Summary
Det humane sopppatogenet Cryptococcus neoformans produserer en rekke virulensfaktorer (f.eks. Peptidaser) for å fremme overlevelse i verten. Miljønisjer representerer en lovende kilde til nye naturlige peptidasehemmere. Denne protokollen skisserer fremstilling av ekstrakter fra bløtdyr og vurderingen av deres effekt på soppvirulensfaktorproduksjon.
Abstract
Cryptococcus neoformans er et innkapslet humant sopppatogen med en global distribusjon som primært infiserer immunkompromitterte individer. Den utbredte bruken av antifungale midler i kliniske omgivelser, deres bruk i landbruket og stammehybridisering har ført til økt utvikling av resistens. Denne økende graden av resistens mot antifungale midler er en økende bekymring blant klinikere og forskere over hele verden, og det er økt haster med å utvikle nye antifungale terapier. For eksempel produserer C. neoformans flere virulensfaktorer, inkludert intra- og ekstracellulære enzymer (f.eks. Peptidaser) med roller i vevsnedbrytning, cellulær regulering og næringsoppkjøp. Forstyrrelsen av slik peptidaseaktivitet av inhibitorer forstyrrer soppvekst og spredning, noe som tyder på at dette kan være en viktig strategi for å bekjempe patogenet. Det er viktig at hvirvelløse dyr som bløtdyr produserer peptidasehemmere med biomedisinske anvendelser og antimikrobiell aktivitet, men de er underutforsket når det gjelder bruk mot sopppatogener. I denne protokollen ble det utført en global ekstraksjon fra bløtdyr for å isolere potensielle peptidasehemmere i rå og klargjorte ekstrakter, og deres effekter mot klassiske kryptokokkvirulensfaktorer ble vurdert. Denne metoden støtter prioriteringen av bløtdyr med antifungale egenskaper og gir muligheter for oppdagelse av antivirulensmidler ved å utnytte de naturlige hemmere som finnes i bløtdyr.
Introduction
Cryptococcus neoformans er et humant sopppatogen som produserer alvorlig sykdom hos immunkompromitterte verter, for eksempel personer som lever med HIV / AIDS1, og fører til omtrent 19% av AIDS-relaterte dødsfall2. Svampen er utsatt for flere klasser av antifungale midler, inkludert azoler, polyener og flucytosin, som utøver soppdrepende og fungistatisk aktivitet ved hjelp av forskjellige mekanismer 3,4. Imidlertid har den omfattende bruken av antifungale midler i kliniske og landbruksinnstillinger kombinert med stammehybridisering forsterket utviklingen av resistens i flere sopparter, inkludert C. neoformans5.
For å overvinne utfordringene med antifungal resistens og redusere forekomsten av soppinfeksjoner på global skala, er en lovende tilnærming å bruke virulensfaktorene til Cryptococcus spp. (f.eks. Temperaturtilpasningsevne, polysakkaridkapsel, melanin og ekstracellulære enzymer) som potensielle terapeutiske mål 4,6 . Denne tilnærmingen har flere fordeler, da disse virulensfaktorene er godt karakterisert i litteraturen, og målretting av disse faktorene kan potensielt redusere frekvensen av antifungal resistens ved å pålegge et svakere selektivt trykk gjennom å svekke virulens i stedet for å målrette cellevekst6. I denne sammenheng har mange studier vurdert muligheten for å målrette ekstracellulære enzymer (f.eks. Proteaser, peptidaser) for å redusere eller hemme virulensen av Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som virvelløse dyr og planter har ikke et adaptivt immunsystem for å beskytte seg mot patogener. Imidlertid er de avhengige av et sterkt medfødt immunsystem med et enormt utvalg av kjemiske forbindelser for å håndtere mikroorganismer og rovdyr10. Disse molekylene inkluderer peptidasehemmere, som spiller viktige roller i mange biologiske systemer, inkludert de cellulære prosessene for hvirvelløse immuniteter, slik som koagulering av hemolymfe, syntese av cytokiner og antimikrobielle peptider og beskyttelse av verter ved direkte inaktivering av proteasene av patogener11. Dermed har peptidasehemmere fra virvelløse dyr som bløtdyr potensielle biomedisinske anvendelser, men mange forblir ukarakteriserte10,12,13. I denne sammenheng er det omtrent 34 arter av terrestriske bløtdyr i Ontario og 180 ferskvannsbløtdyr i Canada14. Imidlertid er deres grundige profilering og karakterisering fortsatt begrenset15. Disse organismene gir en mulighet for identifisering av nye forbindelser med potensiell anti-soppaktivitet10.
I denne protokollen er metoder for å isolere og klargjøre ekstrakter fra virvelløse dyr (f.eks. bløtdyr) (figur 1) etterfulgt av måling av antatt peptidasehemmende aktivitet beskrevet. De antifungale egenskapene til disse ekstraktene vurderes deretter ved å måle deres innvirkning på C. neoformans virulensfaktorproduksjon ved hjelp av fenotypiske analyser (figur 2). Det er viktig å merke seg at forskjeller i antifungale egenskaper mellom rå og klargjorte ekstrakter kan være indikative for mikrobielle faktorer (f.eks. sekundære metabolitter eller toksiner produsert av vertsmikrobiomet) av bløtdyret, noe som kan påvirke eksperimentelle observasjoner. Slike funn støtter behovet for denne protokollen for å vurdere både grove og klargjorte ekstrakter uavhengig for å avdekke virkemåtene. I tillegg er ekstraksjonsprosessen objektiv og kan muliggjøre påvisning av antimikrobielle egenskaper mot en mengde sopp- og bakteriepatogener. Derfor gir denne protokollen et initieringspunkt for prioritering av bløtdyrarter med antifungale egenskaper mot C. neoformans og en mulighet til å evaluere sammenhengen mellom enzymatisk aktivitet og virulensfaktorproduksjon gjennom antatte hemmende mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Proteinekstraksjon fra bløtdyr
- Samle bløtdyr fra et utpekt og godkjent naturområde (f.eks. Speed, Guelph, Ontario). For denne studien ble både innfødte og invasive arter valgt for å vurdere et bredt spekter av potensielle antifungale effekter.
- Bryt forsiktig skallet på bløtdyrene (f.eks. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi og Cipangopaludina chinensis) ved hjelp av en pistol og mørtel, og fjern de faste stykkene med en pinsett. Vanligvis er 10 bløtdyr samlet for bruk gjennom hele protokollen.
- Samle og veie organene. Omtrent 15-20 g prøve er optimal. Bruk saks til å kutte organene i små biter omtrent 0,5-1 cm i størrelse.
- Blitzfrys de dissekerte og kuttede organprøvene med flytende nitrogen. Mal deretter organprøvene til et fint pulver ved hjelp av en pistol og mørtel.
- Tilsett organprøvepulveret (ca. 15 g) i 30 ml kaldt destillert vann (4 °C) for å oppnå et forhold på 1:2 (w/v).
- Hell 2 ml av prøven i 2 ml rør med høy effekt. Tilsett en skje med 3 mm perler i rustfritt stål (ca. 500 μg) i hvert rør, og homogeniser med en blender (se materialfortegnelse) i 3 minutter ved 1 200 o/min og 4 °C.
- Sentrifuge ved 12 000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Samle alle supernatantene med en pipette i et nytt 50 ml rør, kast pelleten.
- Filtrersteriliser supernatanten ved hjelp av en 0,22 μm membran. Lagre prøvene på is, og gå videre til avklaringsprotokollen (avsnitt 2), etter behov.
MERK: Prøvene kan flashfryses i flytende nitrogen og lagres ved -20 °C for bruk som råekstrakt.
2. Klargjøring av bløtdyrekstraktet
- Legg supernatantprøven fra trinn 1.8 i et termobad ved 60 °C i 30 minutter. Avkjøl deretter prøvene raskt ved å overføre dem til en bøtte med is i 20 minutter.
- Sentrifuger prøvene ved 15 000 × g i 45 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten i et nytt 50 ml rør, og kast pelleten. Filtrersteriliser prøvene med et 0,22 μm membranfilter, og oppbevar dem deretter på is.
- Bestem proteinkonsentrasjonen i prøvene fra trinn 1.8 (dvs. råekstraktet) og trinn 2.2 (dvs. det klargjorte ekstraktet) ved hjelp av en kvantifiseringsanalyse (f.eks. bicinchoninsyreanalyse17). Det optimale proteinkonsentrasjonsområdet er 4-8 mg / ml.
- Oppbevar prøvene på is i opptil 1 time eller flashfrys i flytende nitrogen, og oppbevar dem ved -20 °C til det trengs.
3. Analyse av hemmende aktivitet
- Mål den hemmende aktiviteten til de rå og klargjorte ekstraktene ved hjelp av enzymatiske analyser i teknisk triplikat.
MERK: Hver enzymatisk analyse består av et enzym (f.eks. subtilisin A, som er involvert i soppvirulens 16,17,18; vanligvis rundt 1 x 10-9 mol / L for kromogene baserte analyser), en buffer og et substrat. Reaksjonen starter når substratet møter enzymet. Den enzymatiske aktiviteten er proporsjonal med hastigheten på substratomdannelsen til produktet. - Vurdere effekten av enzymkonsentrasjon (EC) over enzymatisk aktivitet (EA) inntil lineær avhengighet oppnås mellom begge parametrene. For de neste trinnene, bruk en enzymkonsentrasjon innenfor det målte lineære området.
MERK: Den enzymatiske analysen for peptidase subtilisin A er beskrevet i følgende trinn. - Inkuber de rå (trinn 1,11) eller klargjorte (trinn 2,5) bløtdyrproteinekstraktene (f.eks. 10 μL inneholdende 4 mg/ml protein) med 10 μL subtilisin A (konsentrasjon bestemt fra trinn 3,2) og 220 μL på 100 mM Tris-HCl ved pH 8,6 (for kontroll, tilsett 230 μL Tris-buffer uten å tilsette ekstraktet) i 10 minutter ved 25 °C i en 96-brønns flatbunnplate.
- Tilsett 10 μL N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, substratet for subtilisin A, ved en endelig konsentrasjon på 1 K m (Michaelis-Menten konstant; 0,2mM for dette substratet med subtilisin A) for et endelig reaksjonsvolum på 250 μL.
- Mål den enzymatiske aktiviteten ved å overvåke utseendet til produktet over tid ved å lese den optiske tettheten (OD) ved 405 nm hver 15. s i 3 minutter.
- Bestem gjenværende enzymatisk aktivitet ved å beregne forholdet mellom den enzymatiske aktiviteten i nærvær av bløtdyrekstraktet og det i fravær av ekstraktet.
- Hvis inhibitorisk aktivitet observeres (dvs. restaktivitet under 1), måles den hemmende konsentrasjonsverdien 50 (IC50) ved hjelp av en rekke konsentrasjoner av ekstraktene (f.eks. en todelt fortynningsserie fra 200 μg / ml til 1 μg / ml) etter standardmetoder19.
4. Effekt av bløtdyrekstrakter på C. neoformans vekst
- Bruk en 10 μL pipettespiss for å introdusere en enkelt koloni av C. neoformans var. grubii H99 villtype (WT) i 5 ml gjærekstrakt-pepton-dekstrose (YPD) medium (10 g / l gjærekstrakt, 20 g / l pepton og 20 g / l dextrose, pH 6,5), og inkuber i 16-18 timer ved 30 ° C og 200 rpm. Utfør forsøket i biologisk triplikat og teknisk duplikat.
- Samle 500 μL av kulturen i en kuvette, og mål veksten ved å lese OD ved 600 nm. Fortynn kulturen med gjærnitrogenbase (YNB) medium til en endelig OD600 på 0,02.
- Samkultur C. neoformans celler med forskjellige konsentrasjoner (f.eks. en trefoldig fortynningsserie fra 440 μg / ml til 15 μg / ml protein) av ekstraktene (dvs. rå og klargjort). For å gjøre dette, bland 10 μL av ekstraktene med 190 μL av den fortynnede C. neoformanskulturen (trinn 4.2) i en 96-brønnplate.
- Mål veksten ved å lese OD 600 ved hjelp av en plateleser hvert 15. minutt til 1 time i 72 timer ved200 o / min og 37 ° C.
5. Effekt av bløtdyrekstrakter på C. neoformans melaninproduksjon
- Forbered L-3,4-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) plater.
- Autoklav 230 ml 14 g/l agar, og la den avkjøles til den når 50-60 °C.
- Tilsett 3,25 ml 1 M glycin, 7,35 ml 1 M KH 2 PO 4, 2,5 ml 1 M MgSO4,7H 2 O, 0,6 ml 40% glukose, 70 μL 10 mM tiamin og 2,5ml 100 mM L-DOPA (filtersterilisert) til flytende agar.
- Hell 15 ml av blandingen i petrisklater, la dem tørke i ca. 1 time i mørket, og oppbevar ved 2-4 °C i opptil 1 uke. Forsikre deg om at lokkene er delvis løftet for at agaren skal tørke ordentlig.
- Inokuler 5 ml YNB medium med 50 μL C. neoformans kultur fra trinn 4.1. Inkuber i 16-18 timer ved 30 °C og 200 o / min.
- Spinn ned cellene ved 1000 × g i 5 minutter ved 4 °C. Vask cellene 2x med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) ved pH 7,4.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Resuspender cellene i 1 ml PBS for å nå en endelig konsentrasjon på 106 celler / ml.
- Forbered en fortynningsserie (f.eks. todelt) av de rå og klargjorte bløtdyrekstraktene. På samme måte forbereder du en 10 ganger fortynningsserie av C. neoformans-celler (trinn 5,4) fra 1 x 106 celler / ml til 1 x 101 celler / ml ved bruk av steril PBS i 96-brønnsplater.
- Fordel 200 μl av ekstraktene på petrisklater som inneholder L-DOPA-agar med en vattpinne, og la dem tørke i 15 minutter.
- Spot 5 μL kultur fra hver brønn på L-DOPA-platen, og la 1 cm mellom dråpene. La det tørke i mørket i 15 min.
- Inkuber platene ved 30 °C og 37 °C i en statisk inkubator i 3-5 dager, og ta bilder hver 24. time med et kamera eller platekamera (f.eks. skanner).
MERK: To temperaturforhold brukes her for å utforske temperaturens innflytelse på de veksthemmende effektene av bløtdyrekstraktene, med 30 °C som representerer miljø og 37 °C som representerer menneskelige fysiologiske temperaturer.
6. Effekt av bløtdyrekstrakter på C. neoformans polysakkaridkapselproduksjon
- Klargjør lavt jernmedium (LIM) som beskrevet nedenfor.
- Løs opp 5 g chelaterende harpiks (se materialfortegnelse) i 60 ml ultrarent vann, og pakk inn i en glasskolonne (2 cm diameter x 25 cm lengde). Vask kolonnen med 100 ml vann, og kast det oppsamlede vannet.
- Forbered lavt jernvann (LI-vann) ved å føre 2 l sterilt ultrarent vann gjennom chelateringskolonnen. Oppbevar LI-vann ved 4 °C i opptil 3 måneder.
- Løs opp 5 g glukose i 100 ml LI-vann. Løs opp 5 g L-asparagin i 200 ml LI-vann i et separat beger.
- Legg følgende til 500 ml LI-vann i rekkefølge: 4,78 g HEPES, 0,4 gK2HPO 4, 0,08 gMgSO 4,7H2O, 1,85 g NaHCO 3 og 0,25g CaCl 2,2H 2 O.
- Kombiner løsningene fra trinn 6.1.3 og trinn 6.1.4. Tilsett 1 ml 100 mM bathofenanthrolinedisulfonic acid sodium salt (BPS) til en endelig konsentrasjon på 100 μM.
- Juster pH til 7,2 med 1 M LI-MOPPER. Tilsett LI-vann til et endelig volum på 1 L, og filtrer mediet ved å føre det gjennom en 0,22 μm membran. Tilsett 100 μL steril tiamin (4 mg / ml) til mediet.
- Inokuler 5 ml YNB medium med 50 μL av C. neoformans kultur fra trinn 4.1. Inkuber i 16-18 timer ved 30 °C og 200 o / min. Bruk denne kulturen til å inokulere 5 ml LIM til en endelig konsentrasjon på 105 celler/ml.
- Tilsett passende volum av bløtdyrekstraktene (f.eks. en todelt fortynning eller volumet bestemt fra tidligere virulensanalyser) for å nå de ønskede konsentrasjonene. Inkuber i 72 timer ved 37 °C og 200 o / min med løsnede lokk. Etter inkubering, samle 1 ml celler, og vask 2x med steril PBS, pH 7,4, ved 1,500 × g i 2 minutter ved 4 ° C.
- Forsiktig resuspender cellene i 1 ml PBS. Bland cellene med India Ink i forholdet 1: 1 (f.eks. 4 μL India Ink med 4 μL cellesuspensjon) over et glassmikroskopglass. Plasser en følgeseddel på toppen av lysbildet.
- Visualiser prøvene ved hjelp av et DIC-mikroskop (differensiell interferenskontrast) med et 63x oljemål (se materialtabellen). Sett kontrasten til automatisk, og fokuser manuelt ved hjelp av mikroskophjulet. Velg alle bildene, og eksporter dem i TIFF-format. Ingen filtre må brukes.
- Bruk linjalverktøyet i ImageJ20 til å kvantifisere forholdet mellom den totale cellestørrelsen (inkludert kapselen) og cellestørrelsen.
7. Effekt av bløtdyrekstrakter på C. neoformans biofilmproduksjon
- Inokuler 5 ml YNB medium med 50 μL C. neoformans kultur fra trinn 4.1. Inkuber i 16-18 timer ved 30 °C og 200 o / min.
- Høst celler fra 5 ml kulturen. Vask cellene med steril PBS, pH 7,4, ved 1 500 × g i 2 minutter ved 4 °C.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer. Resuspender cellene i 3 ml av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) til en endelig konsentrasjon på 107 celler/ml.
- Overfør 300 μL av cellesuspensjonen til de enkelte brønnene i en steril, polystyren, flatbunns 24-brønnplate. Bruk brønner bare med medier som en kontroll.
- Legg til passende volumer av bløtdyrekstraktene (f.eks. en todelt fortynning eller volumet bestemt fra tidligere virulensanalyser) for å nå en endelig konsentrasjon på 10-20 μg / ml protein. Forsikre deg om at ekstraktvolumet ikke er større enn 10% av totalvolumet.
- Pakk platene med aluminiumsfolie (for å unngå mediefordampning), og inkuber i 48 timer med en statisk inkubator ved 30 °C og 37 °C.
- Bruk en flaske eller dispenser til å vaske brønnene 2x med sterilt vann, og la dem lufttørke i 10-15 min ved romtemperatur. Deretter tilsettes 100 μL 0,3% krystallfiolett løsning til hver brønn (inkludert de mellomstore kontrollbrønnene), og inkuberes ved romtemperatur i 10 minutter.
- Vask brønnene grundig 3x med sterilt vann (biofilmene vil ikke bli forstyrret under vask). Tilsett 200 μL 100% etanol, og inkuber i 10 minutter ved RT.
- Overfør 75 μL til en ny 96-brønns flatbunnplate, og les OD550. Kvantifiser biofilmdannelsen som (OD 550nm av prøve - OD550nm blank).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten beskrevet her muliggjør isolering av proteiner og peptider fra bløtdyr med potensielle antivirulensegenskaper mot C. neoformans. På samme måte tillater vurdering av forskjellige former for ekstrakter (dvs. rå og klargjort) halvrensing av de potensielle aktive forbindelsene og støtter nedstrøms vurdering (f.eks. massespektrometribasert proteomikk). Vanligvis produserer arbeidsflyten for proteinekstraksjon homogeniserte løsninger med proteinkonsentrasjoner på 4-8 mg / ml. Her demonstrerer de representative resultatene vurderingen av den enzymatiske aktiviteten og antifungale egenskapene til C. chinensis-ekstrakter. De grove og klargjorte ekstraktene var i stand til å hemme den proteolytiske aktiviteten til subtilisin A (relatert til virulens i C. neoformans) (figur 3), med IC 50-verdier på henholdsvis 5,3 μg/ml og4,53 μg/ml. Aktiviteten til C. chinensis-ekstraktene ble videre testet mot prosesser assosiert med C. neoformans virulensfaktorproduksjon, inkludert soppvekst, kapsel- og melaninproduksjon og dannelse av biofilm. Det var en signifikant reduksjon i soppvekst ved 37 °C i nærvær av råolje (figur 4A) og klargjorte (figur 4B) C. chinensis-ekstrakter. Spesielt var det ingen endringer i kapsel- eller melaninproduksjonen i nærvær av rå eller klargjorte C. chinensis-ekstrakter (figur 4C,D). Det ble imidlertid observert en signifikant reduksjon på 70%-80 % i biofilmdannelse ved høye konsentrasjoner av råolje (figur 4E) og klargjorte (figur 4F) ekstrakter i forhold til den ubehandlede kontrollen.
Figur 1: Arbeidsflyt for total proteinekstraksjon fra bløtdyr. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generell strategi brukt til å vurdere effekten av bløtdyrekstrakter på proteolytisk aktivitet, vekst og virulensfaktorproduksjon i Cryptococcus neoformans. DIC = differensiell interferenskontrastmikroskopi. Optisk tetthetsmåling indikert med bølgelengden i nanometer (nm). Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative resultater av effekten av bløtdyrproteinekstrakter på den proteolytiske aktiviteten til subtilisin A. (A) Cipangopaludina chinensis råekstrakter. (B) C. chinensis klargjorde ekstrakter. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av tre replikater. Søyler angir standardavvik. IC50 = halvmaksimal hemmende konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av effekten av C. chinensis-ekstrakter på virulensfaktorproduksjon i C. neoformans. (A,B) Vekst av C. neoformans ved 37 °C i nærvær av henholdsvis rå og klarerte C. chinensis-ekstrakter. (C) DIC-mikroskopibilder av C. neoformans som viser kapselproduksjon i nærvær av råolje (50 μg / ml) og klargjorte (40 μg / ml) ekstrakter. Skalastang = 10 μm. (D) Melaninproduksjon av C. neoformans i nærvær av råolje (440 μg / ml) og klargjorte (410 μg / ml) ekstrakter ved 30 ° C og 37 ° C. (E,F) Relativ biofilmdannelse av C. neoformans i nærvær av henholdsvis rå og klargjorte ekstrakter. For statistisk analyse ble det utført en enveis ANOVA-test og en Dunnetts multippel sammenligningstest. *p < 0,05; **p < 0,01; og ****p < 0,0001. Hver verdi tilsvarer et gjennomsnitt på minst fem biologiske replikater og to tekniske replikater. Feilfelt angir standardavvik. Melaninbildene som vises er representative for tre biologiske replikater og to tekniske replikater. Kapselbildene som vises er representative for 40-50 celler per tilstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekstraksjonsprotokollen beskrevet her skisserer isoleringen av forbindelser fra bløtdyr samlet fra Ontario, Canada, og demonstrerer en ny undersøkelse av bruk av bløtdyrekstrakter mot det humane sopppatogenet, C. neoformans. Denne protokollen legger til en voksende forskningsgruppe som undersøker peptidasehemmeraktivitet fra virvelløse dyr13. Under ekstraksjonen var noen ekstraktprøver vanskelige å filtrere, muligens på grunn av tilstedeværelsen av løselige polysakkarider og / eller pigmenter som blokkerte filtermembranen. For å overvinne denne begrensningen anbefales det å filtrere først gjennom en 5 μm membran for å utelukke store forbindelser (f.eks. Forstyrrede cellemembraner, genom-DNA), slik at proteinene kan passere gjennom filteret, og deretter filtrere igjen gjennom en 0,22 μm membran. Disse trinnene er kritiske for protokollen, da de begrenser tilstedeværelsen av mikrober som kan forurense prøvene og forstyrre nedstrøms eksperimenter.
Under denne undersøkelsen ble peptidasehemmere påvist mot subtilisin A, et modellenzym for S8-familien av subtilisin. Medlemmer av denne enzymfamilien er utbredt blant organismer og har varierende roller, for eksempel i proteinbehandling, ernæring og virulensmekanismer21,22, som støtter de fenotypiske effektene observert i denne studien. For eksempel ble det observert en signifikant reduksjon i soppvekst i nærvær av både rå og klarerte ekstrakter og ved relativt høye og lave konsentrasjoner, noe som tyder på at den hemmende aktiviteten var robust i den testede modellen. Det er bemerkelsesverdig at ved måling av OD med en plateleser, forårsaket tilstedeværelsen av ekstraktene klumping av soppcellene i bunnen av brønnen, og forstyrret vekstmåling. Denne begrensningen kan overvinnes ved å bruke en høyhastighets risting inkubator (f.eks 900 rpm), som ville unngå celle klumping.
Det kan finnes andre tekniske begrensninger som kan påvirke de forventede fenotypiske observasjonene. For eksempel er subtilisinlignende peptidaser assosiert med melaninsyntese og quorumssensing i C. neoformans, men de rå eller klargjorte ekstraktene fra noen bløtdyr viser ikke signifikante effekter på melaninproduksjonen16,17,18. Dette skyldes muligens den naturlige beskyttende effekten av melanin og kapsel mot eksterne agenter, noe som kan forhindre at bløtdyrekstraktene påvirker de intracellulære komponentene i soppen. Viktige faktorer å vurdere når du arbeider med organiske substrater inkluderer behovet for å oppløse dem i dimetylsulfoksid (DMSO), som kan presentere løselighetsproblemer i agarplaten (som brukt i melaninanalysene). For å overvinne dette problemet kan ekstraktene spres langs overflaten av agarplaten og få tørke før spotting av soppcellene på platen.
Tidligere arbeid demonstrerte følsomheten til C. neoformans biofilmer til to antifungale midler in vitro, inkludert amfotericin B og caspofungin; Soppen var imidlertid resistent mot flukonazol og vorikonazol23. Gitt betydningen av soppbiofilmer i virulens og antimikrobiell resistens, vil det være verdifullt å avdekke nye strategier for å forstyrre eller forstyrre biofilmdannelse. I den nåværende studien svekket rå og klargjorte ekstrakter fra C. chinensis dannelsen av biofilmer av kryptokokkceller med tilsynelatende dose-respons-oppførsel. Disse resultatene støtter virkningen og nyheten av tilnærmingen. Spesielt ble biofilmdannelse hemmet i større grad ved behandling med råolje sammenlignet med det klargjorte ekstraktet, noe som kan skyldes tap av hemmende forbindelser under klargjøringsprosessen eller en reduksjon i hemmende funksjon under de testede forholdene. Det er mulig at proteinene som er ansvarlige for disse hemmende effektene har høy molekylvekt og gikk tapt under avklaringsprosessen eller var utsatt for nedbrytning under termisk behandling. Disse resultatene understreker viktigheten av å bruke både grove og klargjorte ekstrakter for å oppdage endringer i hemmende funksjoner, da forskjeller relatert til inhibitorkilden kan påvirke utfallet.
Samlet sett muliggjør denne protokollen ekstraksjon av forbindelser fra bløtdyr og måling av antatt hemmende aktivitet mot en selektert peptidase med demonstrerte roller i soppvirulens. I denne protokollen ble ekstraktenes høye utbytte og sterke peptidasehemmende aktivitet og deres effekt mot C. neoformans vekst og biofilmdannelse evaluert. Mens det er behov for ytterligere eksperimenter, understreker disse resultatene viktigheten av bløtdyr som antatte nye kilder til forbindelser mot dette farlige sopppatogenet. Videre, mens denne protokollen fokuserer på ekstraksjon av inhibitorer fra bløtdyr, er metodikken tilpasningsdyktig til andre virvelløse dyr og kan brukes til å vurdere effekten av inhibitorer avledet fra forskjellige virvelløse dyr på virulensfaktorproduksjon i en rekke mikroorganismer, inkludert sopp og bakterier24,25,2 6 . Til syvende og sist kan ekstraksjon av forbindelser fra naturlige kilder øke repertoaret av antatte nye antimikrobielle midler og dermed forbedre våre evner til å bekjempe smittsomme sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer av Geddes-McAlister Lab for deres verdifulle støtte gjennom denne undersøkelsen og deres tilbakemeldinger fra manuskriptet. Forfatterne anerkjenner finansieringsstøtten fra Ontario Graduate Scholarship og International Graduate Research Award - University of Guelph til DG og fra Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) og Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award for JG-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. Werger, M. J. A. , Springer. Dordrecht, the Netherlands. 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2013).
- Collins, T. J.
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
