Summary
본 프로토콜은 유방 상피 세포에 관심 유전자를 전달하기 위해 젖꼭지를 통한 바이러스 벡터의 관내 주입을 설명합니다.
Abstract
마우스 유선은 상피 세포가 늘어서 있고 각 젖꼭지 끝에 하나의 구멍이 있는 관 나무로 구성됩니다. 상피 세포는 유선 기능에 중요한 역할을 하며 대부분의 유선 종양의 기원입니다. 관심 유전자를 마우스 유선 상피 세포에 도입하는 것은 상피 세포에서 유전자 기능을 평가하고 마우스 유방 종양 모델을 생성하는 데 중요한 단계입니다. 이 목표는 관심 유전자를 마우스 유관 나무에 운반하는 바이러스 벡터의 관내 주입을 통해 달성할 수 있습니다. 주입된 바이러스는 이후 유방 상피 세포를 감염시켜 관심 유전자를 가져옵니다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노바이러스 관련 바이러스 (AAV)일 수 있다. 이 연구는 바이러스 벡터의 마우스 유방 관내 주입을 통해 관심 유전자가 유방 상피 세포로 전달되는 방법을 보여줍니다. GFP 를 운반하는 렌티바이러스는 전달된 유전자의 안정적인 발현을 나타내는 데 사용되며, Erbb2 를 운반하는 레트로바이러스(HER2/Neu)는 종양유전자 유발 비정형 과형성 병변 및 유방 종양을 입증하는 데 사용됩니다.
Introduction
유선의 상피 세포는 이러한 땀샘의 기능에 중요한 역할을 하며 유방암의 주요 원인 세포입니다. 유선 생물학 및 종양 형성에 대한 연구는 종종 관심 유전자를 이러한 세포에 전달해야 합니다. 각 마우스 유선은 유두 끝에 단일 구멍이 있는 상피 세포가 늘어선 관 나무로 구성됩니다. 이러한 구조는 유방 상피 세포가 바이러스 벡터에 쉽게 접근할 수 있도록 하며, 이는 관내 주입을 통해 관 나무의 내강으로 전달될 수 있다1.
유방 관내 주사 기술은 원래 염소, 토끼, 쥐와 같은 훨씬 더 큰 동물에게 사용되었다1. 생쥐와 같은 훨씬 작은 동물의 경우 관 내 주사에는 많은 섬세한 도구와 작업자의 더 많은 관행이 필요합니다. 마우스 관내 주입에는 두 가지 접근법이 있습니다. 하나는 up-the-teat injection1입니다. 또 다른 하나는 외과적 노출 후 #3 또는 #4 유선의 1차 덕트를 직접 주입하는 것입니다1. 첫 번째 기술은 비침습적이고 작업자가 잘 훈련되면 더 빠르기 때문에 이 기술이 더 일반적으로 사용되며 이 기사에서 자세히 설명합니다.
미세주입을 통해 수정란의 단계에서 관심의 유전자가 도입되는 널리 사용되는 전통적인 형질전환 마우스 모델과 비교하여2,3,4, 관내 바이러스 주입 방법을 통한 유전자 전달은 다음을 포함하는 많은 이점을 갖는다: (1) 관심있는 각 유전자에 대해 형질전환 마우스 라인을 만드는 시간 소모적인 과정을 피한다; (2) 관심 유전자에 의해 부과 된 유방 땀샘의 정상적인 발달에 대한 잠재적 손상을 피한다. (3) 출생 후 원하는 시간에 관심 유전자를 도입합니다. (4) 하나 이상의 관심 유전자를 쉽게 공동 도입할 수 있습니다. (5) 감염된 종양 유전자 운반 세포가 정상 세포로 둘러싸여 있기 때문에 자연 종양 형성 과정을 더 잘 모방합니다. (6) TVA(종양 바이러스 A, 조류 세포 표면 단백질 및 레트로바이러스 RCAS 벡터에 대한 수용체) 기술5와 조합하여, 관심 유전자를 특정 세포 집단에 도입하여 종양 형성의 세포 기원을 연구하고 유선에서 세포 계통 추적 분석을 수행할 수 있습니다 6,7,8, 9입니다.
레트로바이러스 10, 렌티바이러스 11,12, 아데노바이러스 13 및 아데노바이러스 관련 바이러스(AAV)14로부터 유래된 임의의 벡터는 유전 물질의 관내 전달에 사용될 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 숙주 게놈에 영구적으로 통합됩니다. 따라서 그들은 관심 유전자를 유방 상피 세포에 안정적으로 도입합니다. 렌티바이러스는 마주치는 모든 세포의 게놈에 통합될 수 있지만15), 레트로바이러스의 효율적인 게놈 통합은 표적 세포의 증식을 필요로 한다16. 아데노바이러스 및 AAV 벡터는 감염된 세포의 게놈에 통합되지 않으므로 관심 유전자를 일시적으로 발현합니다17,18. 이 특징은 관심 유전자가 플록싱된 종양 억제 유전자를 삭제하기 위해 Cre와 같이 짧은 시간 동안만 발현되어야 할 때 이점이 될 수 있습니다.
렌티바이러스, 아데노바이러스 및 AAV는 만나는 모든 마우스 세포를 감염시킵니다. 그러나 내강 상피는 기저막에 의해 간질과 더 분리된 기저층으로부터 크게 절연되어 있기 때문에 관내 주사는 감염을 주로 유방암의 기원 세포인 내강 상피 세포로 제한합니다. 이 내강 상피층 내에는 줄기 세포, 전구 세포 및 여러 분화 세포 그룹을 포함한 별개의 세포 아형도 있습니다. 내강 세포 집단 내의 특정 세포 하위세트를 감염시키기 위해, TVA 기술이 사용될 수 있으며, 이 기술과 함께 조류 백혈병 바이러스-유래 RCAS 벡터(5,10) 또는 슈도타입 렌티바이러스 벡터(11)는 줄기 세포(6) 또는 특정 전구체(6)에서만 활성인 프로모터와 같은 세포 유형-특이적 프로모터의 제어하에 tva 도입유전자를 운반하는 마우스에서 TVA를 발현하는 세포를 선택적으로 감염시킨다. 7 또는 폐포 세포(8) 또는 Wnt-경로 활성 세포(9).
이 프로토콜은 바이러스 벡터의 관내 주입을 통해 관심 유전자를 유선 상피 세포에 도입하는 기술을 제시합니다. 도입 된 유전자의 발현 및 결과적인 증식 병변 및 종양의 검출이 입증된다.
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Protocol
마우스를 사용한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 본 연구에서는 9-12주령 FVB/N 또는 MMTV-tva 암컷 마우스를 사용했습니다. 마우스는 상업적으로 또는 자체 제작하여 입수하였다 (재료 표 참조). Lenti-EGFP(FUCGW) 및 RCAS-Erbb2(Neu) 바이러스가 사용되었습니다. 바이러스 준비 및 역가 결정은 이전에 발표된 보고서10,12에 따라 수행되었습니다.
1. 주사기 준비
- 33G 금속 허브 바늘( 재료 표 참조)을 약 1cm 길이로 자릅니다. 오토클레이빙 후 바늘과 50μL 주사기를 70% 알코올에 보관합니다.
- 알코올에서 주사기와 바늘을 꺼냅니다. 주사기와 바늘에서 남은 알코올을 밀어냅니다. 고압 증기 멸균 흡수성 벤치 패드에서 공기 건조를 위해 주사기를 분해합니다.
- 건조 후 주사기를 조립하십시오.
2. 바이러스 준비
- -80°C 냉동고에서 필요에 따라 하나 또는 여러 개의 바이러스 스톡 튜브를 꺼내 얼음에서 바이러스를 해동합니다.
참고: 감염될 세포의 수에 따라 현재 1x PBS를 사용하여 바이러스를 의도한 역가로 희석해야 할 수도 있습니다. - 피펫 팁을 브로모페놀 블루 분말에 1cm 깊이까지 담가서 브로모페놀 블루를 추가합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 부착 된 미량의 브로 모 페놀 블루를 바이러스 현탁액에 가져옵니다.
참고: 본 연구의 경우 바이러스 스톡은 일반적으로 튜브당 200μL이므로 최종 염료 농도는 약 0.2%(0.2μg/100μL)입니다. 브로 모 페놀 블루는 1250W의 고출력에서 45 초 동안 마이크로파 방사선으로 멸균해야합니다 (재료 표 참조). 무균 환경에서 전체 절차를 수행해야 합니다. - 브로모페놀 블루를 바이러스 용액과 혼합하여 위아래로 10회 피펫팅합니다.
- 바이러스를 얼음 위에 놓고 얼음 양동이를 동물 사육장으로 가져옵니다.
3. 동물 준비
- 2μL/g의 마취제(37.6mg/mL 케타민, 1.92mg/mL 자일라진 및 0.38mg/mL 아세프로마진)를 복강내 주사하여 암컷 마우스 를 마취합니다. 발가락 꼬집음으로 마취의 깊이를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오.
알림: 마우스는 좋은 마취 상태에서 발가락 꼬집음에 반응하지 않아야 합니다. 이소플루란은 또한 마우스를 마취시키는데 사용될 수 있다. - 마우스를 따뜻한 패드에 앙와위 자세로 놓고 접착 테이프를 사용하여 네 팔다리를 모두 벤치에 부착합니다.
- 주입할 하나의 젖꼭지(또는 그 이상)를 식별합니다(본 연구에서는 4번이 선호됨). 가위로 주위의 머리카락을 다듬어 노출시킵니다.
- 70% 알코올과 요오드포어 면봉을 젖꼭지 부위에 3회씩 바르고 젖꼭지를 청소하고 노출시킵니다.
4. 바이러스의 관내 주입
알림: 돋보기amp 젖꼭지 입구를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 돋보기 램프 아래에 작은 중앙 덕트 구멍이 보일 때까지 한 쌍의 멸균 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 젖꼭지의 말단 끝을 절개합니다( 재료 표 참조).
- 10 μL의 바이러스/브로모페놀 블루 혼합물을 주사기에 넣습니다.
참고: 이 데모에서는 Lenti-EGFP (FUCGW) 및 RCAS-Erbb2(Neu) 가 사용됩니다. - 돋보기 램프를 사용하여 바늘을 젖꼭지 구멍에 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘의 방향은 주 덕트와 정렬되도록 내측에서 외측으로 약간 조정됩니다.
- 전체 10 μL의 바이러스를 덕트 트리에 주입합니다.
알림: 주사가 성공하면 피부 아래의 덕트가 파란색으로 변해야 합니다. 저항 또는 국부적 인 색상 변화의 출현은 주입 실패를 나타냅니다. - 마우스가 완전히 깨어날 때까지(~30-60분) 45°C로 설정된 슬라이드 워머에 마우스를 올려 놓습니다.
5. 형광 실체 현미경에 의한 감염된 세포 검출
- GFP 또는 기타 형광 유전자를 운반하는 바이러스를 주사한 후 3-5일 후에 4uL/g의 마취제(37.6mg/mL 케타민, 1.92mg/mL 자일라진 및 0.38mg/mL 아세프로마진)를 과다 투여하여 마우스를 안락사시킵니다.
- 흉강을 엽니 다. 복부 중간 선을 따라 피부와 가위를 사용하여하지를 따라 피부를 자릅니다. 피부를 들어 올리고 유방 땀샘을 노출시킵니다.
- 집게와 가위를 사용하여 피부에서 주입 된 유선을 제거하십시오. 또한 주입되지 않은 샘을 대조군으로 제거하십시오.
- 유방 땀샘을 유리 슬라이드에 놓고 땀샘을 원래 모양으로 펼칩니다.
- 형광 실체 현미경으로 땀샘을 관찰하고 이미지화합니다.
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Representative Results
성공적인 관내 주사, 성공적인 바이러스 감염 및 전달된 유전자가 유방 종양 형성에 미치는 영향을 입증하기 위해 대표적인 데이터가 여기에 제시됩니다. 주입되는 바이러스의 양은 각 실험의 목적에 맞게 조정되어야 합니다. 유선 나무가 얼마나 광범위하게 감염될 수 있는지 설명하기 위해 GFP와 같이 이미지화할 수 있는 많은 양의 바이러스 운반 유전자를 사용해야 합니다. 반면에, 자연적인 자발적인 종양 형성을 모방하기 위해, 종양 유전자를 운반하는 소량의 바이러스를 사용하여 소수의 세포만 감염되고 전암성 병변으로 진화하고 결국에는 완전히 정상적인 유선의 영역에서 침윤성 암으로 진화해야 합니다.
관내 주사의 성공은 유선을 노출시키고 푸른 관 나무를 관찰함으로써 즉시 확인할 수 있습니다 (그림 1). Lenti-EGFP(FUCGW) 바이러스(~106 IUs)12 주사 후 2-5일 후, 유방 상피 세포 감염은 전체 마운트 제제 후 형광 실체현미경으로 관찰하여 평가할 수 있습니다(그림 2). 대안적으로, 바이러스 6,7,19에 의해 생성된 형광 단백질 또는 세포 표면 마커의 유세포 분석을 위해, 감염된 땀샘 및 감염되지 않은 땀샘(음성 대조군으로서)을 수집하여 단일 세포 현탁액으로 처리하여 바이러스 감염률을 추정할 수 있습니다(그림 3). 바이러스 감염을 테스트/정량화하는 또 다른 방법은 4% 파라포름알데히드(또는 포르말린)를 사용하여 감염된 대조군과 감염되지 않은 대조군 땀샘을 고정하고, 파라핀 내장 블록으로 처리하고, 바이러스로 생성된 유전자 산물 및 에피토프 태그(예: HA 및 FLAG20,21)에 대한 결과 섹션을 염색하는 것입니다.
바이러스에 감염된 세포가 확장되어 전암성 병변을 형성한 다음 종양을 형성하는지 여부는 전달된 종양유전자의 효능과 주입된 바이러스의 양에 따라 다릅니다. PyMT 및 활성화된 RAS와 같은 강력한 종양유전자의 경우, 초기 병변이 며칠 내에 형성되고, 종양이 몇 주 내에 나타난다10 (Bu et al., 미공개 관찰). 활성화된 ERBB2는 몇 주 안에 전암성 병변을 일으키고몇 달 안에 종양을 유발하는 반면(그림 4), 활성화된 PIK3CA는 약 5개월24의 중간 잠복기를 갖는 종양을 유발합니다. 반면에, Wnt1은 종양을 다소 느리게 일으킨다: 감염된 마우스의 약 20%만이 20개월 후에 종양을 발생시켰다21.
그림 1: 성공적으로 주입된 유관 나무. 이미지는 9주 된 FVB/N 암컷 마우스의 4번 유선을 관내 주사한 직후에 캡처되었습니다. 화살표는 숫자 4 젖꼭지의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 입체현미경에 의한 감염된 세포 검출. (A) 주입되지 않은 반대쪽 샘이 대조군으로 사용됩니다. (B) 형광 실체현미경으로 촬영한 이미지는 감염된 유선나무를 보여줍니다. 10주 된 FVB/N 마우스의 3번 유선에 Lenti-EGFP(FUCGW) 바이러스(~106 IU)를 관내 주사했습니다. 주입된 유선은 주사 5일 후에 채취하였다. 스케일 바: 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 렌티바이러스에 의해 생성된 EGFP에 대한 유세포 분석을 통한 감염된 세포 정량화. 피코에리트린(PE) 채널은 자동 형광 신호를 밝히는 데 사용되었습니다. 반대쪽 주사되지 않은 유선을 음성 대조군으로 사용했습니다. 12주령 FVB/N 암컷 마우스에서 주입된 유선은 Lenti-EGFP(~106 IU/gland)의 관내 주사 후 2.5일 후에 수집되어 단일 세포 현탁액으로 처리되었습니다. 이어서, 단세포 현탁액을 유세포 분석기로 분석하여 GFP 양성 세포를 검출하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 초기 병변 및 종양에서 바이러스 발현 종양유전자 산물의 면역조직화학적 확인. (A) MMTV-tva 마우스에 106 IU의 RCAS-Neu(HA)를 관내 주사한 후 14일 후에 초기 병변 함유 #4 유선을 수집했습니다. HA 태그를 검출하기 위해 면역조직화학적 염색을 사용하였다. (B) 10 4 IU의 RCAS-Neu (HA)를 MMTV-tva 마우스의 #4 샘에 관내 주사 한 지 1 년 후에 종양을 수집했습니다. 주사시 마우스 연령 : 12 주. 스케일 바: 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사는 산발성 유방암을 모델링하기 위해 마우스 유방 상피 세포에 유전자를 도입하기 위한 바이러스 관내 주입 기술을 보여줍니다. 일반적으로 적어도 5 주 이상의 마우스를 주사하여 유선이 발달 한 후 발암 과정이 시작됩니다. 게다가, 생후 5주 미만의 쥐의 젖꼭지 입구는 종종 주사하기에는 너무 작습니다. 반면에, 아주 오래된 생쥐의 젖꼭지는 때때로 퇴화되고, 절개는 관 개구부를 드러내지 못할 수 있습니다. 또한 일부 형질전환 또는 녹아웃 종양 모델의 젖꼭지는 생식계열 유전적 돌연변이로 인한 비정상적인 유방 발달로 인해 주입이 어려울 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
바이러스를 다룰 때 표준 개인 보호 장비(PPE)를 사용하는 것 외에도 실험자의 손에 우발적인 바늘에 쏘이지 않도록 주의해야 합니다. 조류 백혈병 바이러스가 인간을 감염시킨다는 증거는 없지만 설치류의 암 모델링에 사용되는 렌티바이러스는 인간도 감염시킬 수 있습니다. 우발적 감염으로부터의 이러한 보호는 바이러스가 강력한 종양 유전자를 가지고 있을 때 특히 중요하다25.
관심 있는 여러 유전자를 상피 세포로 전달해야 하는 경우 각 개별 유전자를 운반하는 서로 다른 벡터의 혼합물 또는 테스트할 모든 유전자를 운반하도록 설계된 벡터에 의해 전달될 수 있습니다. 전자의 방법은 이전에 생성된 바이러스를 이용할 수 있지만 동시 감염은 감염된 집단의 작은 하위 집합에서만 발생합니다. 반면에 후자의 접근 방식은 종종 새로운 바이러스를 구축해야하지만 동시 감염이 보장됩니다.
유전자 조작 마우스 모델(GEMM)과 비교하여 관내 주입 기술은 관심 유전자를 유선 상피 세포에 전달할 수 있는 더 나은 시공간 유연성을 제공합니다. 이러한 유연성은 대부분의 유방암이 성인기에 유전적 변화를 겪는 체세포에서 발생하기 때문에 환자의 종양 형성을 더 잘 모방하는 데 도움이 됩니다5. 시공간 제어는 또한 유방 종양 형성에 대한 세포 아형의 기여를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다 6,7,9,26,27,28.
관내 주입 기술은 주로 바이러스 벡터를 사용하여 인공 프로모터에 의해 구동되는 외인성 유전자를 전달하는 데 사용되었습니다. 종양 유전자가 이러한 방식으로 전달되면 그 전사는 자연적으로 돌연변이 된 내인성 원발 종양 유전자의 전사와 다릅니다. 그리고 이 차이는 이후에 암 형성, 진행 및 치료에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 우려를 극복하기 위해, CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 구성 요소를 운반하는 벡터를 사용하여 관심 있는 내인성 유전자를 편집할 수 있다 29,30. 우리는 최근에 이 전략을 개선하여 매우 유연하고 효율적으로 만들었습니다(Bu et al., 미공개 결과). 유전자 편집의 이러한 진전은 관내 주입 기술을 암 모델링을 위한 훨씬 더 강력한 도구로 만듭니다.
결론적으로, 바이러스 벡터의 관내 주입은 인간 유방암 형성을 밀접하게 모방하는 유방암의 마우스 모델을 생성하는 강력한 기술입니다. 이 기술과 TVA 기술 및 CRISPR 편집의 결합은 유방암 형성을 이해하는 데 있어 이 다재다능한 방법에 대한 더 많은 잠재력을 발휘합니다. 이 모델은 또한 유방암 예방의 새로운 전략을 테스트하는 데 유용한 리소스를 제공합니다.
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Disclosures
두 저자 모두 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 원고에 대한 도움이 되는 의견을 주신 Dr. Gary Chamness에게 감사드립니다. 이 작업은 국방부 (DOD) CDMRP BC191649 (YL) 및 BC191646 (YL)과 국립 보건원 (NIH) CA271498 (YL)의 지원을 받았습니다. 저자는 SPORE P50CA186784가 지원하는 유방 센터 병리학 핵심 시설과 Joel M. Sederstrom의 도움을 받아 CPRIT-RP180672, NIH CA125123 및 RR024574가 지원하는 세포 분석 및 세포 분류 코어에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
References
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