Summary
يصف هذا البروتوكول الزرع التقويمي للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة. يلخص النموذج المرض النقيلي المتقدم لسرطان القولون والمستقيم ويسمح بتقييم الأدوية العلاجية الجديدة في سيناريو ذي صلة سريريا لنقائل الرئة والكبد.
Abstract
على مدى العقد الماضي ، تم إنشاء نماذج أكثر تطورا لسرطان القولون والمستقيم قبل السريري (CRC) باستخدام الخلايا السرطانية المشتقة من المريض والأورام 3D. نظرا لأن عضويات الورم المشتقة من المريض يمكن أن تحتفظ بخصائص الورم الأصلي ، فإن هذه النماذج قبل السريرية الموثوقة تمكن من فحص أدوية السرطان ودراسة آليات مقاومة الأدوية. ومع ذلك ، يرتبط الموت المرتبط ب CRC في المرضى في الغالب بوجود مرض نقيلي. لذلك من الضروري تقييم فعالية العلاجات المضادة للسرطان في النماذج ذات الصلة في الجسم الحي التي تلخص حقا السمات الجزيئية الرئيسية لورم خبيث للسرطان البشري. لقد أنشأنا نموذجا تقويميا يعتمد على حقن الخلايا السرطانية المشتقة من مريض CRC مباشرة في جدار الأعور للفئران. تطور هذه الخلايا السرطانية أوراما أولية في الأعور تنتقل إلى الكبد والرئتين ، والتي يتم ملاحظتها بشكل متكرر في المرضى الذين يعانون من CRC المتقدم. يمكن استخدام نموذج الماوس CRC هذا لتقييم استجابات الأدوية التي تتم مراقبتها بواسطة التصوير المقطعي المحوسب (μCT) ، وهي طريقة تصوير صغيرة النطاق ذات صلة سريريا يمكنها بسهولة تحديد الأورام الأولية أو النقائل في المرضى. هنا ، نصف الإجراء الجراحي والمنهجية المطلوبة لزرع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني للوفاة بالسرطان في جميع أنحاء العالم1. إن القدرة على توليد نماذج الورم في المختبر أو في الجسم الحي المشتقة من الخلايا السرطانية الفردية للمريض لديها طب دقيق متقدم في علم الأورام. على مدى العقد الماضي ، تم استخدام المواد العضوية المشتقة من المرضى (PDOs) أو الطعوم الخارجية (PDXs) من قبل العديد من المجموعات البحثية حولالعالم 2. PDOs هي هياكل متعددة الخلايا في المختبر تشبه ميزات أنسجة الورم الأصلية ويمكنها التنظيم الذاتي والتجديد الذاتي3. يمكن استخدام هذه النماذج الواعدة في المختبر بنجاح لفحص الأدوية وتسهيل البحث الانتقالي. على الجانب الآخر ، تلخص نماذج PDX بأمانة اتفاقية حقوق الطفل الأصلية على جميع المستويات ذات الصلة ، من الأنسجة إلى السمات الجزيئية والاستجابة للأدوية 2,4.
في الجسم الحي تزرع نماذج PDX في الغالب كأورام تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. باستخدام هذا النهج ، أصبحت PDXs المعيار الذهبي في أبحاث السرطان ، خاصة لدراسة حساسية الأدوية أو مقاومتها. ومع ذلك ، ترتبط الوفيات المرتبطة ب CRC في الغالب بوجود آفات نقيلية في الكبد أو الرئة أو التجويف البريتوني ، ولا يمكن لأي من النهجين (PDO أو PDX) تلخيص الإعداد السريري المتقدم. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الموقع المحدد لنمو الورم يحدد الخصائص البيولوجية المهمة التي لها تأثير على فعالية الدواء وتشخيص المرض2. لذلك ، هناك حاجة ملحة لإنشاء نماذج ما قبل السريرية التي يمكن استخدامها لتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان في بيئة النقيلي ذات الصلةسريريا 6.
يمكن أن تعمل ماسحات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT) كماسحات ضوئية مقطعية سريرية مصغرة ، مما يوفر تصويرا أوليا للورم وورم خبيث في الفئران بدقة صورة متدرجة تتناسب مع صور التصوير المقطعي المحوسب لمرضى السرطان7. لمواجهة تباين الأنسجة الرخوة الضعيف لتقنية μCT ، يمكن استخدام عوامل التباين المعالجة باليود الإشعاعي لتحسين التباين وتقييم عبء الورم. باستخدام نهج التباين المزدوج ، يتم إعطاء اليود الفموي وداخل الصفاق في أوقات مختلفة. يساعد التباين الذي يتم إعطاؤه عن طريق الفم على تحديد الحدود بين أنسجة الورم ومحتوى الأعور داخل الأمعاء. على الجانب الآخر ، يسمح التباين الذي يتم إعطاؤه داخل الصفاق بتحديد الحدود الخارجية لكتلة الورم ، والتي تنمو بشكل متكرر وتغزو الصفاق8.
تصف المخطوطة بروتوكولا لإجراء زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة ، ومنهجية مراقبة نمو الورم المعوي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب. تظهر المخطوطة الحالية أن النموذج يلخص السيناريو السريري لأورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلي في مرضى CRC التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج PDO أو PDXO. نظرا لأن نماذج PDX التقويمية ل CRC تلخص السيناريو السريري لمرضى CRC ، فإننا نستنتج أنها الأفضل حتى الآن لاختبار فعالية الأدوية المضادة للأورام في أورام الأمعاء المتقدمة والأمراض النقيلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة أخلاقيات البحث في مستشفى جامعة فال ديبرون ، برشلونة ، إسبانيا (معرف الموافقة: PR (IR) 79/2009 PR (AG) 114/2014 ، PR (AG) 18/2018). تألفت عينات أنسجة القولون البشري من خزعات من مناطق غير نخرية من الأورام الغدية الأولية أو نقائل الكبد ، المقابلة للمرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم الذين خضعوا لاستئصال الورم. أجريت التجارب وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي لرعاية (86/609 / EEC) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على التابعة لمعهد VHIR-the Vall d'Hebron للبحوث (ID: 40/08 CEEA و 47/08/10 CEEA و 12/18 CEEA).
ملاحظة: أنثى NOD-SCID (إيماءة. تم شراء الفئران CB17-Prkdcscid / NcrCrl) من عمر 8 أسابيع من مختبرات نهر تشارلز.
1. اشتقاق خلايا المريض
- قلع الورم
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في خزانة بيولوجية في درجة حرارة الغرفة (RT) في منشأة.- الحصول على عينات الورم من العمليات الجراحية للمرضى أو الخزعات ومن PDXs التي تنمو تحت الجلد في الفئران.
- بالنسبة للحقن التقويمي ، قم بإعداد الخلايا السرطانية من نماذج ورم PDX تحت الجلد بدلا من الأنسجة التي تم الحصول عليها مباشرة من المرضى9.
- توليد أورام PDX عن طريق تلقيح معلق من 1 × 105 خلايا سرطانية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (50 ميكرولتر) ممزوج بمصفوفة Matrigel (50 ميكرولتر) تحت الجلد في جناح الفئران NOD-SCID2.
- قياس نمو الورم باستخدام الفرجار كل يوم.
ملاحظة: الأهم من ذلك ، أن مختبرنا قد أنشأ بنكا حيويا لأكثر من 350 نموذجا PDX. تم إنشاء نماذج الورم CRC-PDX المستخدمة في البروتوكول نماذج PDX في المختبر والتي تم تضخيمها أكثر من ثلاثة مقاطع في الفئران ، واجتازت معايير التضمين / الاستبعاد بنتيجة إيجابية (الجدول 1).
- قياس نمو الورم باستخدام الفرجار كل يوم.
- القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم عندما تصل الأورام تحت الجلد إلى الحد الأقصى للحجم الذي حددته CEEA (قطره 1 سم) ، أو عندما تصل إلى معايير نقطة النهاية.
- استخراج الورم وإزالته بعناية من الجلد والأنسجة المحيطة غير الورم باستخدام المقص والملقط.
- قم بتخزين الأورام المحصودة في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
ملاحظة: فصل الأورام في تعليق الخلية في أقرب وقت ممكن بعد إزالتها من موقعها الأصلي في آفات المرضى أو الطعوم الخارجية تحت الجلد في الفئران. يتم تقليل صلاحية الخلية بشكل كبير بعد 24 ساعة من إزالة الأنسجة ، مما يؤدي إلى زرع غير فعال في الفئران المتلقية.
- إعداد الخلية
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في خزانة بيولوجية في درجة حرارة الغرفة (RT) في غرفة زراعة الأنسجة.- افصل الأورام باستخدام شفرة في صفيحة استزراع 10 سم مع 1 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل (الجدول 2) (لتسهيل الفرم). ضع العينة المتجانسة المنفصلة في أنبوب مخروطي حجمه 15 mL.
- أضف وسط CoCSCM 6Ab الكامل إلى الحجم النهائي البالغ 5 مل (لا تستخدم أكثر من 3 مل من العينة المنفصلة في نفس الأنبوب).
ملاحظة: CRC الأولية التي تم استئصالها من المرضى ملوثة بشكل طبيعي بالبكتيريا والفطريات. من الضروري إزالة مسببات الأمراض الموجودة في عينة المريض الأصلية باستخدام مزيج من ستة مضادات حيوية (البنسلين ، الستربتومايسين ، فطريات زون ، كاناميسين ، جنتاميسين ، ونيستاتين). قد يؤدي حقن الخلايا السرطانية الملوثة بالبكتيريا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة إلى موت. - احتضان مع 50 ميكرولتر من DNase I (0.08 كيلو وحدة / مل) و 50 ميكرولتر من كولاجيناز (1.5 ملغ / مل) (وسط الهضم ؛ الجدول 2) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا ، في وضع 45 درجة. امزج المحلول جيدا كل 15 دقيقة مع ماصة سعة 5 مل قبل الحضانة.
ملاحظة: فصل أنسجة الورم وهضمها عن طريق سحب عدة مرات للحصول على محلول خلية واحدة. هذا ضروري لحساب الخلايا قبل الحقن في الفئران المتلقية وبالتالي تحقيق زرع متجانس للخلايا السرطانية. - أضف 5 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل واخلطه جيدا مع ماصة 5 مل.
- قم بفرز المحلول باستخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر باستخدام أنبوب معقم جديد سعة 50 مل.
- قم بتدوير الخلايا التي تم فرزها عند 500 × جم لمدة 8 دقائق في RT.
- نضح الطاف.
- أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من محلول عازلة تحلل RBC 1x.
- احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
- أضف 3 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل ، وماصة العينة ، وقم بتدويرها عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في RT. نضح الطاف.
- أعد تعليق الحبيبات ب 5-10 مل من وسط CoCSCM 6Ab الكامل ، واستخدم عداد الخلايا لحساب العدد الإجمالي للخلايا.
- قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في RT ، وأعد تعليقها في 10 مل من PBS.
- أعد تعليق الحبيبات للحصول على تركيز 20 × 106 خلايا / مل ، واخلطها جيدا للحصول على تعليق خلية متجانس.
- تحضير محاقن 29 جم (0.5 مل U 100 إبرة ، 0.33 مم [29 جم] × 12.7 مم) لحقن الأعور في زراعة الأنسجة (حقنة / فأر واحد). قم بتحميل 50 ميكرولتر من معلق الخلايا السرطانية (1 × 106 خلايا / حقن) في المحقنة واحتفظ بها على الجليد. تأكد من إزالة فقاعات الهواء من تعليق الخلية.
ملاحظة: يعد التخلص من فقاعات الهواء عند تحميل الخلايا السرطانية في المحقنة أمرا ضروريا لتجنب حقن حجم زائد في جدار الأعور ، مما قد يؤدي إلى تمزق الأنسجة وفقدان العينة. من الضروري خلط تعليق الخلية جيدا عند تحميل المحقنة لتجنب حجم الورم غير المتكافئ بين الفئران في نفس التجربة.
2. حقن تقويم العظام في الأعور
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي على مقعد في غرفة محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في منشأة. يتم تنظيف المعدات المستخدمة وتعقيمها مسبقا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تعقيمها مرة أخرى في معقم محمول بين الأفراد أو المناطق في منشأة.
- نظف موقع الجراحة عن طريق الرش بمنظف مطهر ومسح.
- إزالة الشعر من بطن الفئران باستخدام آلة إزالة شعر الفأر.
- ضع الماوس في وضع ضعيف. استخدم 2٪ إيزوفلوران لتخدير. تأكيد تأثير التخدير عن طريق معسر الطرف بلطف ومراقبة عدم وجود التحفيز.
- ضع قطرة 50-100 ميكرولتر من المرهم البيطري (3 ملغ / غرام Lacryvisc) في العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- تطهير بطن الفأر عن طريق التنظيف بالكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود عدة مرات في حركة دائرية.
- قم بعمل شق طولي 1 سم على أسفل البطن باستخدام مقص الجراحة. افصل الجلد بعناية عن كل موقع لتقديم الصفاق الموجود تحت الجلد.
- قم بعمل شق 0.5-1 سم في غشاء الصفاق ، كبير بما يكفي لإضفاء الطابع الخارجي على الأعور.
ملاحظة: إضفاء الطابع الخارجي على الأعور دون التلاعب المفرط بالأعضاء الداخلية ، مما قد يزيد بشكل كبير من فتك الإجراء. - اعزل الأعور بعناية عن الماوس باستخدام شاش معقم مقطوع مسبقا.
- بلل الأعور بمحلول ملحي طوال العملية.
- شل حركة الأعور عن طريق الإمساك بها بعناية بالملقط ، وإدخال الإبرة بشكل سطحي في جدار الأعور. تجنب الشعيرات الدموية والأوعية في موقع الحقن. إزالة الفقاعات من تعليق الخلية.
- حقن 50 ميكرولتر كاملة من تعليق الخلايا السرطانية ببطء. عادة ما يستغرق حوالي 10 ثوان للإدارة. تجنب ثقب تجويف الأعور بالإبرة ، لأن هذا يؤدي إلى القضاء على تعليق الخلايا السرطانية من الجسم من خلال التمعج المعوي.
ملاحظة: حقن تعليق الخلايا السرطانية في الأعور من الفئران هو الخطوة الأكثر تحديا في الإجراء بأكمله. يجب استخدام ضوء ساطع يركز على موقع الحقن والعدسة المكبرة في هذا الجزء من البروتوكول. أدخل الإبرة الموازية لسطح الأعور. الأعور هو نسيج هش للغاية. لذلك ، يجب إجراء تثبيت الأعور باستخدام ملقط جراحي وعن طريق الضغط اللطيف لتجنب تمزق الأنسجة مما يؤدي إلى نزيف. ينتج عن الزرع الناجح فقاعة بيضاء (حبيبات من الخلايا) في جدار الأعور. إذا تعذر تصور الفقاعة ، فقد يشير ذلك إلى أن الأعور قد تم ثقبه وأن الخلايا قد انتهت في تجويف الأعور ، مما أدى إلى إزالتها من الأمعاء. - بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة ببطء من الأعور واضغط برفق على موقع الحقن باستخدام قضيب ذو رأس قطني ، لتجنب هروب الخلايا السرطانية وتقليل النزيف الخفيف.
- نظف الأعور بمحلول ملحي لإزالة أي حطام.
- أعد الأعور مرة أخرى إلى بطن.
- أغلق الصفاق باستخدام 5/0 غرز.
- أغلق جلد البطن باستخدام 5/0 غرز.
- تطبيق المضادات الحيوية اللاحقة للعمليات الجراحية (100 ملغ/ كغ أموكسيسيلين أو 20 ملغ/كغ من إينروفلوكساسين) والمسكنات (5 ملغ/مل ميتاكام/ميلوكسيكام) عن طريق الحقن تحت الجلد. ضع الفئران على وسادة تدفئة واحتفظ بها هناك حتى تتعافى تماما. ثم أعدهم إلى القفص مع الأخرى.
3. تقييم نمو الورم التقويمي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب
ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء التالي في منصة التصوير قبل السريري (PIP) من منشأة.
- تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح اللجنة الأخلاقية المؤسسية.
- البدء في مراقبة حجم الورم عن طريق μCT 2 أسابيع بعد حقن الخلايا ، وكل أسبوع بعد ذلك.
- قم بتخفيف عامل التباين iopamiro (300 مجم / مل) حديثا في محلول ملحي ، بنسبة 3: 1 لكلتا الجرعتين. تطبيق 300 مل من الإيوباميرو عن طريق التزويج الفموي.
ملاحظة: نظرا لضعف تباين الأنسجة الرخوة في μCT ، يوصى باستخدام عامل تباين لتحسين حساسية التقنية. يتضمن البروتوكول إعطاء فموي لعامل قائم على اليود (iopamiro) لتحديد عبء الورم داخل اللمعة ، وإدارة ثانوية داخل الصفاق لنفس العامل لتحديد عبء الورم في الوجه الحشوي للأمعاء. تم إجراء تجارب تجريبية سابقا لتحديد الوقت الدقيق الذي يحتاجه عامل التباين للوصول إلى الأعور للفئران قبل القضاء عليه. في حالة iopamiro ، فهو يقع في حوالي 2 ساعة. - بعد 2 ساعة، يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق بقيمة 300 مل من الإيوباميرو المخفف سابقا. تساعد الإدارة على تحديد حدود الورم في الوجه الجداري.
- تخدير باستخدام 2 ٪ إيزوفلوران.
- بعد التأكد من تخدير بشكل صحيح عن طريق الضغط على قدم الماوس ، ضع في سرير المسح في μCT. أفضل وضع هو ضعيف (الوجه لأعلى).
- في برنامج التحكم ، ابدأ الوضع المباشر (وضع التنظير الفلوري) لوضع منطقة البطن في مجال الرؤية (FOV) للماسح الضوئي. للقيام بذلك ، حرك السرير للأمام والخلف وبشكل جانبي حتى يتم تحقيق الموضع المطلوب. قم بتدوير أنبوب الأشعة السينية والكاشف 90 درجة ، وحرك سرير المسح في المحور ص لتوسيط تماما.
- استخدم المعلمات التالية لصور المسح الضوئي μCT: 30 مم FOV ، 26 ثانية من وقت الاستحواذ ، 90 كيلو فولت من الجهد الحالي ، و 200 μA من التيار الحالي ، باستخدام نظام تصوير FX μCT.
- أعد إلى أقفاصها للتعافي عند الانتهاء من الفحص. توفير الدعم الحراري ومراقبة حتى تتعافى من التخدير قبل العودة إلى السكن.
- ينتج عن اكتساب μCT ملف بحجم 250 ميجا بايت لكل فحص. تحتوي ملفات البيانات التي تم إنشاؤها على تنسيق VOX. من أجل جعلها في متناول أي برنامج تحليل التصوير ، قم بتحويل الملفات إلى تنسيق DICOM باستخدام برنامج إدارة قاعدة البيانات الخاص ب μCT. قم بتخزين مجموعة الملفات التي تم إنشاؤها في قرص ثابت محمول لتحليلها باستخدام أي جهاز كمبيوتر به برنامج تصوير متاح.
ملاحظة: أثناء تحليل الصور ، يتم تحديد الأعور كأمعاء متوسعة ذات محتوى إشعاعي كثيف (iopamiro) ، غالبا في الجانب الأيسر من البطن الذيلي. في الانثناء الحشوي للأعور ، لوحظ سماكة الجدار ، مقارنة بالمناطق المعوية المجاورة. سماكة يتوافق مع نمو الورم. - بمجرد تحديد موقع الورم ، ابحث عن أعلى قطر في طرق العرض المختلفة (محوري ، إكليلي ، وسهمي). قم بقياس هذه المحاور الثلاثة واحسب حجم الورم باتباع الصيغة الإهليلجية: الحجم = 4/3π x (نصف المحور x نصف المحور y × z-semiaxis) 10.
4. التدخل العلاجي في الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام
- مراقبة الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام أسبوعيا.
- عندما يتم الكشف عن إشارة فحص μCT للورم في معظم الفئران ، قم بإجراء فحص μCT آخر في الأسبوع التالي لتأكيد وجود الورم.
ملاحظة: يعتمد وقت بدء العلاج على نموذج PDX المستخدم ، ويختلف من 3-12 أسبوعا بعد تلقيح الخلايا السرطانية في الأعور. - التوزيع العشوائي للفئران في أربع مجموعات: مجموعة مركبة (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة أدوية اختبار (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة علاج كيميائي قياسية للرعاية (ن = 10-15 فئران) ، ومجموعة علاج مركب (ن = 10-15 فئران).
- عالج الفئران داخل الصفاق بمحلول ملحي (مجموعة مركبات) ، أو دواء الاختبار (20 مجم / كجم) (مجموعة أدوية الاختبار) ، أو إرينوتيكان (50 مجم / كجم) (مجموعة الرعاية القياسية) ، أو دواء الاختبار (20 مجم / كجم) باستخدام إرينوتيكان (50 مجم / كجم) (مجموعة العلاج المركب). أداء الإدارة مرة واحدة في الأسبوع حتى نهاية التجربة.
- راقب نمو الورم أسبوعيا عن طريق التصوير المقطعي المحوسب طوال فترة التجربة.
- في نهاية التجربة ، القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم وجمع الكبد والرئتين وأي آفات أخرى محتملة في الأعضاء الأخرى.
- قم بتضمين عينات الأنسجة في أشرطة واحتضانها في 4٪ فورمالين بين عشية وضحاها. استخدام أنسجة الأمعاء من الفأر دون ورم في الأعور كعنصر تحكم.
- إزالة الكاسيتات من الفورمالين واحتضان مع 70 ٪ من الإيثانول لمدة 3 ساعات على الأقل.
- قم بتضمين الكاسيت مع البارافين ، باستخدام البروتوكولات القياسية لمرفق التشريح المرضي.
- أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) من الأعور والكبد والرئة ، باستخدام البروتوكولات القياسية لمرفق التشريح المرضي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمت مراقبة الفئران المزروعة بشكل متعامد مع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض أسبوعيا عن طريق التصوير المقطعي المحوسب. في نهاية التجربة ، تم القتل الرحيم للحيوانات. تم جمع الأمعاء ، ceca (الشكل 1A ، B) ، الكبد ، الرئتين ، وأي آفة أخرى محتملة ، وإدراجها في شريط كاسيت ، وتثبيتها بنسبة 4٪ فورمالين بين عشية وضحاها. تم استخدام أنسجة الأمعاء من فأر بدون ورم في الأعور كعنصر تحكم (الشكل 1C). أخيرا ، تم تغيير الكاسيت إلى 70٪ إيثانول لمدة 3 ساعات على الأقل وتضمين البارافين. تم إجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E & E) من ceca والكبد والرئتين باستخدام البروتوكولات القياسية لمرفق التشريح المرضي لتحديد الخلايا السرطانية (الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4).
في تجربة أخرى ، تمت مراقبة الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام أسبوعيا. عندما تم الكشف عن إشارة مسح μCT للورم في معظم الفئران (حوالي 2-4 أسابيع ، اعتمادا على نموذج PDX) ، تم اختيار بشكل عشوائي في أربع مجموعات وعولجت إما بالمركبة ، أو دواء الاختبار (20 مجم / كجم) ، أو معيار العلاج الكيميائي للرعاية إرينوتيكان (50 مجم / كجم) ، أو عقار الاختبار باستخدام إرينوتيكان. تم إعطاء الأدوية داخل الصفاق مرة واحدة في الأسبوع حتى نهاية التجربة. تمت مراقبة نمو الورم أسبوعيا عن طريق التصوير المقطعي المحوسب طوال فترة التجربة. أشارت النتائج إلى أن عقار الاختبار أدى إلى تقليل حجم الورم ، محسوبا بواسطة صور مسح μCT ، وتم تعزيز ذلك بالاشتراك مع علاج إرينوتيكان (الشكل 5 والشكل 6).
أظهرت الدراسات السابقة في مختبرنا أن الإمكانات النقيلية (الورم السرطاني ، ورم خبيث في الرئة والكبد) لنماذج CRC-PDX التقويمية تعتمد على نموذج PDX المستخدم (الجدول 3) 2. في هذه الدراسة ، تم أيضا تقييم الفعالية العلاجية على تكوين ورم خبيث. أشارت النتائج إلى أن عقار الاختبار ، إرينوتيكان ، والجمع بين القضاء على تكوين ورم خبيث في الرئة والكبد في الفئران المعالجة (الجدول 4)11.
الشكل 1: صور عيانية لأمعاء الفئران التي تحمل أورام CRC-PDX التقويمية. صور الأمعاء العيانية من فأرين يحملان ورم PDX التقويمي (A ، B) في نهاية التجربة. يتم تعريف أورام الأعور باللون الأحمر في الصور. ج: صورة أمعائية لفأر بدون ورم في الأعور كعنصر تحكم. قضبان المقياس = 5 مم (أ ، ب) ؛ 1 سم (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور النسيجية لأورام تقويم العظام CRC-PDX. تلطيخ H&E لنموذج ورم PDX في الأعور في نهاية التجربة عند التكبير المنخفض (A) والعالي (A). يتم تعريف أورام الأعور باللون الأحمر في الصور. قضبان المقياس = 2.5 مم (أ) ؛ 100 مم (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصور النسيجية لورم خبيث في الرئة مشتق من تلطيخ ورم تقويم العظام CRC-PDX H&E للرئة من فأر يحمل ورم PDX تقويمي. يمكن ملاحظة ورم خبيث في الرئة عند التكبير المنخفض (A) والعالي (A). يتم تعريف النقائل الرئوية باللون الأحمر في الصور. قضبان المقياس = 250 مم (A) ؛ 100 مم (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور النسيجية لورم خبيث في الكبد مشتق من أورام CRC-PDX التقويمية. تلطيخ H&E للكبد من فأر يحمل ورم PDX تقويمي. يمكن ملاحظة ورم خبيث في الكبد عند التكبير المنخفض (A) والعالي (A). يتم تعريف النقائل الكبدية باللون الأحمر في الصور. يشار إلى أشرطة المقياس في الصور. قضبان المقياس = 500 مم (أ) ؛ 50 مم (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الفعالية العلاجية لعقار اختبار في نموذج تقويم العظام CRC-PDX. مثال على تجربة مع أربع مجموعات (مركبة ، اختبار المخدرات ، إرينوتيكان ، واختبار الدواء مع إرينوتيكان)11. يتم تمثيل حجم الورم الذي تم الحصول عليه من صور المسح بالأشعة المقطعية بمرور الوقت (A) وفي نهاية التجربة (اليوم 42) (B). الأشرطة ، ± SE (ن = 15-30) و * p < 0.05 ، ***p < 0.001 ، **** p < 0.0001 مقابل السيارة (اختبار t ، على الوجهين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور μCT من الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام CRC-PDX قيد العلاج. صور μCT تمثيلية للفئران التي تحمل أورام تقويم العظام المعالجة بدواء علاجي. يتم تعريف الأعور (الأحمر) وكتلة الورم (الأزرق) في الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: إنشاء PDX تحت الجلد. مثال على ثلاثة نماذج PDX تم إنشاؤها في المختبر (P1 و P2 و P3) من البنك الحيوي2 الخاص بنا لأكثر من 350 نموذجا PDX مع عدد الخلايا الملقحة ، وحدوث إنشاء PDX ، والممرات في الفئران. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: الكواشف لتحضير عوامل النمو (GF) MIX 10X ، و CoCSCM 6Ab بدون EGF ، FGF2 ، وعوامل النمو ، ووسط CoCSCM 6Ab الكامل ، ووسط الهضم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: الإمكانات النقيلية لنماذج CRC-PDX التقويمية. مثال على ثلاثة نماذج تقويم CRC-PDX تم إنشاؤها في المختبر (P1 و P2 و P3) من البنك الحيوي2. هنا ، يشار إلى عدد الخلايا الملقحة ، وحدوث تكوين ورم الأعور ، وحدوث ورم سرطاني ، ورم خبيث في الرئة ، أو ورم خبيث في الكبد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: الفعالية النقيلية العلاجية لعقار اختبار في نموذج تقويم العظام CRC-PDX. مثال على تجربة مع أربع مجموعات (مركبة ، اختبار المخدرات ، إرينوتيكان ، واختبار الدواء مع إرينوتيكان)11. هنا ، يشار إلى عدد الفئران في كل مجموعة وأي منها أصيب بسرطان سرطاني أو ورم خبيث في الرئة أو ورم خبيث في الكبد في نهاية التجربة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من العلاجات الجديدة المضادة للسرطان واختبارها في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم (CRC). على الرغم من أن النتائج الواعدة في النماذج قبل السريرية قد لوحظت في كثير من الحالات ، إلا أن الفعالية العلاجية في المرضى الذين يعانون من CRC النقيلي المتقدم كانت محدودة في كثير من الأحيان. لذلك ، هناك حاجة ملحة للنماذج قبل السريرية التي تسمح باختبار فعالية الأدوية العلاجية الجديدة في سيناريو النقيلي ذي الصلة سريريا.
تصف المخطوطة بالتفصيل نموذج PDX متقدم لتقويم CRC يعتمد على زرع الخلايا السرطانية للمريض في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة12.
المنهجية تستغرق وقتا طويلا وتتطلب التركيز. في المتوسط ، قد يستغرق حقن تجربة مع 30 فأرا حوالي 11 ساعة في المجموع ، بما في ذلك: 1) جمع ورم PDX (1 ساعة) ؛ معالجة الورم (4 ساعات) ؛ وزرع الأعور (6 ساعات). يجب إجراء العملية في ظروف معقمة ، مما يقلل من وقت معالجة الورم وحقنه ، مع التعامل مع الأعضاء الداخلية بعناية فائقة لتجنب الوفيات المرتبطة بالجراحة. لذلك يوصى بشدة بإجراء العديد من التجارب التجريبية باستخدام خطوط الخلايا السرطانية أو خلايا PDX ، لتدريب الباحثين وتعريفهم بالإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يشارك باحثان في الإجراء ، أحدهما لجمع الورم ومعالجته ، وكذلك المساعدة في خياطة ، والآخر لإجراء الجراحة الفعلية.
من المهم أيضا مراعاة أن أورام الأعور يمكن أن تنمو في تجويف الأمعاء أو داخل الأعور ، اعتمادا على نموذج PDX والموقع المحدد للحقن. من الصعب السيطرة على نتيجة نمو الورم ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على بقاء الفئران ، مما يؤدي إلى أورام أصغر وانسداد معوي حاد عندما تنمو الأورام داخل التجويف. لذلك يجب مراقبة الفئران أسبوعيا ، بدءا من الأسبوع التالي لزرع الخلايا. بمجرد أن تقدم معظم الفئران إشارة ورم عن طريق فحص μCT ، يجب استبعاد التي ليس لديها إشارة ، والباقي عشوائي في مجموعات تجريبية بناء على حجم الورم. للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية ، يجب أن تشمل كل مجموعة تجريبية 12-15 فئران.
تعد مراقبة الفئران الحاملة للورم أمرا ضروريا لتحديد فعالية العوامل العلاجية الجديدة في نماذج تقويم العظام ذات الصلة سريريا. تتيح فحوصات التصوير المقطعي المحوسب تحديد حجم الورم الأولي في الفئران وقياسه. يؤدي استخدام التباين المزدوج إلى زيادة حساسية تقنية μCT بشكل كبير ، مما يحسن جودة الصور8. يمكن أن يؤدي نمو الخلايا السرطانية في الأعور إلى أورام داخل اللمعة إذا نمت باتجاه تجويف الأمعاء ، أو أورام خارج اللمعة إذا نمت من تجويف الأمعاء. تمت ملاحظة كلا السيناريوهين مع المنهجية السابقة ، ويعتمدان على نموذج PDX المستخدم وموقع الحقن. تعافت الفئران تماما من المسح ، مع عدم وجود دليل سريري على تلف كلوي أو حوادث أخرى. تظهر النتائج أن التصوير المقطعي المحوسب يمكن أن يكون أداة مفيدة لمراقبة التطور والنمو الطولي لاتفاقية حقوق الطفل.
تلخص النماذج التقويمية بدقة CRC12 السريرية وهي مفيدة جدا لاختبار تأثير الأدوية العلاجية الجديدة على نمو الورم الأولي ونقائل الكبد والرئة 2,11. ومع ذلك ، قد لا يكفي بروتوكول مكتوب مفصل لمجموعة بحثية جديدة لإنشاء مثل هذه النماذج المعقدة. ردا على ذلك ، يهدف هذا الفيديو إلى توجيه مجموعات البحث لتنفيذ هذا الإجراء في أبحاثهم. يوضح إجراء زرع الخلايا في جدار الأعور للفئران التي تعاني من نقص المناعة ومنهجية مراقبة نمو الورم المعوي باستخدام التصوير المقطعي المحوسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
نحن نقدر مؤسسة Cellex وشبكة CIBERONC ومعهد الصحة كارلوس الثالث لدعمهم. علاوة على ذلك ، نشكر أيضا منصة التصوير قبل السريري في معهد فال ديبرون للأبحاث (VHIR) ، حيث تم إجراء التجارب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
