המכילות אגר L-DOPA באמצעות מקלון, ומניחים להן להתייבש במשך 15 דקות.
- יש לכרות 5 μL של תרבית מכל באר על צלחת L-DOPA, ולהשאיר 1 ס"מ בין טיפות. תן לו להתייבש בחושך במשך 15 דקות.
- דגרו על הלוחות בטמפרטורה של 30°C ו-37°C באינקובטור סטטי למשך 3-5 ימים, ולכדו תמונות כל 24 שעות באמצעות מצלמה או מצלמת צלחות (למשל, סורק).
הערה: שני תנאי טמפרטורה משמשים כאן כדי לחקור את השפעת הטמפרטורה על ההשפעות מעכבות הצמיחה של תמציות הרכיכות, כאשר 30 ° C מייצג את הסביבה ו 37 ° C מייצג טמפרטורות פיזיולוגיות אנושיות.
6. השפעת תמציות רכיכות על ייצור כמוסות פוליסכריד C. neoformans
- הכינו מדיום דל ברזל (LIM) כמתואר להלן.
- יש להמיס 5 גרם של שרף כלאט (ראו טבלת חומרים) ב-60 מ"ל מים טהורים במיוחד, ולארוז בעמוד זכוכית (קוטר 2 ס"מ x 25 ס"מ אורך). לשטוף את העמוד עם 100 מ"ל של מים, ולהשליך את המים שנאספו.
- הכינו מים דלי ברזל (LI-water) על ידי העברת 2 ליטר של מים סטריליים אולטרה-טהורים דרך עמוד הכלאטינג. אחסנו את מי ה-LI בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.
- להמיס 5 גרם של גלוקוז ב 100 מ"ל של LI-מים. ממיסים 5 גרם של L-אספרגין ב 200 מ"ל של מי LI בכד נפרד.
- הוסף את הדברים הבאים ל- 500 מ"ל של מי LI לפי הסדר: 4.78 גרם HEPES, 0.4 גרם של K 2 HPO 4, 0.08 גרם של MgSO4.7H 2 O, 1.85 גרם של NaHCO3 ו- 0.25 גרם של CaCl 2.2H2 O.
- שלב את הפתרונות משלב 6.1.3 ושלב 6.1.4. הוסף 1 מ"ל של 100 mM חומצה bathophenanthrolinedisulfonic חומצה מלח נתרן (BPS) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
- כוונן את ה- pH ל- 7.2 עם 1 M LI-MOPS. מוסיפים LI-water לנפח סופי של 1 ליטר, ומסננים את התווך על ידי העברתו דרך קרום של 0.22 מיקרומטר. הוסף 100 μL של תיאמין סטרילי (4 מ"ג / מ"ל) למדיום.
- חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד. השתמש בתרבית זו כדי לחסן 5 מ"ל של LIM לריכוז סופי של 105 תאים / מ"ל.
- הוסף נפחים מתאימים של תמציות הרכיכות (למשל, דילול כפול או נפח שנקבע מבדיקות אלימות קודמות) כדי להגיע לריכוזים הרצויים. יש לדגור במשך 72 שעות ב-37°C וב-200 סל"ד עם מכסים משוחררים. לאחר הדגירה, לאסוף 1 מ"ל של תאים, ולשטוף 2x עם PBS סטרילי, pH 7.4, ב 1,500 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C.
- בעדינות להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS. ערבבו את התאים עם דיו הודו ביחס של 1:1 (למשל, 4 מיקרוליטר של דיו הודו עם 4 מיקרוליטר של תרחיף תאים) מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית. הניחו תלוש כיסוי על גבי השקופית.
- דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) עם מטרת שמן 63x (ראו טבלת חומרים). הגדר את הניגודיות לאוטומטית, והתמקד ידנית באמצעות חוגת המיקרוסקופ. בחר את כל התמונות וייצא אותן בתבנית TIFF. אין צורך להחיל מסננים.
- בעזרת הכלי סרגל ב- ImageJ20, כימות היחס בין גודל התא הכולל (כולל הקפסולה) לגודל גוף התא.
7. השפעת תמציות רכיכות על ייצור ביופילם של C. neoformans
- חסן 5 מ"ל של מדיום YNB עם 50 μL של תרבית C. neoformans משלב 4.1. יש לדגור במשך 16-18 שעות ב-30°C וב-200 סל"ד.
- קציר תאים מתרבית 5 מ"ל. שטפו את התאים עם PBS סטרילי, pH 7.4, ב 1,500 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להשהות מחדש את התאים ב 3 מ"ל של Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) לריכוז סופי של 107 תאים / מ"ל.
- מעבירים 300 μL של תרחיף התא לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית, פוליסטירן, שטוחה תחתית 24 בארות. השתמש בארות עם מדיה רק כבקרה.
- הוסף נפחים מתאימים של תמציות הרכיכות (למשל, דילול כפול או נפח שנקבע מבדיקות אלימות קודמות) כדי להגיע לריכוז סופי של 10-20 מיקרוגרם / מ"ל חלבון. ודא שנפח החילוץ אינו גדול מ- 10% מהנפח הכולל.
- עטפו את הלוחות ברדיד אלומיניום (כדי למנוע אידוי מדיה), ודגרו במשך 48 שעות באמצעות אינקובטור סטטי בטמפרטורה של 30°C ו-37°C.
- באמצעות בקבוק או מתקן לשטוף את הבארות 2x עם מים סטריליים, ולתת להם להתייבש באוויר במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 100 μL של תמיסה סגולה גבישית 0.3% לכל באר (כולל בארות הבקרה הבינוניות בלבד), ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- שטפו היטב את הבארות 3x במים סטריליים (הביופילמים לא יופרעו במהלך השטיפה). הוסיפו 200 μL של 100% אתנול, ודגרו במשך 10 דקות ב-RT.
- העבר 75 μL לצלחת שטוחה חדשה בעלת 96 בארות, וקרא את OD550. כמת את היווצרות הביופילם כ- (OD 550nm של מדגם - OD550nm של ריק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך העבודה המתואר כאן מאפשר בידוד של חלבונים ופפטידים מרכיכות בעלות תכונות אנטי-אלימות פוטנציאליות נגד C. neoformans. באופן דומה, הערכת צורות שונות של תמציות (כלומר, גולמיות ומובהרות) מאפשרת טיהור למחצה של החומרים הפעילים הפוטנציאליים ותומכת בהערכה במורד הזרם (למשל, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות). בדרך כלל, תהליך מיצוי החלבון מייצר תמיסות הומוגניות עם ריכוזי חלבון של 4-8 מ"ג / מ"ל. כאן, התוצאות המייצגות מדגימות את הערכת הפעילות האנזימטית והתכונות האנטי פטרייתיות של תמציות C. chinensis. התמציות הגולמיות והמזוקקות הצליחו לעכב את הפעילות הפרוטאוליטית של סובטיליסין A (הקשורה לאלימות ב-C. neoformans) (איור 3), עם ערכי IC 50 של 5.3 מיקרוגרם/מ"ל ו-4.53 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. הפעילות של תמציות C. chinensis נבדקה גם מול תהליכים הקשורים לייצור פקטורי אלימות של C. neoformans, כולל גדילה פטרייתית, ייצור קפסולות ומלנין, ויצירת ביופילמים. נצפתה ירידה משמעותית בצמיחת פטריות ב-37°C בנוכחות תמציות C. chinensis גולמיות (איור 4A) שהובהרו (איור 4B). יש לציין כי לא היו שינויים בייצור כמוסות או מלנין בנוכחות תמציות C. chinensis גולמיות או מזוקקות (איור 4C,D). עם זאת, נצפתה ירידה משמעותית של 70%-80% בהיווצרות ביופילם בריכוזים גבוהים של תמציות גולמי (איור 4E) והבהרה (איור 4F) ביחס לקבוצת הביקורת שלא טופלה.
איור 1: זרימת עבודה למיצוי חלבון כולל מרכיכות. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיה כללית המשמשת להערכת ההשפעות של תמציות רכיכות על פעילות פרוטאוליטית, גדילה וייצור גורמי אלימות בניאופורמנים של Cryptococcus. DIC = מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. מדידת צפיפות אופטית מסומנת עם אורך הגל בננומטרים (ננומטר). נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של ההשפעות של תמציות חלבון רכיכות על הפעילות הפרוטאוליטית של תמציות גולמיות מסוג subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis . (ב) C. chinensis תמציות הבהרה. כל נקודה מייצגת את הממוצע של שלושה עותקים משוכפלים. עמודות מציינות סטיית תקן. IC50 = ריכוז מעכב חצי מקסימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות של ההשפעות של תמציות C. chinensis על ייצור גורמי אלימות ב-C. neoformans. (א,ב) צמיחה של C. neoformans ב 37 °C בנוכחות תמציות C. chinensis גולמי ומזוקק, בהתאמה. (C) תמונות מיקרוסקופיות DIC של C. neoformans המראות ייצור קפסולות בנוכחות תמציות גולמיות (50 מיקרוגרם/מ"ל) והבהרות (40 מיקרוגרם/מ"ל). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) ייצור מלנין של C. neoformans בנוכחות תמציות גולמיות (440 מיקרוגרם/מ"ל) ומזוקקות (410 מיקרוגרם/מ"ל) ב-30°C וב-37°C. (E,F) היווצרות ביופילם יחסית של C. neoformans בנוכחות תמציות גולמיות ומזוקקות, בהתאמה. לצורך ניתוח סטטיסטי בוצעו מבחן ANOVA חד-כיווני ומבחן השוואה מרובה של דנט. *P < 0.05; **P < 0.01; ו- ****p < 0.0001. כל ערך מתאים בממוצע לממוצע של לפחות חמישה עותקים ביולוגיים ושני שכפולים טכניים. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. תמונות המלנין המוצגות מייצגות שלושה שכפולים ביולוגיים ושני שכפולים טכניים. תמונות הקפסולה המוצגות מייצגות 40-50 תאים לכל מצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המיצוי המתואר כאן מתאר את בידוד התרכובות מרכיכות שנאספו מאונטריו, קנדה, ומדגים מחקר חדשני של שימוש בתמציות רכיכות נגד הפתוגן הפטרייתי האנושי, C. neoformans. פרוטוקול זה מתווסף לגוף הולך וגדל של מחקרים החוקרים פעילות מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות13. במהלך המיצוי, חלק מדגימות התמצית היו קשות לעיקור סינון, אולי בשל נוכחותם של פוליסכרידים מסיסים ו / או פיגמנטים שחסמו את קרום המסנן. כדי להתגבר על מגבלה זו, מומלץ לסנן תחילה דרך קרום של 5 מיקרומטר כדי להוציא תרכובות גדולות (למשל, קרומי תאים משובשים, DNA גנומי), ובכך לאפשר לחלבונים לעבור דרך המסנן, ולאחר מכן לסנן שוב דרך קרום של 0.22 מיקרומטר. צעדים אלה הם קריטיים לפרוטוקול מכיוון שהם מגבילים את נוכחותם של מיקרובים שעלולים לזהם את הדגימות ולהפריע לניסויים במורד הזרם.
במהלך חקירה זו, מעכבי פפטידאז התגלו נגד subtilisin A, אנזים מודל עבור משפחת S8 של subtilisin. חברים במשפחת אנזימים זו מפוזרים באופן נרחב בין אורגניזמים ויש להם תפקידים שונים, כגון בעיבוד חלבונים, תזונה ומנגנוני אלימות21,22, התומכים בהשפעות הפנוטיפיות שנצפו במחקר זה. לדוגמה, נצפתה ירידה משמעותית בצמיחת פטריות בנוכחות תמציות גולמיות ומזוקקות ובריכוזים גבוהים ונמוכים יחסית, דבר המצביע על כך שהפעילות המעכבת הייתה איתנה במודל שנבדק. ראוי לציין כי בעת מדידת OD עם קורא לוחות, נוכחות התמציות גרמה גושים של תאים פטרייתיים בתחתית הבאר, להפריע למדידת הצמיחה. ניתן להתגבר על מגבלה זו על ידי שימוש באינקובטור טלטול במהירות גבוהה (למשל, 900 סל"ד), שימנע התגבשות תאים.
מגבלות טכניות אחרות עשויות להשפיע על התצפיות הפנוטיפיות הצפויות. לדוגמה, פפטידאזות דמויות סובטיליסין קשורות לסינתזה של מלנין ולחישת מניין ב-C. neoformans, אך התמציות הגולמיות או המזוקקות מרכיכות כלשהן אינן מראות השפעות משמעותיות על ייצור המלנין16,17,18. ייתכן שהסיבה לכך היא ההשפעה המגנה הטבעית של המלנין והקפסולה מפני גורמים חיצוניים, מה שעשוי למנוע מתמציות הרכיכות להשפיע על המרכיבים התוך-תאיים של הפטרייה. גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעבודה עם מצעים אורגניים כוללים את הצורך להמיס אותם בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), אשר עשוי להציג בעיות מסיסות בתוך צלחת האגר (כפי שנעשה במבחני המלנין). כדי להתגבר על בעיה זו, ניתן לפזר את התמציות על פני השטח של צלחת האגר ולאפשר להן להתייבש לפני איתור התאים הפטרייתיים על הצלחת.
עבודות קודמות הדגימו את הרגישות של ביופילמים של C. neoformans לשני חומרים אנטי פטרייתיים במבחנה, כולל אמפוטריצין B וקספופונגין; עם זאת, הפטרייה היתה עמידה fluconazole ו voriconazole23. בהתחשב בחשיבות של ביופילמים פטרייתיים באלימות ובעמידות מיקרוביאלית, חשיפת אסטרטגיות חדשות להפריע או לשבש את היווצרות הביופילם תהיה בעלת ערך. במחקר הנוכחי, תמציות גסות ומובהרות של C. chinensis פגעו בהיווצרות ביופילמים של תאים קריפטוקוקליים עם התנהגות מנה-תגובה לכאורה. תוצאות אלה תומכות בהשפעה ובחידוש של הגישה. יש לציין כי היווצרות ביופילם עוכבה במידה רבה יותר בטיפול בנפט הגולמי בהשוואה לתמצית המזוקקת, אשר עשויה לנבוע מאובדן תרכובות מעכבות במהלך תהליך הבירור או ירידה בתפקוד המעכב בתנאים שנבדקו. ייתכן שהחלבונים האחראים להשפעות מעכבות אלה הם בעלי משקל מולקולרי גבוה ואבדו במהלך תהליך הבירור או היו רגישים לפירוק במהלך הטיפול התרמי. תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של שימוש הן בתמציות גולמיות והן בתמציות מזוקקות כדי לזהות שינויים בתפקודים מעכבים, שכן הבדלים הקשורים למקור המעכב עשויים להשפיע על התוצאה.
בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר מיצוי תרכובות מרכיכות ומדידת פעילות מעכבת משוערת כנגד פפטידאז נבחר עם תפקידים מוכחים באלימות פטרייתית. בפרוטוקול זה נבדקה התפוקה הגבוהה והפעילות המעכבת הפפטידאז החזקה של התמציות והשפעתן על צמיחת C. neoformans והיווצרות ביופילם. בעוד שנדרשים ניסויים נוספים, תוצאות אלה מדגישות את חשיבותן של רכיכות כמקורות חדשים לכאורה של תרכובות נגד הפתוגן הפטרייתי המסוכן הזה. יתר על כן, בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהפקת מעכבים מרכיכות, המתודולוגיה ניתנת להתאמה לחסרי חוליות אחרים וניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההשפעה של מעכבים שמקורם בחסרי חוליות שונים על ייצור גורמי אלימות במגוון מיקרואורגניזמים, כולל פטריות וחיידקים24,25,2 6 . בסופו של דבר, מיצוי של תרכובות ממקורות טבעיים יכול להגדיל את הרפרטואר של סוכנים מיקרוביאליים חדשים לכאורה, ובכך לשפר את היכולות שלנו להילחם במחלות זיהומיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים לחברי מעבדת גדס-מקאליסטר על תמיכתם רבת הערך לאורך כל החקירה ועל המשוב שלהם על כתבי היד. המחברים מודים על תמיכת המימון של מלגת אונטריו לתארים מתקדמים ופרס המחקר הבינלאומי לתארים מתקדמים - אוניברסיטת גואלף ל- D. G.-G ומהקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) ומשרד המכללות והאוניברסיטאות של אונטריו - פרס החוקר המוקדם עבור J. G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
