Summary
İnsan mantar patojeni Cryptococcus neoformans , konakçı içinde hayatta kalmasını teşvik etmek için çeşitli virülans faktörleri (örneğin, peptidazlar) üretir. Çevresel nişler, yeni doğal peptidaz inhibitörlerinin umut verici bir kaynağını temsil etmektedir. Bu protokol, yumuşakçalardan ekstraktların hazırlanmasını ve mantar virülans faktörü üretimi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini özetlemektedir.
Abstract
Cryptococcus neoformans , öncelikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri enfekte eden küresel bir dağılıma sahip kapsüllenmiş bir insan mantar patojenidir. Antifungallerin klinik ortamlarda yaygın kullanımı, tarımda kullanımı ve suş hibridizasyonu, direncin evriminin artmasına neden olmuştur. Antifungallere karşı bu artan direnç oranı, dünya çapında klinisyenler ve bilim adamları arasında artan bir endişe kaynağıdır ve yeni antifungal tedaviler geliştirmek için artan bir aciliyet vardır. Örneğin, C. neoformans , doku bozulması, hücresel düzenleme ve besin ediniminde rol oynayan hücre içi ve hücre dışı enzimler (örneğin, peptidazlar) dahil olmak üzere çeşitli virülans faktörleri üretir. Bu tür peptidaz aktivitesinin inhibitörler tarafından bozulması, mantar büyümesini ve proliferasyonunu bozar, bu da bunun patojenle mücadelede önemli bir strateji olabileceğini düşündürmektedir. Önemli olarak, yumuşakçalar gibi omurgasızlar, biyomedikal uygulamalar ve anti-mikrobiyal aktivite ile peptidaz inhibitörleri üretirler, ancak mantar patojenlerine karşı kullanımları açısından yeterince araştırılmamışlardır. Bu protokolde, ham ve berraklaştırılmış ekstraktlarda potansiyel peptidaz inhibitörlerini izole etmek için yumuşakçalardan global bir ekstraksiyon gerçekleştirilmiş ve klasik kriptokokal virülans faktörlerine karşı etkileri değerlendirilmiştir. Bu yöntem, yumuşakçaların antifungal özelliklere sahip önceliklendirilmesini destekler ve yumuşakçalarda bulunan doğal inhibitörlerden yararlanarak anti-virülans ajanların keşfi için fırsatlar sağlar.
Introduction
Cryptococcus neoformans, HIV / AIDS1 ile yaşayan bireyler gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konakçılarda ciddi hastalık üreten ve AIDS'e bağlı ölümlerin yaklaşık% 19'una yol açan bir insan mantar patojenidir2. Mantar, farklı mekanizmalar kullanarak mantar öldürücü ve fungistatik aktivite gösteren azoller, polienler ve flusitozin dahil olmak üzere çeşitli antifungal sınıflarına duyarlıdır 3,4. Bununla birlikte, antifungallerin klinik ve tarımsal ortamlarda yaygın kullanımı, suş hibridizasyonu ile birleştiğinde, C. neoformans5 de dahil olmak üzere birçok mantar türünde direncin evrimini arttırmıştır.
Antifungal direncin zorluklarının üstesinden gelmek ve küresel ölçekte mantar enfeksiyonlarının prevalansını azaltmak için, umut verici bir yaklaşım, Cryptococcus spp.'nin virülans faktörlerini (örneğin, sıcaklık adaptasyonu, polisakkarit kapsül, melanin ve hücre dışı enzimler) potansiyel terapötik hedefler olarak kullanmaktır 4,6 . Bu virülans faktörleri literatürde iyi karakterize edildiğinden ve bu faktörlerin hedeflenmesi, hücre büyümesini hedeflemek yerine virülansı bozarak daha zayıf bir seçici basınç uygulayarak antifungal direnç oranlarını potansiyel olarak azaltabileceğinden bu yaklaşımın birçok avantajı vardır6. Bu bağlamda, çok sayıda çalışma, Cryptococcus spp.7,8,9'un virülansını azaltmak veya inhibe etmek için hücre dışı enzimleri (örneğin, proteazlar, peptidazlar) hedefleme olasılığını değerlendirmiştir.
Omurgasızlar ve bitkiler gibi organizmalar, kendilerini patojenlerden korumak için uyarlanabilir bir bağışıklık sistemine sahip değildir. Bununla birlikte, mikroorganizmalar ve avcılarla başa çıkmak için çok çeşitli kimyasal bileşiklere sahip güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık sistemine güvenirler10. Bu moleküller, hemolenfin pıhtılaşması, sitokinlerin ve antimikrobiyal peptitlerin sentezi ve patojenlerin proteazlarını doğrudan inaktive ederek konakçıların korunması gibi omurgasız bağışıklığının hücresel süreçleri de dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemde önemli rol oynayan peptidaz inhibitörlerini içerir11. Bu nedenle, yumuşakçalar gibi omurgasızlardan gelen peptidaz inhibitörleri potansiyel biyomedikal uygulamalara sahiptir, ancak birçoğu karakterize edilmeden kalır10,12,13. Bu bağlamda, Ontario'da yaklaşık 34 karasal yumuşakça türü ve Kanada'da 180 tatlı su yumuşakçasıtürü 14 bulunmaktadır. Bununla birlikte, derinlemesine profilleme ve karakterizasyonları halasınırlıdır 15. Bu organizmalar, potansiyel anti-fungal aktiviteye sahip yeni bileşiklerin tanımlanması için bir fırsat sunar10.
Bu protokolde, omurgasızlardan (örneğin, yumuşakçalar) ekstraktları izole etme ve netleştirme yöntemleri (Şekil 1) ve ardından varsayılan peptidaz inhibitör aktivitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Bu ekstraktların antifungal özellikleri daha sonra fenotipik testler kullanılarak C. neoformans virülans faktörü üretimi üzerindeki etkileri ölçülerek değerlendirilir (Şekil 2). Ham ve berraklaştırılmış ekstraktlar arasındaki antifungal özelliklerdeki farklılıkların, deneysel gözlemleri etkileyebilecek yumuşakçaların mikrobiyal faktörlerinin (örneğin, konakçı mikrobiyomu tarafından üretilen ikincil metabolitler veya toksinler) göstergesi olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu tür bulgular, bu protokolün, eylem biçimlerini çözmek için hem ham hem de açıklığa kavuşturulmuş ekstraktları bağımsız olarak değerlendirme ihtiyacını desteklemektedir. Ek olarak, ekstraksiyon işlemi tarafsızdır ve çok sayıda mantar ve bakteriyel patojene karşı antimikrobiyal özelliklerin tespit edilmesini sağlayabilir. Bu nedenle, bu protokol, C. neoformans'a karşı antifungal özelliklere sahip yumuşakça türlerinin önceliklendirilmesi için bir başlangıç noktası ve enzimatik aktivite ile virülans faktörü üretimi arasındaki bağlantıların varsayılan inhibitör mekanizmalar aracılığıyla değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yumuşakçalardan protein ekstraksiyonu
- Yumuşakçaları belirlenmiş ve onaylanmış bir doğal alandan toplayın (örneğin, Speed River, Guelph, Ontario). Bu çalışma için, çok çeşitli potansiyel antifungal etkileri değerlendirmek için hem yerli hem de istilacı türler seçildi.
- Yumuşakçaların kabuğunu (örneğin, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi ve Cipangopaludina chinensis) bir havane ve harç kullanarak yavaşça kırın ve katı parçaları bir çift cımbızla çıkarın. Genel olarak, protokol boyunca kullanılmak üzere 10 yumuşakça toplanır.
- Organları toplayın ve tartın. Yaklaşık 15-20 g numune en uygunudur. Organları yaklaşık 0,5-1 cm boyutunda küçük parçalara ayırmak için makas kullanın.
- Disseke edilmiş ve kesilmiş organ örneklerini sıvı azotla flaşla dondurun. Daha sonra, organ örneklerini bir havane ve harç kullanarak ince bir toz haline getirin.
- Organ numunesi tozunu (yaklaşık 15 g) 30 mL soğuk damıtılmış suya (4 °C) ekleyerek 1:2 oranında (w/v) elde edin.
- Numunenin 2 mL'sini yüksek etkili 2 mL'lik tüplere dökün. Her tüpe bir kepçe dolusu 3 mm paslanmaz çelik boncuk (yaklaşık 500 μg) ekleyin ve 1.200 rpm ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca bir blender kullanarak homojenleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj. Tüm süpernatantları taze bir 50 mL tüpte pipetle toplayın ve peleti atın.
- Süpernatantı 0,22 μm'lik bir membran kullanarak filtreleyerek sterilize edin. Numuneleri buz üzerinde saklayın ve uygun olduğu şekilde arıtma protokolüne (bölüm 2) geçin.
NOT: Numuneler sıvı azotta flaşla dondurulabilir ve ham ekstrakt olarak kullanılmak üzere -20 °C'de saklanabilir.
2. Yumuşakça ekstraktının açıklığa kavuşturulması
- Adım 1.8'den itibaren süpernatant numuneyi 30 dakika boyunca 60 ° C'de bir termal banyoya yerleştirin. Ardından, numuneleri 20 dakika boyunca buzlu bir kovaya aktararak hızlı bir şekilde soğutun.
- Numuneleri 4 °C'de 45 dakika boyunca 15.000 × g'de santrifüj yapın. Süpernatantı taze bir 50 mL tüpte toplayın ve peleti atın. 0,22 μm membran filtre kullanarak numuneleri filtreleyerek sterilize edin ve ardından buz üzerinde saklayın.
- Numunelerdeki protein konsantrasyonunu adım 1.8'den (yani ham ekstrakt) ve adım 2.2'den (yani arıtılmış ekstrakt) bir niceleme testi (örneğin, biskinkoninik asit testi17) kullanarak belirleyin. En uygun protein konsantrasyon aralığı 4-8 mg / mL'dir.
- Numuneleri buz üzerinde 1 saate kadar saklayın veya sıvı azotta flaş dondurun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklayın.
3. İnhibitör aktivite testi
- Teknik üçlü bazda enzimatik tahliller kullanarak ham ve berraklaştırılmış ekstraktların inhibitör aktivitesini ölçün.
NOT: Her enzimatik tahlil bir enzimden (örneğin, mantar virülansında rol oynayan subtilisin A 16,17,18; kromozom bazlı tahliller için genellikle yaklaşık 1 x 10−9 mol / L), bir tampon ve bir substrattan oluşur. Reaksiyon, substrat enzimle karşılaştığında başlar. Enzimatik aktivite, substratın ürüne dönüşüm oranı ile orantılıdır. - Her iki parametre arasında doğrusal bağımlılık elde edilene kadar enzim konsantrasyonunun (EC) enzimatik aktivite (EA) üzerindeki etkisini değerlendirin. Sonraki adımlar için, ölçülen doğrusal aralıkta bir enzim konsantrasyonu kullanın.
NOT: Peptidaz subtilisin A için enzimatik tahlil aşağıdaki adımlarda detaylandırılmıştır. - Ham (adım 1.11) veya berraklaştırılmış (adım 2.5) yumuşakça proteini ekstraktlarını (örneğin, 4 mg / mL protein içeren 10 μL) 10 μL subtilisin A (adım 3.2'den belirlenen konsantrasyon) ve pH 8.6'da 100 mM Tris-HCl'nin 220 μL'si (kontrol için, ekstraktı eklemeden 230 μL Tris tamponu ekleyin) ile 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakada 10 dakika boyunca inkübe edin.
- 250 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmi için 1 Km'lik bir son konsantrasyonda (Michaelis-Menten sabiti; subtilisin A ile bu substrat için 0.2 mM) subtilisin A için substrat olan 10 μL N-Süksinil-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid ekleyin.
- 3 dakika boyunca her 15 sn'de 405 nm'de optik yoğunluğu (OD) okuyarak ürünün zaman içindeki görünümünü izleyerek enzimatik aktiviteyi ölçün.
- Yumuşakça ekstraktının varlığında enzimatik aktivitenin ekstraktın yokluğunda enzimatik aktiviteye oranını hesaplayarak artık enzimatik aktiviteyi belirleyin.
- İnhibitör aktivite gözlenirse (yani, 1'in altındaki artık aktivite), standart yöntemleri izleyerek ekstraktların bir dizi konsantrasyonunu (örneğin,200 μg / mL'den 1 μg / mL'ye kadar iki katlı bir seyreltme serisi) kullanarak inhibitör konsantrasyon 50 (IC 50) değerini ölçün19.
4. Yumuşakça ekstraktlarının C. neoformans büyümesi üzerine etkisi
- Tek bir C. neoformans var. grubii H99 vahşi tip (WT) kolonisini 5 mL maya ekstraktı-pepton-dekstroz (YPD) ortamına (10 g / L maya ekstresi, 20 g / L pepton ve 20 g / L dekstroz, pH 6.5) sokmak için 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın ve 30 ° C ve 200 rpm'de 16-18 saat boyunca inkübe edin. Deneyi biyolojik üçlü ve teknik kopyada gerçekleştirin.
- Bir küvette kültürün 500 μL'sini toplayın ve OD'yi 600 nm'de okuyarak büyümeyi ölçün. Kültürü maya azot baz (YNB) ortamı ile 0,02'lik son OD600'e kadar seyreltin.
- Ko-kültür C. neoformans hücreleri, ekstraktların farklı konsantrasyonlarına (örneğin, 440 μg / mL ila 15 μg / mL proteinden üç kat seyreltme serisi) sahiptir (yani, ham ve berraklaştırılmış). Bunu yapmak için, ekstraktların 10 μL'sini, seyreltilmiş C. neoformans kültürünün 190 μL'si (adım 4.2) ile 96 kuyucuklu bir plakada karıştırın.
- OD600'ü, 200 rpm ve 37 °C'de 72 saat boyunca her 15 dakikada bir ila 1 saatte bir plaka okuyucu kullanarak okuyarak büyümeyi ölçün.
5. Yumuşakça ekstraktlarının C. neoformans melanin üretimine etkisi
- L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) plakalarını hazırlayın.
- Otoklav 230 mL 14 g/L agar ve 50-60 °C'ye ulaşana kadar soğumaya bırakın.
- Sıvı agar'a 3.25 mL 1 M glisin, 7.35 mL 1 M KH 2 PO 4, 2.5 mL 1 M MgSO4.7H 2 O, 0.6 mL% 40 glikoz, 70 μL 10 mM tiamin ve2.5mL 100 mM L-DOPA (filtre sterilize edilmiş) ekleyin.
- Karışımın 15 mL'sini Petri plakalarına dökün, karanlıkta yaklaşık 1 saat kurumasını bekleyin ve 1 haftaya kadar 2-4 ° C'de saklayın. Agarın düzgün bir şekilde kuruması için kapakların kısmen kaldırıldığından emin olun.
- Adım 4.1'den itibaren 50 μL C. neoformans kültürü ile 5 mL YNB ortamını aşılayın. 30 °C ve 200 rpm'de 16-18 saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'de döndürün. Hücreleri pH 7.4'te steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kat yıkayın.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 106 hücre / mL'lik nihai bir konsantrasyona ulaşmak için hücreleri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
- Ham ve berraklaştırılmış yumuşakça ekstraktlarının bir seyreltme serisini (örneğin, iki katı) hazırlayın. Benzer şekilde,96 delikli plakalarda steril PBS kullanarak 1 x 10 6 hücre / mL'den 1 x 10 1 hücre / mL'ye kadar10 katlı bir seyreltme serisi C. neoformans hücresi (adım 5.4) hazırlayın.
- Ekstraktların 200 μL'sini bir çubukla L-DOPA agar içeren Petri plakalarına yayın ve 15 dakika kurumasını bekleyin.
- Her bir kuyucuktan L-DOPA plakasına 5 μL kültür lekesi koyun ve damlalar arasında 1 cm bırakın. 15 dakika karanlıkta kurumaya bırakın.
- Plakaları 3-5 gün boyunca statik bir inkübatörde 30 °C ve 37 °C'de inkübe edin, bir kamera veya plaka görüntüleyici (örneğin, tarayıcı) ile her 24 saatte bir görüntü yakalayın.
NOT: Burada, sıcaklığın yumuşakça ekstraktlarının büyüme engelleyici etkileri üzerindeki etkisini araştırmak için iki sıcaklık koşulu kullanılır; 30 ° C çevreyi ve 37 ° C insan fizyolojik sıcaklıklarını temsil eder.
6. Yumuşakça ekstraktlarının C. neoformans polisakkarit kapsül üretimine etkisi
- Aşağıda açıklandığı gibi düşük demir ortamı (LIM) hazırlayın.
- 5 g şelatlama reçinesini (bakınız Malzeme Tablosu) 60 mL ultra saf suda çözün ve bir cam kolona (2 cm çap x 25 cm uzunlukta) paketleyin. Kolonu 100 mL su ile yıkayın ve toplanan suyu atın.
- Şelatlama kolonundan 2 L steril ultra saf su geçirerek düşük demir suyu (LI-su) hazırlayın. LI suyunu 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
- 5 g glikozu 100 mL LI-su içinde çözün. 5 g L-asparajin'i 200 mL LI-su içinde ayrı bir beherde çözün.
- Aşağıdakileri sırayla 500 mL LI-suya ekleyin: 4.78 g HEPES, 0.4 g K 2 HPO 4, 0.08 g MgSO4.7H 2 O, 1.85 g NaHCO3 ve 0.25 g CaCl 2.2H2 O.
- Adım 6.1.3 ve adım 6.1.4'teki çözümleri birleştirin. 100 μM'lik son konsantrasyona 1 mL 100 mM batofenantropinolinisülfonik asit sodyum tuzu (BPS) ekleyin.
- 1 M LI-MOPS ile pH'ı 7.2'ye ayarlayın. 1 L'lik son hacme LI suyu ekleyin ve ortamı 0,22 μm'lik bir membrandan geçirerek filtreleyin - sterilize edin. Ortama 100 μL steril tiamin (4 mg / mL) ekleyin.
- Adım 4.1'den itibaren 50 μL C. neoformans kültürü ile 5 mL YNB ortamını aşılayın. 30 °C ve 200 rpm'de 16-18 saat boyunca inkübe edin. 5 mL LIM'i 105 hücre / mL'lik son konsantrasyona aşılamak için bu kültürü kullanın.
- İstenilen konsantrasyonlara ulaşmak için yumuşakça ekstraktlarının uygun hacimlerini (örneğin, iki kat seyreltme veya önceki virülans testlerinden belirlenen hacim) ekleyin. Gevşetilmiş kapaklarla 37 °C'de ve 200 rpm'de 72 saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 1 mL hücre toplayın ve 2x'i steril PBS, pH 7.4, 1.500 × g'da 4 ° C'de 2 dakika boyunca yıkayın.
- Hücreleri 1 mL PBS'de nazikçe yeniden askıya alın. Hücreleri Hindistan Mürekkebi ile 1:1 oranında (örneğin, 4 μL hücre süspansiyonlu 4 μL Hindistan Mürekkebi) bir cam mikroskop slaytı üzerinde karıştırın. Slaytın üstüne bir kapak kapağı yerleştirin.
- 63x yağ hedefine sahip bir diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanarak numuneleri görselleştirin (bkz. Kontrastı otomatik olarak ayarlayın ve mikroskop kadranını kullanarak manuel olarak odaklanın. Tüm resimleri seçin ve TIFF formatında dışa aktarın. Filtre uygulanmasına gerek yoktur.
- ImageJ20'deki cetvel aracını kullanarak, toplam hücre boyutunun (kapsül dahil) hücre gövdesi boyutuna oranını ölçün.
7. Yumuşakça ekstraktlarının C. neoformans biyofilm üretimine etkisi
- Adım 4.1'den itibaren 50 μL C. neoformans kültürü ile 5 mL YNB ortamını aşılayın. 30 °C ve 200 rpm'de 16-18 saat boyunca inkübe edin.
- 5 mL kültüründen hücreleri toplayın. Hücreleri steril PBS, pH 7.4, 1.500 × g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca yıkayın.
- Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 3 mL'sindeki hücreleri, 107 hücre / mL'lik bir son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonunun 300 μL'sini steril, polistiren, düz tabanlı 24 delikli bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Medya içeren kuyuları yalnızca kontrol olarak kullanın.
- 10-20 μg / mL proteinin nihai konsantrasyonuna ulaşmak için yumuşakça ekstraktlarının uygun hacimlerini (örneğin, iki kat seyreltme veya önceki virülans testlerinden belirlenen hacim) ekleyin. Ayıklama hacminin toplam hacmin %10'undan büyük olmadığından emin olun.
- Plakaları alüminyum folyo ile sarın (ortam buharlaşmasını önlemek için) ve 30 ° C ve 37 ° C'de statik bir inkübatör kullanarak 48 saat boyunca inkübe edin.
- Bir şişe veya dağıtıcı kullanarak kuyuları 2 kat steril suyla yıkayın ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuğa 100 μL% 0.3 kristal menekşe çözeltisi ekleyin (sadece orta kontrol kuyuları dahil) ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Kuyuları steril suyla 3 kat iyice yıkayın (biyofilmler yıkama sırasında bozulmaz). 200 μL% 100 etanol ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 75 μL'yi yeni bir 96 delikli düz tabanlı plakaya aktarın ve OD550'yi okuyun. Biyofilm oluşumunu şu şekilde ölçün (OD 550nm numune - OD550nm boşluk).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan iş akışı, proteinlerin ve peptitlerin C. neoformans'a karşı potansiyel anti-virülans özelliklerine sahip yumuşakçalardan izole edilmesini sağlar. Benzer şekilde, farklı ekstrakt formlarının (yani, ham ve berraklaştırılmış) değerlendirilmesi, potansiyel aktif bileşiklerin yarı saflaştırılmasına izin verir ve aşağı akış değerlendirmesini destekler (örneğin, kütle spektrometrisi tabanlı proteomikler). Tipik olarak, protein ekstraksiyonu iş akışı, 4-8 mg / mL protein konsantrasyonlarına sahip homojenize çözeltiler üretir. Burada, temsili sonuçlar, C. chinensis ekstraktlarının enzimatik aktivitesinin ve antifungal özelliklerinin değerlendirilmesini göstermektedir. Ham ve berraklaştırılmış ekstraktlar, subtilisin A'nın proteolitik aktivitesini ( C. neoformans'ta virülans ile ilgili) inhibe edebildi (Şekil 3), IC 50 değerleri sırasıyla 5.3 μg / mL ve4.53 μg / mL'dir. C. chinensis ekstraktlarının aktivitesi, mantar büyümesi, kapsül ve melanin üretimi ve biyofilm oluşumu dahil olmak üzere C. neoformans virülans faktörü üretimi ile ilişkili süreçlere karşı daha fazla test edilmiştir. Ham madde varlığında (Şekil 4A) ve açıklığa kavuşturulmuş (Şekil 4B) C. chinensis ekstraktlarının varlığında 37 ° C'de mantar büyümesinde önemli bir azalma olmuştur. Özellikle, ham veya berraklaştırılmış C. chinensis ekstraktlarının varlığında kapsül veya melanin üretiminde herhangi bir değişiklik olmamıştır (Şekil 4C, D). Bununla birlikte, biyofilm oluşumunda% 70-80'lik önemli bir azalma, ham petrolün yüksek konsantrasyonlarında (Şekil 4E) gözlenmiştir ve işlenmemiş kontrole göre açıklığa kavuşturulmuş (Şekil 4F) ekstraktları açıklanmıştır.
Şekil 1: Yumuşakçalardan toplam protein ekstraksiyonu için iş akışı. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cryptococcus neoformans'ta yumuşakça ekstraktlarının proteolitik aktivite, büyüme ve virülans faktörü üretimi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılan genel strateji. DIC = diferansiyel girişim kontrast mikroskobu. Nanometre (nm) cinsinden dalga boyu ile gösterilen optik yoğunluk ölçümü. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yumuşakça proteini ekstraktlarının subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis ham ekstraktlarının proteolitik aktivitesi üzerindeki etkilerinin temsili sonuçları. (B) C. chinensis berraklaştırılmış ekstraktlar. Her nokta üç çoğaltmanın ortalamasını temsil eder. Çubuklar standart sapmayı gösterir. IC50 = yarı-maksimal inhibitör konsantrasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: C. chinensis ekstraktlarının C. neoformans'ta virülans faktörü üretimi üzerine etkilerinin temsili sonuçları. (A,B) C. neoformans'ın sırasıyla ham ve berraklaştırılmış C. chinensis ekstraktlarının varlığında 37 ° C'de büyümesi. (C) C. neoformans'ın ham (50 μg/mL) ve berraklaştırılmış (40 μg/mL) ekstraktların varlığında kapsül üretimi gösteren DIC mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) C. neoformanların ham (440 μg/mL) varlığında melanin üretimi ve 30 °C ve 37 °C'de berraklaştırılmış (410 μg/mL) ekstraktlar (E,F) Sırasıyla ham ve berraklaştırılmış ekstraktların varlığında C. neoformanların nispi biyofilm oluşumu. İstatistiksel analiz için tek yönlü ANOVA testi ve Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi yapıldı. *p < 0,05; **p < 0,01; ve ****p 0,0001 <. Her değer, en az beş biyolojik replikasyon ve iki teknik replikasyonun ortalamasına karşılık gelir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Gösterilen melanin görüntüleri üç biyolojik replikasyonu ve iki teknik replikayı temsil etmektedir. Gösterilen kapsül görüntüleri, durum başına 40-50 hücreyi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan ekstraksiyon protokolü, Ontario, Kanada'dan toplanan yumuşakçalardan bileşiklerin izolasyonunu özetlemekte ve yumuşakça ekstraktlarının insan mantar patojeni C. neoformans'a karşı kullanılmasının yeni bir araştırmasını göstermektedir. Bu protokol, omurgasızlardan peptidaz inhibitörü aktivitesini araştıran büyüyen bir araştırma grubuna katkıda bulunur13. Ekstraksiyon sırasında, bazı ekstrakt numunelerinin, muhtemelen filtre zarını tıkayan çözünür polisakkaritlerin ve / veya pigmentlerin varlığı nedeniyle filtrelenmesi-sterilize edilmesi zordu. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, büyük bileşikleri (örneğin, bozulmuş hücre zarları, genom DNA'sı) dışlamak için önce 5 μm'lik bir zardan süzülmeleri, böylece proteinlerin filtreden geçmesine izin vermeniz ve ardından 0.22 μm'lik bir zardan tekrar filtrelemeniz önerilir. Bu adımlar, numuneleri kirletebilecek ve aşağı akış deneylerine müdahale edebilecek mikropların varlığını kısıtladıkları için protokol için kritik öneme sahiptir.
Bu araştırma sırasında, subtilisinin S8 ailesi için bir model enzim olan subtilisin A'ya karşı peptidaz inhibitörleri tespit edildi. Bu enzim ailesinin üyeleri organizmalar arasında yaygın olarak dağılmıştır ve bu çalışmada gözlenen fenotipik etkileri destekleyen protein işleme, beslenme ve virülans mekanizmaları21,22 gibi çeşitli rollere sahiptir. Örneğin, hem ham hem de berraklaştırılmış ekstraktların varlığında ve nispeten yüksek ve düşük konsantrasyonlarda mantar büyümesinde önemli bir azalma gözlenmiştir, bu da inhibitör aktivitenin test edilen modelde sağlam olduğunu düşündürmektedir. OD'yi bir plaka okuyucu ile ölçerken, ekstraktların varlığının, kuyunun dibindeki mantar hücrelerinin kümelenmesine neden olduğu ve büyüme ölçümüne müdahale ettiği dikkat çekicidir. Bu sınırlama, hücre kümelenmesini önleyecek yüksek hızlı sallanan bir inkübatör (örneğin, 900 rpm) kullanılarak aşılabilir.
Beklenen fenotipik gözlemleri etkileyebilecek başka teknik sınırlamalar da olabilir. Örneğin, subtilisin benzeri peptidazlar, C. neoformans'ta melanin sentezi ve çekirdek algılaması ile ilişkilidir, ancak herhangi bir yumuşakçadan elde edilen ham veya berraklaştırılmış ekstraktlar, melanin üretimi üzerinde önemli etkiler göstermez16,17,18. Bu muhtemelen melanin ve kapsülün dış etkenlere karşı doğal koruyucu etkisinden kaynaklanmaktadır, bu da yumuşakça ekstraktlarının mantarın hücre içi bileşenlerini etkilemesini önleyebilir. Organik substratlarla çalışırken göz önünde bulundurulması gereken önemli faktörler, agar plakası içinde (melanin tahlillerinde kullanıldığı gibi) çözünürlük sorunları ortaya çıkarabilecek dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülme ihtiyacını içerir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ekstraktlar agar plakasının yüzeyi boyunca yayılabilir ve mantar hücrelerini plakaya tespit etmeden önce kurumaya bırakılabilir.
Önceki çalışmalar, C. neoformans biyofilmlerinin amfoterisin B ve kaspofungin dahil olmak üzere in vitro iki antifungal ajana duyarlılığını göstermiştir; Bununla birlikte, mantar flukonazol ve vorikonazol23'e dirençliydi. Mantar biyofilmlerinin virülans ve antimikrobiyal dirençteki önemi göz önüne alındığında, biyofilm oluşumuna müdahale etmek veya bozmak için yeni stratejilerin ortaya çıkarılması değerli olacaktır. Bu çalışmada, C. chinensis'ten elde edilen ham ve açıklığa kavuşturulmuş ekstraktlar, belirgin doz-yanıt davranışı ile kriptokok hücrelerinin biyofilmlerinin oluşumunu bozmuştur. Bu sonuçlar, yaklaşımın etkisini ve yeniliğini desteklemektedir. Özellikle, biyofilm oluşumu, arıtılmış ekstrakta kıyasla ham madde ile muamelede daha büyük ölçüde inhibe edilmiştir; bu, arıtma işlemi sırasında inhibitör bileşiklerin kaybına veya test edilen koşullar altında inhibitör fonksiyondaki bir azalmaya bağlı olabilir. Bu inhibitör etkilerden sorumlu proteinlerin yüksek moleküler ağırlığa sahip olması ve berraklaştırma işlemi sırasında kaybolması veya ısıl işlem sırasında bozulmaya duyarlı olması mümkündür. Bu sonuçlar, inhibitör fonksiyonlardaki değişiklikleri tespit etmek için hem ham hem de berraklaştırılmış ekstraktların kullanılmasının önemini vurgulamaktadır, çünkü inhibitör kaynakla ilgili farklılıklar sonucu etkileyebilir.
Genel olarak, bu protokol yumuşakçalardan bileşiklerin ekstraksiyonunu ve mantar virülansında kanıtlanmış rolleri olan seçilmiş bir peptidaza karşı varsayılan inhibitör aktivitenin ölçülmesini sağlar. Bu protokolde, ekstraktların yüksek verim ve güçlü peptidaz inhibitör aktivitesi ve C. neoformans büyümesi ve biyofilm oluşumuna karşı etkileri değerlendirilmiştir. Daha fazla deneye ihtiyaç duyulurken, bu sonuçlar yumuşakçaların bu tehlikeli mantar patojenine karşı varsayılan yeni bileşik kaynakları olarak önemini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu protokol yumuşakçalardan inhibitörlerin ekstraksiyonuna odaklanırken, metodoloji diğer omurgasızlara uyarlanabilir ve farklı omurgasızlardan türetilen inhibitörlerin mantar ve bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalarda virülans faktörü üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir24,25,2 6 . Nihayetinde, bileşiklerin doğal kaynaklardan çıkarılması, varsayılan yeni antimikrobiyal ajanların repertuarını artırabilir ve böylece bulaşıcı hastalıklarla mücadele yeteneklerimizi geliştirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Geddes-McAlister Laboratuvarı üyelerine bu araştırma boyunca değerli destekleri ve el yazması geri bildirimleri için teşekkür eder. Yazarlar, Ontario Lisansüstü Bursu ve Uluslararası Lisansüstü Araştırma Ödülü - Guelph Üniversitesi'nden D. G.-G'ye ve Kanada İnovasyon Vakfı'ndan (JELF 38798) ve Ontario Kolejler ve Üniversiteler Bakanlığı'ndan - J. G.-M için Erken Araştırmacı Ödülü'nden gelen finansman desteğini kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
