Summary
Der humane Pilzpathogen Cryptococcus neoformans produziert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren (z.B. Peptidasen), um sein Überleben im Wirt zu fördern. Umweltnischen stellen eine vielversprechende Quelle für neuartige natürliche Peptidase-Inhibitoren dar. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Extrakten aus Mollusken und die Bewertung ihrer Wirkung auf die Produktion von Pilzvirulenzfaktoren.
Abstract
Cryptococcus neoformans ist ein verkapselter humaner Pilzerreger mit einer globalen Verbreitung, der vor allem immungeschwächte Individuen infiziert. Der weit verbreitete Einsatz von Antimykotika im klinischen Umfeld, ihre Verwendung in der Landwirtschaft und die Stammhybridisierung haben zu einer verstärkten Entwicklung der Resistenz geführt. Diese steigende Resistenzrate gegen Antimykotika ist ein wachsendes Problem unter Klinikern und Wissenschaftlern weltweit, und es besteht eine erhöhte Dringlichkeit, neuartige antimykotische Therapien zu entwickeln. Zum Beispiel produziert C. neoformans mehrere Virulenzfaktoren, einschließlich intra- und extrazellulärer Enzyme (z. B. Peptidasen), die beim Gewebeabbau, der zellulären Regulation und der Nährstoffaufnahme eine Rolle spielen. Die Störung einer solchen Peptidaseaktivität durch Inhibitoren stört das Wachstum und die Vermehrung von Pilzen, was darauf hindeutet, dass dies eine wichtige Strategie zur Bekämpfung des Erregers sein könnte. Wichtig ist, dass wirbellose Tiere wie Mollusken Peptidase-Inhibitoren mit biomedizinischen Anwendungen und antimikrobieller Aktivität produzieren, aber sie sind in Bezug auf ihren Einsatz gegen Pilzpathogene noch wenig erforscht. In diesem Protokoll wurde eine globale Extraktion aus Mollusken durchgeführt, um potenzielle Peptidase-Inhibitoren in rohen und geklärten Extrakten zu isolieren, und ihre Auswirkungen gegen klassische Kryptokokken-Virulenzfaktoren wurden bewertet. Diese Methode unterstützt die Priorisierung von Mollusken mit antimykotischen Eigenschaften und bietet Möglichkeiten für die Entdeckung von Antivirulenzmitteln, indem sie die natürlichen Inhibitoren von Mollusken nutzt.
Introduction
Cryptococcus neoformans ist ein humaner Pilzerreger, der bei immungeschwächten Wirten, wie z. B. Personen mit HIV/AIDS1, schwere Erkrankungen hervorruft und zu etwa 19 % der AIDS-bedingten Todesfälle führt2. Der Pilz ist anfällig für mehrere Klassen von Antimykotika, einschließlich Azolen, Polyenen und Flucytosin, die unter Verwendung unterschiedlicher Mechanismen eine fungizide und fungistatische Aktivität ausüben 3,4. Der umfangreiche Einsatz von Antimykotika in klinischen und landwirtschaftlichen Umgebungen in Kombination mit der Stammhybridisierung hat jedoch die Resistenzentwicklung bei mehreren Pilzarten, einschließlich C. neoformans5, verstärkt.
Um die Herausforderungen der antimykotischen Resistenz zu überwinden und die Prävalenz von Pilzinfektionen auf globaler Ebene zu reduzieren, besteht ein vielversprechender Ansatz darin, die Virulenzfaktoren von Cryptococcus spp. (z. B. Temperaturanpassungsfähigkeit, Polysaccharidkapsel, Melanin und extrazelluläre Enzyme) als potenzielle therapeutische Ziele zu nutzen 4,6 . Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile, da diese Virulenzfaktoren in der Literatur gut charakterisiert sind, und das Targeting dieser Faktoren könnte möglicherweise die Raten der antimykotischen Resistenz reduzieren, indem ein schwächerer Selektionsdruck durch Beeinträchtigung der Virulenz ausgeübt wird, anstatt auf das Zellwachstum abzuzielen6. In diesem Zusammenhang wurde in zahlreichen Studien die Möglichkeit untersucht, extrazelluläre Enzyme (z. B. Proteasen, Peptidasen) gezielt einzusetzen, um die Virulenz von Cryptococcus spp.7,8,9 zu reduzieren oder zu hemmen.
Organismen wie Wirbellose und Pflanzen besitzen kein adaptives Immunsystem, um sich vor Krankheitserregern zu schützen. Sie sind jedoch auf ein starkes angeborenes Immunsystem mit einer immensen Anzahl chemischer Verbindungen angewiesen, um mit Mikroorganismen und Raubtieren fertig zu werden10. Zu diesen Molekülen gehören Peptidase-Inhibitoren, die in vielen biologischen Systemen eine wichtige Rolle spielen, einschließlich der zellulären Prozesse der Immunität von Wirbellosen, wie der Gerinnung der Hämolymphe, der Synthese von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden und dem Schutz von Wirten durch direkte Inaktivierung der Proteasen von Krankheitserregern11. So besitzen Peptidase-Inhibitoren von Wirbellosen wie Mollusken potenzielle biomedizinische Anwendungen, aber viele bleiben uncharakterisiert10,12,13. In diesem Zusammenhang gibt es in Ontario etwa 34 Arten von Landmollusken und in Kanada 180 Süßwassermollusken14. Ihre eingehende Profilierung und Charakterisierung ist jedoch noch begrenzt15. Diese Organismen bieten die Möglichkeit, neue Verbindungen mit potenzieller antimykotischer Aktivitätzu identifizieren 10.
In diesem Protokoll werden Methoden zur Isolierung und Klärung von Extrakten aus wirbellosen Tieren (z. B. Mollusken) (Abbildung 1) beschrieben, gefolgt von der Messung der mutmaßlichen Peptidase-hemmenden Aktivität. Die antimykotischen Eigenschaften dieser Extrakte werden dann bewertet, indem ihr Einfluss auf die Virulenzfaktorproduktion von C. neoformans unter Verwendung phänotypischer Assays gemessen wird (Abbildung 2). Es ist wichtig zu beachten, dass Unterschiede in den antimykotischen Eigenschaften zwischen rohen und geklärten Extrakten auf mikrobielle Faktoren (z. B. sekundäre Metaboliten oder vom Wirtsmikrobiom produzierte Toxine) der Molluske hinweisen können, die experimentelle Beobachtungen beeinflussen können. Solche Ergebnisse unterstützen die Notwendigkeit, dass in diesem Protokoll sowohl rohe als auch geklärte Extrakte unabhängig voneinander bewertet werden, um die Wirkungsweisen zu entschlüsseln. Darüber hinaus ist der Extraktionsprozess unvoreingenommen und kann den Nachweis antimikrobieller Eigenschaften gegen eine Vielzahl von Pilz- und Bakterienpathogenen ermöglichen. Daher bietet dieses Protokoll einen Ausgangspunkt für die Priorisierung von Molluskenarten mit antimykotischen Eigenschaften gegen C. neoformans und die Möglichkeit, die Zusammenhänge zwischen enzymatischer Aktivität und Virulenzfaktorproduktion durch mutmaßliche Hemmmechanismen zu bewerten.
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Protocol
1. Proteinextraktion aus Mollusken
- Sammeln Sie Mollusken aus einem ausgewiesenen und genehmigten Naturgebiet (z. B. Speed River, Guelph, Ontario). Für diese Studie wurden sowohl einheimische als auch invasive Arten ausgewählt, um ein breites Spektrum potenzieller antimykotischer Wirkungen zu bewerten.
- Brechen Sie die Schale der Mollusken (z. B. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi und Cipangopaludina chinensis) vorsichtig mit einem Stößel und Mörser auf und entfernen Sie die festen Stücke mit einer Pinzette. Im Allgemeinen werden 10 Mollusken für die Verwendung während des gesamten Protokolls gepoolt.
- Sammle und wiege die Organe. Ungefähr 15-20 g Probe sind optimal. Schneiden Sie die Organe mit einer Schere in kleine Stücke von ca. 0,5-1 cm Größe.
- Die sezierten und geschnittenen Organproben werden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Dann mahlen Sie die Organproben mit einem Stößel und Mörser zu einem feinen Pulver.
- Das Organprobenpulver (ca. 15 g) wird in 30 ml kaltes destilliertes Wasser (4 °C) gegeben, um ein Verhältnis von 1:2 (w/v) zu erreichen.
- Gießen Sie 2 ml der Probe in schlagfeste 2-ml-Röhrchen. Geben Sie einen Messlöffel 3 mm Edelstahlperlen (ca. 500 μg) in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie es mit einem Mixer (siehe Materialtabelle) für 3 min bei 1.200 U/min und 4 °C.
- Zentrifugieren bei 12.000 × g für 20 min bei 4 °C. Sammeln Sie alle Überstände mit einer Pipette in einem frischen 50-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
- Filter-sterilisieren Sie den Überstand mit einer 0,22 μm Membran. Lagern Sie die Proben auf Eis und fahren Sie gegebenenfalls mit dem Klärungsprotokoll (Abschnitt 2) fort.
HINWEIS: Die Proben können in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -20 °C gelagert werden, um als Rohextrakte verwendet zu werden.
2. Klärung des Molluskenextrakts
- Die überstehende Probe aus Schritt 1.8 wird für 30 min in ein Thermalbad bei 60 °C gelegt. Kühlen Sie die Proben dann schnell ab, indem Sie sie 20 Minuten lang in einen Eimer mit Eis geben.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.000 × g für 45 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 50-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Filtern Sie die Proben mit einem 0,22-μm-Membranfilter und lagern Sie sie dann auf Eis.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in den Proben aus Schritt 1.8 (d. h. dem Rohextrakt) und Schritt 2.2 (d. h. dem geklärten Extrakt) unter Verwendung eines Quantifizierungsassays (z. B. Bicinchoninsäure-Assay17). Der optimale Proteinkonzentrationsbereich liegt bei 4-8 mg/ml.
- Lagern Sie die Proben bis zu 1 Stunde auf Eis oder gefrieren Sie sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei -20 °C, bis sie benötigt werden.
3. Inhibitorischer Aktivitätstest
- Messen Sie die hemmende Aktivität der rohen und geklärten Extrakte unter Verwendung enzymatischer Assays in technischer Verdreifachung.
HINWEIS: Jeder enzymatische Assay besteht aus einem Enzym (z. B. Subtilisin A, das an der Pilzvirulenz 16,17,18 beteiligt ist; normalerweise etwa 1 x 10−9 mol/L für chromogene Assays), einem Puffer und einem Substrat. Die Reaktion beginnt, wenn das Substrat auf das Enzym trifft. Die enzymatische Aktivität ist proportional zur Geschwindigkeit der Substratumwandlung in das Produkt. - Beurteilen Sie die Wirkung der Enzymkonzentration (EC) auf die enzymatische Aktivität (EA), bis eine lineare Abhängigkeit zwischen beiden Parametern erreicht ist. Verwenden Sie für die nächsten Schritte eine Enzymkonzentration innerhalb des gemessenen linearen Bereichs.
ANMERKUNG: Der enzymatische Assay für die Peptidase Subtilisin A wird in den folgenden Schritten detailliert beschrieben. - Die rohen (Schritt 1.11) oder geklärten (Schritt 2.5) Molluskenproteinextrakte (z. B. 10 μl mit 4 mg/ml Protein) werden 10 μl lang mit 10 μl Subtilisin A (Konzentration bestimmt aus Schritt 3.2) und 220 μl 100 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,6 (zur Kontrolle 230 μl Tris-Puffer ohne Zugabe des Extrakts zugeben) 10 min lang bei 25 °C in einer 96-Well-Flachbodenplatte inkubiert.
- 10 μl N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, das Substrat für Subtilisin A, werden in einer Endkonzentration von 1 Km (Michaelis-Menten-Konstante; 0,2 mM für dieses Substrat mit Subtilisin A) für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 250 μl zugegeben.
- Messen Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie das Erscheinungsbild des Produkts im Laufe der Zeit überwachen, indem Sie die optische Dichte (OD) bei 405 nm alle 15 s für 3 Minuten ablesen.
- Bestimmen Sie die enzymatische Restaktivität, indem Sie das Verhältnis der enzymatischen Aktivität in Gegenwart des Molluskenextrakts zu der in Abwesenheit des Extrakts berechnen.
- Wenn eine Hemmaktivität beobachtet wird (d. h. Restaktivität unter 1), wird der Hemmkonzentrationswert 50 (IC50) unter Verwendung eines Konzentrationsbereichs der Extrakte (z. B. einer zweifachen Verdünnungsreihe von 200 μg/ml bis 1 μg/ml) gemäß den Standardmethoden19 gemessen.
4. Wirkung von Molluskenextrakten auf das Wachstum von C. neoformans
- Verwenden Sie eine 10-μl-Pipettenspitze, um eine einzelne Kolonie von C. neoformans var. grubii H99 Wildtyp (WT) in 5 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD)-Medium (10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Pepton und 20 g/L Dextrose, pH 6,5) einzuführen und 16-18 h bei 30 °C und 200 U/min zu inkubieren. Führen Sie das Experiment in biologischer Verdreifachung und technischem Duplikat durch.
- Sammeln Sie 500 μl der Kultur in einer Küvette und messen Sie das Wachstum, indem Sie den OD bei 600 nm ablesen. Verdünnen Sie die Kultur mit Hefestickstoffbase (YNB)-Medium auf einen endgültigen OD600 von 0,02.
- Co-Kultur von C. neoformans-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. eine dreifache Verdünnungsreihe von 440 μg/ml bis 15 μg/ml Protein) der Extrakte (d. h. roh und geklärt). Mischen Sie dazu 10 μl der Extrakte mit 190 μl der verdünnten C. neoformans-Kultur (Schritt 4.2) in einer 96-Well-Platte.
- Messen Sie das Wachstum, indem Sie den OD600 mit einem Plattenleser alle 15 Minuten bis 1 h für 72 h bei 200 U/min und 37 °C ablesen.
5. Wirkung von Molluskenextrakten auf die Melaninproduktion von C. neoformans
- Bereiten Sie L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) -Platten vor.
- 230 ml 14 g/l Agar autoklavieren und abkühlen lassen, bis er 50-60 °C erreicht.
- 3,25 ml 1 M Glycin, 7,35 ml 1 M KH 2PO4, 2,5 ml 1 M MgSO 4,7H2O, 0,6 ml 40% Glucose, 70 μl 10 mM Thiamin und2,5ml 100 mM L-DOPA (filtersterilisiert) werden in den flüssigen Agar gegeben.
- Gießen Sie 15 ml der Mischung in Petriplatten, lassen Sie sie ca. 1 h im Dunkeln trocknen und lagern Sie sie bei 2-4 °C bis zu 1 Woche. Stellen Sie sicher, dass die Deckel teilweise angehoben sind, damit der Agar richtig trocknen kann.
- Inokulieren Sie 5 mL YNB-Medium mit 50 μL C. neoformans-Kultur aus Schritt 4.1. 16-18 h bei 30 °C und 200 U/min inkubieren.
- Die Zellen werden bei 1.000 × g für 5 min bei 4 °C heruntergeschleudert. Waschen Sie die Zellen 2x mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS, um eine Endkonzentration von 10bis 6 Zellen/ml zu erreichen.
- Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe (z. B. zweifach) der rohen und geklärten Molluskenextrakte vor. In ähnlicher Weise wird eine 10-fache Verdünnungsserie von C. neoformans-Zellen (Schritt 5.4) von 1 x 106 Zellen/ml auf 1 x 101 Zellen/ml unter Verwendung von sterilem PBS in 96-Well-Platten hergestellt.
- 200 μl der Extrakte mit einem Tupfer auf Petriplatten mit L-DOPA-Agar verteilen und 15 Minuten trocknen lassen.
- Verteilen Sie 5 μl Kultur aus jeder Vertiefung auf die L-DOPA-Platte, wobei zwischen den Tropfen 1 cm verbleiben. 15 Minuten im Dunkeln trocknen lassen.
- Inkubieren Sie die Platten 3-5 Tage lang bei 30 °C und 37 °C in einem statischen Inkubator und nehmen Sie alle 24 Stunden Bilder mit einer Kamera oder einem Platten-Imager (z. B. Scanner) auf.
ANMERKUNG: Hier werden zwei Temperaturbedingungen verwendet, um den Einfluss der Temperatur auf die wachstumshemmende Wirkung der Molluskenextrakte zu untersuchen, wobei 30 °C für die Umwelttemperatur und 37 °C für die physiologischen Temperaturen des Menschen stehen.
6. Wirkung von Molluskenextrakten auf die Produktion von C. neoformans-Polysaccharidkapseln
- Bereiten Sie eisenarmes Medium (LIM) wie unten beschrieben vor.
- 5 g Chelatharz (siehe Materialtabelle) in 60 ml Reinstwasser auflösen und in eine Glassäule (2 cm Durchmesser x 25 cm Länge) packen. Waschen Sie die Säule mit 100 ml Wasser und entsorgen Sie das gesammelte Wasser.
- Bereiten Sie eisenarmes Wasser (LI-Wasser) vor, indem Sie 2 l steriles Reinstwasser durch die Chelatsäule leiten. Lagern Sie das LI-Wasser bis zu 3 Monate bei 4 °C.
- 5 g Glukose in 100 ml LI-Wasser auflösen. 5 g L-Asparagin werden in 200 ml LI-Wasser in einem separaten Becherglas gelöst.
- Fügen Sie Folgendes zu 500 ml LI-Wasser hinzu: 4,78 g HEPES, 0,4 g K 2HPO4, 0,08 g MgSO4,7H 2 O, 1,85 g NaHCO3 und 0,25 g CaCl 2,2H 2O.
- Kombinieren Sie die Lösungen aus Schritt 6.1.3 und Schritt 6.1.4. 1 ml 100 mM Bathophenanthrolindisulfonsäure-Natriumsalz (BPS) zu einer Endkonzentration von 100 μM zugeben.
- Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M LI-MOPS auf 7,2 ein. Fügen Sie LI-Wasser zu einem Endvolumen von 1 l hinzu und filtern Sie das Medium, indem Sie es durch eine 0,22-μm-Membran führen. 100 μl steriles Thiamin (4 mg/ml) in das Medium geben.
- Inokulieren Sie 5 ml YNB-Medium mit 50 μl der C. neoformans-Kultur aus Schritt 4.1. 16-18 h bei 30 °C und 200 U/min inkubieren. Verwenden Sie diese Kultur, um 5 ml LIM bis zu einer Endkonzentration von 10bis 5 Zellen/ml zu impfen.
- Fügen Sie geeignete Volumina der Molluskenextrakte hinzu (z. B. eine zweifache Verdünnung oder das Volumen, das aus früheren Virulenztests bestimmt wurde), um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen. 72 h bei 37 °C und 200 U/min mit gelösten Kappen inkubieren. Nach der Inkubation 1 ml Zellen sammeln und 2x mit sterilem PBS, pH 7,4, bei 1.500 × g 2 min bei 4 °C waschen.
- Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 1 ml PBS. Mischen Sie die Zellen mit Tusche im Verhältnis 1:1 (z. B. 4 μl Tusche mit 4 μl Zellsuspension) über einem Objektträger. Legen Sie ein Deckglas auf die Folie.
- Visualisieren Sie die Proben mit einem Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskop (DIC) mit einem 63-fachen Ölobjektiv (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Kontrast auf "Automatisch" ein und fokussieren Sie manuell mit dem Einstellrad des Mikroskops. Wählen Sie alle Bilder aus und exportieren Sie sie im TIFF-Format. Es müssen keine Filter angewendet werden.
- Quantifizieren Sie mit dem Linealwerkzeug in ImageJ20 das Verhältnis der Gesamtzellgröße (einschließlich der Kapsel) zur Zellkörpergröße.
7. Wirkung von Molluskenextrakten auf die Biofilmproduktion von C. neoformans
- Inokulieren Sie 5 mL YNB-Medium mit 50 μL C. neoformans-Kultur aus Schritt 4.1. 16-18 h bei 30 °C und 200 U/min inkubieren.
- Ernte Zellen aus der 5-ml-Kultur. Waschen Sie die Zellen mit sterilem PBS, pH 7,4, bei 1.500 × g für 2 min bei 4 °C.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) auf eine Endkonzentration von 10bis 7 Zellen/ml.
- 300 μl der Zellsuspension werden in die einzelnen Vertiefungen einer sterilen Polystyrolplatte mit flachem 24-Vertiefungsboden überführt. Verwenden Sie Vertiefungen mit Medien nur als Kontrolle.
- Fügen Sie geeignete Volumina der Molluskenextrakte hinzu (z. B. eine zweifache Verdünnung oder das Volumen, das aus früheren Virulenztests bestimmt wurde), um eine Endkonzentration von 10-20 μg/ml Protein zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass das Extraktvolumen nicht größer als 10 % des Gesamtvolumens ist.
- Wickeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie ein (um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden) und inkubieren Sie sie 48 h lang mit einem statischen Inkubator bei 30 °C und 37 °C.
- Waschen Sie die Brunnen mit einer Flasche oder einem Spender 2x mit sterilem Wasser und lassen Sie sie 10-15 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Geben Sie dann 100 μl 0,3%ige kristallviolette Lösung in jede Vertiefung (einschließlich der reinen Medium-Kontrollvertiefungen) und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Brunnen gründlich 3x mit sterilem Wasser (die Biofilme werden beim Waschen nicht gestört). Fügen Sie 200 μl 100% Ethanol hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei RT.
- Übertragen Sie 75 μl auf eine neue 96-Well-Flachbodenplatte und lesen Sie den OD550 ab. Quantifizieren Sie die Biofilmbildung als (OD 550 nm der Probe - OD550 nm des Rohlings).
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Representative Results
Der hier beschriebene Arbeitsablauf ermöglicht die Isolierung von Proteinen und Peptiden aus Mollusken mit potentiellen Antivirulenzeigenschaften gegen C. neoformans. In ähnlicher Weise ermöglicht die Bewertung verschiedener Formen von Extrakten (d. h. roh und geklärt) die Halbreinigung der potenziellen Wirkstoffe und unterstützt die nachgelagerte Bewertung (z. B. massenspektrometriebasierte Proteomik). Typischerweise erzeugt der Proteinextraktions-Workflow homogenisierte Lösungen mit Proteinkonzentrationen von 4-8 mg/ml. Hier zeigen die repräsentativen Ergebnisse die Bewertung der enzymatischen Aktivität und der antimykotischen Eigenschaften von C. chinensis-Extrakten. Die rohen und geklärten Extrakte waren in der Lage, die proteolytische Aktivität von Subtilisin A (im Zusammenhang mit der Virulenz in C. neoformans) zu hemmen (Abbildung 3) mit IC 50-Werten von 5,3 μg/ml bzw.4,53 μg/ml. Die Aktivität der C. chinensis-Extrakte wurde weiter gegen Prozesse getestet, die mit der Produktion des Virulenzfaktors von C. neoformans assoziiert sind, einschließlich Pilzwachstum, Kapsel- und Melaninproduktion sowie der Bildung von Biofilmen. Es gab eine signifikante Verringerung des Pilzwachstums bei 37 °C in Gegenwart der rohen (Abbildung 4A) und geklärten (Abbildung 4B) C. chinensis-Extrakte. Bemerkenswert ist, dass es keine Veränderungen in der Kapsel- oder Melaninproduktion in Gegenwart von rohen oder geklärten C. chinensis-Extrakten gab (Abbildung 4C, D). Bei hohen Konzentrationen der Roh- (Abbildung 4E) und geklärten (Abbildung 4F) Extrakte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Biofilmbildung um 70 % bis 80 % beobachtet.
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Gesamtproteinextraktion aus Mollusken. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Allgemeine Strategie zur Bewertung der Auswirkungen von Molluskenextrakten auf die proteolytische Aktivität, das Wachstum und die Virulenzfaktorproduktion bei Cryptococcus neoformans. DIC = Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie. Die optische Dichtemessung wird mit der Wellenlänge in Nanometern (nm) angegeben. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Wirkungen von Molluskenproteinextrakten auf die proteolytische Aktivität von Subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis-Rohextrakte . (B) C. chinensis geklärte Extrakte. Jeder Punkt stellt den Durchschnitt von drei Wiederholungen dar. Balken zeigen die Standardabweichung an. IC50 = halbmaximale Hemmkonzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Effekte von C. chinensis-Extrakten auf die Virulenzfaktorproduktion in C. neoformans. (A,B) Wachstum von C. neoformans bei 37 °C in Gegenwart von rohen bzw. geklärten C. chinensis-Extrakten. (C) DIC-Mikroskopiebilder von C. neoformans, die die Kapselproduktion in Gegenwart von rohen (50 μg/ml) und geklärten (40 μg/ml) Extrakten zeigen. Maßstabsbalken = 10 μm. (D) Melaninproduktion von C. neoformans in Gegenwart von rohen (440 μg/ml) und geklärten (410 μg/ml) Extrakten bei 30 °C bzw. 37 °C. (E,F) Relative Biofilmbildung von C. neoformans in Gegenwart von rohen bzw. geklärten Extrakten. Für die statistische Analyse wurden ein Einweg-ANOVA-Test und ein Dunnett-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. *p < 0,05; **p < 0,01; und ****p < 0,0001. Jeder Wert entspricht durchschnittlich mindestens fünf biologischen Replikaten und zwei technischen Replikaten. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die gezeigten Melaninbilder sind repräsentativ für drei biologische und zwei technische Replikate. Die gezeigten Kapselbilder sind repräsentativ für 40-50 Zellen pro Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Extraktionsprotokoll beschreibt die Isolierung von Verbindungen aus Mollusken, die in Ontario, Kanada, gesammelt wurden, und demonstriert eine neuartige Untersuchung der Verwendung von Molluskenextrakten gegen den menschlichen Pilzpathogen C. neoformans. Dieses Protokoll ergänzt eine wachsende Zahl von Forschungsarbeiten, die die Peptidase-Inhibitor-Aktivität von Wirbellosen untersuchen13. Während der Extraktion waren einige Extraktproben schwer zu filtern und zu sterilisieren, möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins von löslichen Polysacchariden und/oder Pigmenten, die die Filtermembran verstopften. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird empfohlen, zuerst durch eine 5-μm-Membran zu filtern, um große Verbindungen (z. B. gestörte Zellmembranen, Genom-DNA) auszuschließen, so dass die Proteine den Filter passieren und dann erneut durch eine 0,22-μm-Membran filtrieren können. Diese Schritte sind für das Protokoll von entscheidender Bedeutung, da sie das Vorhandensein von Mikroben einschränken, die die Proben kontaminieren und nachgeschaltete Experimente stören können.
Während dieser Untersuchung wurden Peptidase-Inhibitoren gegen Subtilisin A, ein Modellenzym für die S8-Familie von Subtilisin, nachgewiesen. Mitglieder dieser Enzymfamilie sind unter Organismen weit verbreitet und spielen unterschiedliche Rollen, z. B. bei der Proteinverarbeitung, Ernährung und Virulenzmechanismen21,22, die die in dieser Studie beobachteten phänotypischen Effekte unterstützen. Zum Beispiel wurde eine signifikante Verringerung des Pilzwachstums in Gegenwart von rohen und geklärten Extrakten und bei relativ hohen und niedrigen Konzentrationen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die hemmende Aktivität im getesteten Modell robust war. Es ist bemerkenswert, dass bei der Messung des OD mit einem Plattenleser das Vorhandensein der Extrakte zu einer Verklumpung der Pilzzellen am Boden der Vertiefung führte, was die Wachstumsmessung störte. Diese Einschränkung kann durch die Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Schüttelinkubators (z. B. 900 U/min) überwunden werden, wodurch eine Zellverklumpung vermieden wird.
Es können weitere technische Einschränkungen bestehen, die die erwarteten phänotypischen Beobachtungen beeinflussen können. Zum Beispiel sind Subtilisin-ähnliche Peptidasen mit der Melaninsynthese und dem Quorum Sensing in C. neoformans assoziiert, aber die rohen oder geklärten Extrakte von Mollusken zeigen keine signifikanten Auswirkungen auf die Melaninproduktion16,17,18. Dies ist möglicherweise auf die natürliche Schutzwirkung von Melanin und Kapsel gegen äußere Einflüsse zurückzuführen, die verhindern könnten, dass die Molluskenextrakte die intrazellulären Bestandteile des Pilzes beeinflussen. Wichtige Faktoren, die bei der Arbeit mit organischen Substraten zu berücksichtigen sind, sind die Notwendigkeit, sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufzulösen, was zu Löslichkeitsproblemen innerhalb der Agarplatte führen kann (wie sie in den Melanin-Assays verwendet wird). Um dieses Problem zu lösen, können die Extrakte entlang der Oberfläche der Agarplatte verteilt und trocknen gelassen werden, bevor die Pilzzellen auf der Platte entdeckt werden.
Frühere Arbeiten zeigten die Anfälligkeit von C. neoformans-Biofilmen für zwei Antimykotika in vitro, darunter Amphotericin B und Caspofungin; Der Pilz war jedoch resistent gegen Fluconazol und Voriconazol23. Angesichts der Bedeutung von Pilzbiofilmen für die Virulenz und die Antibiotikaresistenz wäre es wertvoll, neue Strategien zur Störung oder Störung der Biofilmbildung aufzudecken. In der aktuellen Studie beeinträchtigten rohe und geklärte Extrakte aus C. chinensis die Bildung von Biofilmen von Kryptokokkenzellen mit scheinbarem Dosis-Wirkungs-Verhalten. Diese Ergebnisse unterstützen die Wirkung und Neuartigkeit des Ansatzes. Bemerkenswert ist, dass die Biofilmbildung bei der Behandlung mit dem Rohmaterial im Vergleich zum geklärten Extrakt stärker gehemmt wurde, was auf einen Verlust von Hemmstoffen während des Klärungsprozesses oder eine Verringerung der Hemmfunktion unter den getesteten Bedingungen zurückzuführen sein kann. Es ist möglich, dass die Proteine, die für diese hemmenden Wirkungen verantwortlich sind, ein hohes Molekulargewicht haben und während des Klärungsprozesses verloren gegangen sind oder während der thermischen Behandlung für den Abbau anfällig waren. Diese Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, sowohl rohe als auch geklärte Extrakte zu verwenden, um Veränderungen der Hemmfunktionen zu erkennen, da Unterschiede in Bezug auf die Inhibitorquelle das Ergebnis beeinflussen können.
Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll die Extraktion von Verbindungen aus Mollusken und die Messung der mutmaßlichen inhibitorischen Aktivität gegen eine ausgewählte Peptidase mit nachgewiesener Rolle bei der Pilzvirulenz. In diesem Protokoll wurden die hohe Ausbeute und die starke Peptidase-hemmende Aktivität der Extrakte und ihre Wirkung gegen das Wachstum von C. neoformans und die Biofilmbildung bewertet. Obwohl weitere Experimente erforderlich sind, unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Mollusken als mutmaßliche neue Quellen für Verbindungen gegen diesen gefährlichen Pilzerreger. Während sich dieses Protokoll auf die Extraktion von Inhibitoren aus Mollusken konzentriert, ist die Methodik an andere Wirbellose anpassbar und kann verwendet werden, um die Wirkung von Inhibitoren, die von verschiedenen Wirbellosen stammen, auf die Virulenzfaktorproduktion in einer Vielzahl von Mikroorganismen, einschließlich Pilzen und Bakterien, zu bewerten24,25,2 6 . Letztendlich kann die Extraktion von Verbindungen aus natürlichen Quellen das Repertoire an vermeintlich neuartigen antimikrobiellen Wirkstoffen erweitern und damit unsere Fähigkeiten zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten verbessern.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern des Geddes-McAlister Lab für ihre wertvolle Unterstützung während dieser Untersuchung und ihr Feedback zu den Manuskripten. Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch das Ontario Graduate Scholarship und den International Graduate Research Award - University of Guelph an D. G.-G und durch die Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) und den Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award für J. G.-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
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