Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65145
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Summary

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Abstract

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Introduction

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами1. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопротеином (апо), таким как апоА-I. В метаболизме липопротеинов человека циркулирующие зарождающиеся ЛПВП накапливают липиды из периферических клеток и созревают в сферические ЛПВП в процессе, который зависит от ключевых белковых медиаторов, включая кассетный транспортер A1, связывающий АТФ, и лецитин: холестерин ацилтрансферс2. Этот процесс представляет собой важнейший компонент обратного пути транспорта холестерина, который считается защитным от сердечных заболеваний. Вооружившись этими знаниями и способностью восстанавливать дискоидальные ЛПВП, исследователи использовали эти частицы в качестве терапевтического вмешательства для лечения атеросклероза3. По сути, вливание восстановленного ЛПВП (рЛПВП) пациентам способствует оттоку холестерина из отложений бляшек и возвращает его в печень для превращения в желчные кислоты и выведения из организма. Несколько биотехнологических/фармацевтических компаний придерживаются этой стратегии лечения4.

В то же время способность генерировать эти частицы в лаборатории вызвала шквал исследовательской деятельности, которая привела к новым приложениям и новым технологиям. Одно из известных применений включает использование частиц рЛПВП в качестве миниатюрной мембраны для размещения трансмембранных белков в нативной среде5. На сегодняшний день сотни белков были успешно включены в дискоидальный рЛПВП, и исследования показали, что эти белки сохраняют как нативную конформацию, так и биологическую активность в качестве рецепторов, ферментов, транспортеров и т. д. Также было показано, что эти частицы, называемые «нанодисками», поддаются структурной характеристике, часто с высоким разрешением6. Этот подход к исследованиям трансмембранных белков признан превосходящим исследования с моющими мицеллами или липосомами и, как следствие, быстро развивается. Важно признать, что сообщалось о двух различных методах, способных формировать рЛПВП. Метод «холатного диализа»13 популярен для применений, связанных с включением трансмембранных белков в бислой5 рЛПВП. По существу, этот способ приготовления включает смешивание двухслойного фосфолипида, белка каркаса и трансмембранного белка, представляющего интерес, в буфере, содержащем детергент холат натрия (или дезоксихолат натрия; молекулярная масса мицеллы [MW] 4,200 Да). Моющее средство эффективно растворяет различные компоненты реакции, позволяя диализовать образец против буфера, в котором отсутствует моющее средство. На этапе диализа, когда моющее средство удаляется из образца, спонтанно образуется рЛПВП. Когда этот подход используется для захвата интересующего трансмембранного белка, частицы продукта были названы нанодисками5. Однако попытки использовать этот метод для включения низкомолекулярных гидрофобных биологически активных агентов (MW <1000 Da) были в значительной степени безуспешными. В отличие от трансмембранных белков, низкомолекулярные биологически активные агенты способны выходить из диализного мешка вместе с детергентом, что значительно снижает эффективность их включения в рЛПВП. Эта проблема была решена путем исключения моющих средств из рецептурной смеси14. Вместо этого компоненты добавляют в водный буфер последовательно, начиная с бислоя, образующего липид, образуя стабильный биологически активный агент, содержащий рЛПВП, называемый нанодиском. Другие использовали рЛПВП для включения и транспортировки агентов визуализации in vivo 7. Совсем недавно специализированные рЛПВП, состоящие из каркаса аполипопротеина и анионного глицерофосфолипида, кардиолипина, использовались в исследованиях связывания лигандов. Эти частицы обеспечивают платформу для исследований взаимодействия кардиолипина с различными водорастворимыми лигандами, включая кальций, цитохром с и противоопухолевый агент доксорубицин8.

Основное внимание в настоящем исследовании уделяется составлению рЛПВП, которые обладают стабильно включенным гидрофобным биологически активным агентом (т.е. нанодиском). Способность этих агентов интегрироваться в липидную среду дискоидальных частиц рЛПВП эффективно придает им растворимость в воде. Таким образом, нанодиски имеют потенциал для терапевтического применения in vivo . При разработке нанодисков требуются определенные условия инкубации/реакции для успешного включения дискретных гидрофобных биологически активных агентов в частицу продукта, и целью этого отчета является предоставление подробной практической информации, которая может быть использована в качестве основополагающего шаблона для создания новых частиц нанодисков для конкретных применений. Таким образом, в контексте данной рукописи термины «нанодиск» и «нанодиск» не являются взаимозаменяемыми. В то время как нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для содержания трансмембранного белка, встроенного в его липидный бислой5, термин нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для включения низкомолекулярных (< 1000 Да) гидрофобных биологически активных агентов, таких как амфотерицин В14.

Существует множество методов получения подходящих белков каркаса. Можно приобрести каркасные белки у производителей [например, apoA-I (SRP4693) или apoE4 (A3234)], однако стоимость может быть ограничивающим фактором. Предпочтительным подходом является экспрессия рекомбинантных белков каркаса в Escherichia coli. Опубликованы протоколы для человека apoA-I9, apoE410, а также белка гемолимфы насекомых аполипофорина-III11. Для целей экспериментов, описанных в настоящем описании, использовали рекомбинантный N-концевой (NT) домен человека apoE4 (аминокислоты 1-183). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий apoE4-NT, была синтезирована и вставлена в вектор экспрессии pET-22b (+), непосредственно примыкающий к векторно-кодируемой лидерной последовательности pelB. Эта конструкция приводит к экспрессии белка слияния лидерной последовательности pelB - apoE4-NT. После синтеза белка бактериальная лидерная последовательность pelB направляет вновь синтезированный белок в периплазматическое пространство, где пептидаза-лидер расщепляет последовательность pelB. Полученный белок apoE4-NT без меток последовательности или хвостов впоследствии ускользает от бактерий и накапливается в питательной среде11,12, упрощая последующую обработку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса

  1. Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NT
    1. Разморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин.
    2. Как только весь лед растает, аккуратно и осторожно перемешайте пипеткой 50 мкл клеток в трансформационную пробирку на льду.
    3. Добавьте в клеточную смесь 5 мкл, содержащих 50 нг плазмидной ДНК (последовательность см. в дополнительной таблице 1). Осторожно переверните тюбик четыре или пять раз, чтобы перемешать. Не вихревые.
    4. Поместите смесь на лед на 30 минут.
    5. Тепловой шок смеси при температуре ровно 42 °C в течение 10 с.
    6. Выложить на лед на 5 минут.
    7. Пипетка 950 мкл среды S.O.C. в пробирку при комнатной температуре.
    8. Поместите пробирку в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C на 60 минут с колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    9. Тщательно перемешайте клетки, щелкнув и инвертировав, затем нанесите 100 мкл клеточного раствора на 20 мл бульона Лурия + агар, обработанную ампициллином в концентрации 0,1 мг / мл.
    10. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 ° C или до тех пор, пока не вырастут видимые колонии.
  2. С помощью электронного пипеттора перенесите 25 мл стерильной среды NZCYM в стерильную коническую колбу объемом 250 мл при комнатной температуре и добавьте ампициллин до конечной рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
  3. Используя стерильную инокуляционную петлю, перенесите одну отдельную колонию из отборочной пластины, содержащей соответствующим образом преобразованный бактериальный штамм, и добавьте непосредственно в колбу, содержащую 25 мл среды NZCYM + ампициллин.
  4. Поместите 25 мл колбы с семенной культурой NZCYM в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C с орбитальными колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выращивать эту семенную культуру в течение ночи до достижения подходящей бактериальной концентрации (~ 1,5-2,0 единицы оптической плотности), измеренной с помощью спектрофотометра, установленного на длину волны = 600 нм.
  5. Перелейте 250 мл стерильной среды NZCYM в четыре флаконы по 1 л и добавьте антибиотик ампициллин до рабочей концентрации 0,1 мг/мл.
  6. В стерильных условиях перенесите 5 мл насыщенной семенной культуры в каждую из четырех колб объемом 250 мл и поместите в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C с орбитальными колебаниями, установленными на 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе культура будет называться культурой расширения, и экспоненциальный рост будет контролироваться с помощью спектрофотометра UV1800. Рост допускается до тех пор, пока оптическая плотность культивирования при 600 нм (OD600) не достигнет значения в пределах 0,6-0,8.
  7. После того, как культура расширения достигла желаемого значения OD600 0,6-0,8, добавьте 59,6 мг изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в каждую 250 мл культуры, содержащей колбу, для конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать экспрессию белка. На этом этапе язык и региональные параметры расширения называются языком и региональными параметрами выражения. Начинают сцеживание в течение 5 часов.
  8. В конце 5-часового периода экспрессии извлеките четыре колбы из встряхивающего инкубатора и разлейте пипеткой 125 мл в шесть центрифужных флаконов по 250 мл (всего 750 мл).
  9. Сбалансируйте каждую бутылку центрифуги, чтобы убедиться, что общая масса находится в пределах ±0,5 мг друг от друга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для обеспечения безопасной работы центрифужного устройства.
  10. Подготовьте центрифужное устройство, сначала переведя выключатель питания во включенное положение. Нажмите кнопку с надписью «Set/Actual» и отрегулируйте параметры на «JA-14», «9 400 x g», 20,00 мин и 4 °C с помощью соответствующих циферблатов.
  11. Загрузите шесть сбалансированных бутылок центрифуги в ротор центрифуги соответствующего размера и поместите в центрифугу, обеспечив соблюдение любых конкретных параметров безопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте этот шаг до тех пор, пока вся культура бактериальных клеток не будет центрифугирована и супернатанты не будут собраны.
  12. Отфильтруйте изолированную бактериальную надосадочную жидкость с помощью вакуумной фильтрации или аналогичного устройства, оснащенного фильтром 0,45 микрона, для удаления остатков мусора.
  13. Гепариновая очистка рекомбинантного белка-каркаса apoE4-NT
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура очистки колонны проводится при комнатной температуре.
    1. Уравновесьте колонку гепарина Hi-trap, применив 10 объемов колонки (50 мл) 10 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7,2 и элюируя со скоростью 5 мл / мин.
    2. Наносите среду, обогащенную апоЕ4-НТ, на колонку со скоростью 2,5 мл/мин до тех пор, пока не будет нанесен весь объем среды объемом 1 л, и откажитесь от проточной среды.
    3. Промойте колонку 10 объемами колонны (50 мл) 10 мМ натрий-фосфатного буфера с pH 7,2 и выбросьте проточный.
    4. Элютируют желаемый белок apoE4-NT, применяя три объема колонки (15 мл) элюирующего буфера (10 мМ буфер фосфата натрия + 1,5 М NaCl, рН 7,2) в колонку и собирают элюат.
  14. Диализ элюата apoE4-NT
    1. Подготовьте секцию диализной трубки (размеры используемой диализной трубки составляли 22 см в длину, внутренний диаметр 12 мм и 10 000 MWCO) путем тщательного замачивания в дистиллированной деионизированной воде (ddi) в течение 10 минут.
    2. Приготовьте 1 л фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) (10 мМ фосфата натрия + 150 мМ NaCl, pH 7,2) в пластиковом стакане объемом 1 л или эквиваленте.
    3. Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, убедившись, что зажим надежно закреплен и жидкость не может выйти.
    4. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и налейте 15 мл элюата apoE4-NT в диализную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе обязательно проверьте наличие утечек.
    5. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.
    6. Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий 1 л буфера PBS.
    7. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и отрегулируйте регулятор перемешивания на «низкий», чтобы не образовывался вихрь.
    8. После завершения диализа декантируйте ретентат в коническую пробирку объемом 50 мл и храните при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить диализ при температуре 4 °C в течение ночи.

2. Рецептура биологически активного вещества, содержащего нанодиски

  1. Препарат фосфолипида аликвоты
    1. Взвесьте 5 мг соответствующего фосфолипида (например,.димиристоилфосфатидилхолин [DMPC]) и переложите в стеклянную пробирку.
    2. Растворите 5 мг фосфолипида, добавив 300 мклCHCl 3 и 100 мкл CH 3 OH для общего соотношения3: 1 об. / об.
    3. Выпарить органический растворитель, поместив стеклянную пробирку под слабую струю газа N2 на 10-15 мин, так что вдоль стенок нижней части пробирки образуется тонкая пленка высушенного фосфолипида.
  2. Лиофилизация фосфолипидных аликвот
    1. Подготовьте фосфолипидные аликвоты для лиофилизации, накрыв отверстие стеклянной пробирки парапленкой.
    2. Перфорируйте парапленку с помощью иглы 24 G примерно 10-15 раз.
    3. Поместите перфорированные аликвоты в соответствующий контейнер для лиофилизации и убедитесь, что резиновая крышка правильно закрыта.
    4. Прикрепите контейнер для лиофилизации к вакуумному коллектору, расположенному в верхней части лиофилизационного аппарата, и убедитесь, что все остальные клапаны плотно закрыты.
    5. Включите лиофилизационный аппарат, щелкнув выключателем питания и нажав кнопку инициализации вакуума.
    6. После того, как система достигнет полного вакуума, нажмите кнопку инициализации охлаждения, чтобы начать процесс сублимационной сушки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы образцы были лиофилизированы в течение ночи.
  3. Рецептура нанодисков амфотерицина-В (амп-В)
    1. Пипеткой 0,45 мл PBS к лиофилизированному фосфолипиду аликвоте и вихрю в течение ~ 30 с для диспергирования липида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный образец будет выглядеть непрозрачным и мутным.
    2. Пипетка 50 мкл 20 мг/мл исходного раствора ампВ (20 мг ампВ, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида [ДМСО], хранящегося при -20 °С в закрытом янтарном сосуде) в дисперсный образец фосфолипидов и вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе растворителя для использования при приготовлении исходного раствора гидрофобного биологически активного агента необходимо учитывать два основных соображения: 1) растворимость биологически активного агента и 2) смешиваемость растворителя с водным буфером, используемым в составе. В то время как часто используется ДМСО 15,16,17,18,19, диметилформамид 20,21 или тетрагидрофуран 22 также успешно используются 23.
    3. Пипеткой 0,5 мл каркасного белка apoE4-NT (концентрация ~4 мг/мл) в стеклянную пробирку, содержащую дисперсный фосфолипид и ампВ. Конечный объем образца должен составлять примерно 1 мл.
    4. Ванну обрабатывают ультразвуком при 24 °C до тех пор, пока раствор не осветлится (обычно 10-15 мин).
  4. Нанодисковое центрифугирование
    1. Перенесите осветленный раствор ampB-нанодиска в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
    2. Поместите трубку в ротор настольной микроцентрифуги с добавлением балансировочной трубки, расположенной прямо напротив.
    3. Затяните крышку ротора и закройте крышку центрифуги.
    4. Запрограммируйте центрифугу на вращение в течение 10 минут при ~ 11 000 x g с помощью соответствующих циферблатов, расположенных на передней панели микроцентрифужного блока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент может быть видна гранула. Эта гранула состоит из неинкорпорированного фосфолипида и/или ампВ.
    5. Извлеките надосадочную жидкость и перенесите ее в другую чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
  5. Диализ образца ampB-нанодиска
    1. Подготовьте секцию диализной трубки (размеры используемой диализной трубки составляли 3 см в длину, внутренний диаметр 16 мм и 10 000 MWCO), тщательно замочив в воде ddi в течение 10 минут.
    2. Приготовьте буферный раствор PBS объемом 1 л (10 мМ фосфата натрия + 150 мМ NaCl, pH 7,2) в пластиковом стакане объемом 1 л или аналогичном.
    3. Используя зажим для диализной трубки, зажмите один конец пропитанной диализной трубки, убедившись, что зажим надежно закреплен и жидкость не может выйти.
    4. Вставьте воронку с узким горлышком в открытый конец диализной трубки и перенесите образец ампВ-нанодиска в диализную трубку.
    5. Снимите воронку и зажмите конец диализной трубки другим зажимом для диализной трубки.
    6. Поместите поплавок для пенного диализа на один из герметичных концов диализной трубки и поместите собранную диализную трубку в стакан, содержащий 1 л буфера PBS.
    7. Поместите магнитную мешалку в нижнюю часть стакана и отрегулируйте регулятор перемешивания на «низкий», чтобы не образовывался вихрь. Дайте диализу продолжаться в течение ночи при 4 ° C.

3. Спектральный анализ образцов ампВ-нанодисков

  1. Инициализация спектрофотометра с последующим автоматическим гашением
    1. Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, и подключитесь к соответствующему вспомогательному компьютеру, нажав кнопку с надписью «Управление ПК».
    2. На компьютере поддержки откройте программное обеспечение с надписью «UVProbe 2.61» и подключитесь к спектрофотометру, нажав кнопку с надписью «Подключить» в левом нижнем углу.
    3. Нажмите кнопку с надписью « Спектр» на верхней панели инструментов программного обеспечения UVProbe.
    4. Нажмите кнопку с надписью « Метод » на верхней панели инструментов.
    5. Перейдите на вкладку « Измерение » и введите «500» в текстовое поле « Пуск », расположенное в разделе «Диапазон длин волн (нм)», и «300» в текстовое поле «Конец».
    6. Щелкните раскрывающееся меню рядом с вкладкой «Скорость сканирования» и установите для нее значение «Средний».
    7. Подготовьте заготовку для образца, перелив 1 мл ДМСО в две кварцевые кюветы (QS 1.000).
    8. Загрузите обе кюветы в соответствующие порты спектрофотометра, нажмите « Автопустой» и запишите спектр от 300 до 500 нм, нажав « Пуск » в левом нижнем углу.
  2. Подготовка и спектральный анализ стандарта ампВ
    1. Приготовьте стандарт ампВ 20 мкг/мл, вынув кювету из переднего отверстия для образца и добавив 20 мкл исходного раствора ампВ 1 мг/мл (всего 20 мкг ампВ).
    2. Загрузите кювету обратно в порт образца спектрофотометра и нажмите « Пуск », чтобы записать поглощение образца.
    3. Извлеките кювету из отверстия для образцов и сцедите жидкое содержимое в контейнер для отходов с соответствующей маркировкой.
    4. Тщательно промойте кювету тремя промывками деионизированной водой, а затем тремя промывками с 70% этанолом.
  3. Подготовка и спектральный анализ образца нарушенного ампВ-нанодиска
    1. Подготовьте разрушенный образец ампВ-нанодиска (содержащий 20 мкг/мл в качестве ампВ) путем пипетирования 20 мкл 1 мг/мл ампВ-нанодиска в 1 мл ДМСО. Инкубируйте не менее 1 минуты перед записью спектра.
    2. Загрузите кювету в передний порт спектрофотометра и нажмите « Пуск», чтобы записать поглощение образца.
  4. Подготовка и спектральный анализ заготовки буфера PBS
    1. Подготовьте заготовку буфера PBS, перелив 1 мл буфера PBS в две кварцевые кюветы (QS 1.000).
    2. Загрузите кюветы в соответствующие порты спектрофотометра, нажмите « Автопусто» и запишите спектр от 300 до 500 нм.
  5. Подготовка и спектральный анализ образца неразрушенного ампВ-нанодиска
    1. Подготовьте неразрушенный образец ампВ-нанодиска (содержащий 20 мкг/мл в качестве ампВ), удалив кювету из переднего порта образца и введя 20 мкл образца ампВ-нанодиска 1 мг/мл в буфер PBS.
    2. Загрузите кювету обратно в порт образца спектрофотометра, нажмите кнопку «Пуск» и запишите спектр образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все химические отходы следует утилизировать в контейнер для отходов с соответствующей маркировкой в соответствии с принятыми рекомендациями.

4. Анализ жизнеспособности дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы жизнеспособности дрожжей были проведены для того, чтобы оценить биологическую активность ampB и определить, влияет ли процесс приготовления или включения в нанодиски на его активность ингибирования роста дрожжей.

  1. В соответствии с ранее описанным способом (2.3-2.4.1) составьте два образца ампВ-нанодисков (конечный объем = 1 мл), чтобы они содержали 1 мг ампВ на 5 мг ДМПК и 0,1 мг ампВ на 5 мг ДМПК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать ампВ 1 мг/мл и 0,1 мг/мл ампВ на 5 мг ДМПК, пипетку 50 мкл и 5 мкл соответственно ампВ 20 мг/мл в запасе ДМСО в каждый флакон с образцом.
  2. Приготовление насыщенной дрожжевой культуры
    1. Перенесите 25 мл стерильной среды дрожжевого экстракта-пептон-декстрозы (YPD) в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
    2. Используйте стерильную инокуляционную петлю для переноса одной колонии Saccharomyces cerevisiae (BY4741) в 25 мл среды YPD.
    3. Культивируют дрожжи в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °C с колебаниями до 200 об/мин в течение 18 часов.
  3. Подготовка индивидуальных образцов для ингибирования роста
    1. Перелейте 5 мл стерильной среды YPD в 30 стерильных пробирок для культивирования по 13 мл.
    2. Обработайте три набора культуральных пробирок, добавив 20, 10 и 5 мкл образца ампВ-нанодиска 1 мг/мл, что составляет 20, 10 и 5 мкг ампВ, соответственно.
    3. Обрабатывают три набора культуральных пробирок, добавляя 20, 10 и 5 мкл образца ампВ-нанодиска 0,1 мг/мл, что составляет 2, 1 и 0,5 мкг ампВ соответственно.
    4. Обработайте четыре набора культуральных пробирок, добавив 20 мкл PBS, DMSO, контрольный рЛПВП (без ампВП) или 20 мкг ампВ в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор культуральных пробирок представляет собой независимую копию. Следовательно, следование этим методам приводит к общему значению n n = 3.
  4. Инициализация анализа жизнеспособности дрожжей
    1. Начните эксперимент с инокуляции каждого образца 100 мкл (2% об./об.) насыщенной культуры дрожжей
    2. Культивируйте дрожжи с помощью встряхивающего инкубатора, настроенного на 30 °C, с колебаниями, установленными на 200 об/мин, в течение максимум 18 часов.
  5. Измерение жизнеспособности дрожжей
    1. Включите спектрофотометр, щелкнув выключателем питания, затем нажмите кнопку с надписью Go To WL и установите значение 600 нм.
    2. Перелейте 1 мл стерильной среды YPD в две пластиковые кюветы, загрузите в соответствующие отверстия для образцов на спектрофотометре и нажмите «Автопусто».
    3. Перенесите 1 мл каждого образца в пластиковую кювету, каждый раз меняя кюветы, и загрузите кювету в переднее отверстие спектрофотометра.
    4. Измерьте и запишите оптическую плотность каждого образца на длине волны 600 нм и утилизируйте каждую использованную кювету в контейнер для биологически опасных отходов с надлежащей маркировкой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществами
В описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образовались нанодиски и что биологически активный агент был растворен. Часто биологически активные агенты поглощают свет в видимой области длин волн (например, ampB, куркумин, лютеин, коэнзим Q10), и в этих случаях образец принимает цвет биологически активного агента. После завершения осветления образца (обычно 5-20 минут обработки ультразвуком в ванне) образец переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл и центрифугируют при 11 000 x g в течение 5 минут для гранулирования нерастворимого материала. Отсутствие видимой гранулы можно считать убедительным доказательством того, что биологически активный агент был включен в нанодиски. С другой стороны, внешний вид гранулы указывает на то, что произошло частичное включение биологически активного агента или его отсутствие. Если это необходимо или полезно, контрольные составы, содержащие только бислой, образующий липид и каркасный белок, могут быть выполнены параллельно, а степень осветления обоих образцов сравнивается визуально и количественно с использованием спектрофотометра. В любом случае, после центрифугирования биологически активного агента, содержащего нанодиски, образец диализуют против PBS или другого подходящего буфера для удаления следов растворителя.

Анализ эффективности солюбилизации биологически активных веществ
Чтобы проиллюстрировать, как поглощение образца может быть использовано для определения эффективности солюбилизации, можно использовать ампB-нанодиски. Первоначально спектр ампВ собирается в ДМСО. Это достигается добавлением 20 мкл из исходного раствора ампВ (в ДМСО) 1 мг/мл к кювете, содержащей 980 мкл ДМСО. Затем спектр регистрируется в видимом диапазоне длин волн от 300 до 500 нм на УФ/ВИД спектрофотометре (рис. 2). Этот спектр, полученный в растворителе ДМСО, дает три отличительных максимума поглощения при 372 нм, 392 нм и 415 нм, пиках, указывающих на ампВ. Затем собран спектр поглощения ампВ-нанодисков в ПБС. Для получения этого спектра к 980 мкл ПБС добавляют 20 мкл ампВ-нанодисков в ПБС и регистрируют спектр. Ожидается, что этот спектр будет сильно отличаться от спектра, наблюдаемого в DMSO25, с одним основным пиком поглощения на более короткой длине волны. Этот результат обусловлен тем фактом, что в PBS структура частиц ампВ-нанодиска остается нетронутой, при этом отдельные молекулы ампВ ограничены и ограничены внутренней частью гидрофобной среды бислоя нанодиска. Поскольку молекулы ampB в образце находятся в непосредственной близости от других молекул ampB, могут образовываться комплексы/структуры более высокого порядка, что приводит к резкому изменению спектральных свойств ampB. Для прямого сравнения спектров ампВ, сформированных в нанодисках, со стандартными ампВ, к 980 мкл ДМСО добавляют аликвоту 20 мкл диализованных ампВ-нанодисков (в PBS). В этом случае растворитель ДМСО приводит к нарушению структуры частиц нанодиска, так что ампВ, интегрированный в липидный бислой образца нанодиска, высвобождается и становится свободно растворимым в растворителе ДМСО. Спектр поглощения этого образца должен быть очень похож, если не идентичен, на спектр стандартного ампВ, описанный выше. Этот результат является прямым доказательством того, что ampB присутствует и что его химические свойства не были изменены в процессе составления нанодисков. В этом случае ожидается, что будут обнаружены те же три максимума поглощения.

Биологическая активность ампВ-нанодисков
Для оценки биологической активности ampB-нанодисков были проведены анализы ингибирования роста дрожжей. Использован штамм дрожжей BY4741 (потомок штамма S. cerevisiae S288C). После обработки оптическую плотность каждого образца дрожжей измеряли на длине волны 600 нм на спектрофотометре УФ-1800 УФ/ВИД (рис. 3). Включение трех контрольных образцов (PBS, DMSO и rHDL) продемонстрировало, что компоненты нанодиска, отличные от ampB, не оказывают заметного влияния на рост дрожжей. Положительный контроль (20 мкг ампВ в ДМСО) подтвердил, что ампВ является эффективным ингибитором роста дрожжей. При тестировании ampB-нанодисков были получены доказательства активности ингибирования роста, зависящей от концентрации ampB. Таким образом, секвестрация ampB в липидной среде частиц нанодиска позволяет повысить растворимость в водном буфере с сохранением мощной биологической активности.

Figure 1
Рисунок 1: Влияние обработки ультразвуком ванны на состав нанодиска и внешний вид образца. Образец ампВ-нанодиска (ампВ-НД) готовили путем диспергирования 5 мг ДМПК в 0,75 мл ПБС, добавления 1 мг ампВ к образцу из исходного раствора 20 мг/мл в ДМСО с последующим добавлением 2 мг каркасного белка в 0,5 мл ПБС (из исходного раствора 4 мг/мл). (А) Дисперсия DMPC в PBS. (B) дисперсия DMPC в PBS после добавления 1 мг ампВ. (C) раствор нанодиска, содержащий DMPC, ampB и каркасный белок после обработки ультразвуком в ванне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: УФ/ВИД спектроскопия поглощения образцов ампВ. (А) ампВ в ДМСО. (B) ampB-нанодиски (ampB-ND) в PBS. (C) ампВ-нанодиски в ДМСО. Спектры были собраны на УФ/ВИД спектрометре. Содержание ампВ в образцах ампВ-нанодисков может быть определено путем переноса известной аликвоты в раствор ДМСО и измерения поглощения при 416 нм (коэффициент экстинкции ампВ при 416 нм = 1,24 х 10,5 М-1 см-1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние ampB на рост S. cerevisiae. Дрожжи культивировали при 30 °C в отсутствие и присутствии ampB. Контрольные образцы, в которых отсутствовал ампВ, включали только PBS и рЛПВП. В качестве положительного контроля ампВ вводили в ДМСО. Испытуемые составы включали ампВ-нанодиски (ампВ-НД) при указанных концентрациях ампВ. После инкубации индивидуальные значения оптической плотности образца определяли при длине волны 600 нм. Статистическая значимость была определена с помощью двустороннего множественного сравнения ANOVA с тестом Тьюки post hoc. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение ± стандартной ошибки (n = 3), репрезентативное для трех независимых экспериментов. ns = не значительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Биологически активное вещество Молекулярная масса (Да) Растворитель Ссылка
Амфотерицин В 924.1 ДМСО 15
Полностью транс-ретиноевая кислота 300.4 ДМСО 16
Куркумин 368.4 ДМСО 17
Нутлин 3а 581.5 ДМСО 21
Коэнзим Q10 863.3 Диметилформамид 20
Лютеин 568.9 Тетрагидрофуран 22
Сфингадиен 297.5 ДМСО 19
Доцетаксел 1 807.9 - 23
10-гидроксикамптотецин 364.4 ДМСО 18
Симвастатин1 418.5 - 24
1 Выбранный растворитель биологически активного вещества высушивали фосфолипидом вместо добавления к дисперсному фосфолипиду в буфере.

Таблица 1: Биологически активные вещества, успешно включенные в нанодиски.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки широкого спектра гидрофобных молекул (таблица 1). К ним относятся малые молекулы, натуральные и синтетические препараты, фитонутриенты, гормоны и т.д. Стратегия составления рецептуры обычно следует стандартному протоколу, который должен учитывать свойства растворимости биологически активного агента в органических растворителях. В дополнение к выбору подходящего органического растворителя для растворения биологически активного агента требуются два дополнительных параметра: достижение исходного раствора ~ 20 мг / мл и смешиваемость растворителя с водными растворами. Это необходимо, потому что позволяет добавлять значительное количество биологически активного агента в рецептурную смесь, не вводя при этом избыток органического растворителя. Смешиваемость важна, потому что фазовое разделение предотвратит включение биологически активного агента в нанодиск продукта.

Введение биологически активного агента сразу после бислоя, образующего фосфолипидную дисперсию, в выбранный буфер позволяет этим компонентам взаимодействовать друг с другом до добавления каркасного белка. До и сразу после добавления белка каркаса образец выглядит как непрозрачная суспензия. Однако, как только три компонента (фосфолипид, биологически активный агент и каркасный белок в соотношении 5/1/2 по массе / весу) добавляются, и образец подвергается обработке ультразвуком в ванне при правильной температуре в течение достаточного периода времени, его внешний вид меняется от мутного до прозрачного. Если биологически активный агент окрашен, осветленный образец приобретет этот цвет. Таким образом, легко обнаружить образование нанодисков при визуальном осмотре.

Хотя DMPC удобен и часто используется в качестве фосфолипида для многих применений, с некоторыми биологически активными агентами этот фосфолипид устойчив к составу нанодисков. Например, нанодиски коэнзима Q10 образовывались только при использовании яичного фосфатидилхолина (PC)19, а также для ксантофилла - лютеина22. Таким образом, в то время как DMPC часто является фосфолипидом выбора, он не является универсальным. Причина, по которой коэнзим Q10 и лютеин предпочитают яичный PC, может быть связана с их расширенными гидрофобными областями, предпочтением бислоев, обладающих ненасыщенными жирными кислотами, или каким-либо другим фактором. Когда используется яичный ПК, температура обработки ультразвуком повышается до 45 °C во время обработки ультразвуком для достижения полного осветления образца. После составления нанодиски, содержащие биологически активные вещества, центрифугируют для удаления нерастворимого материала. Следует, однако, отметить, что обычно осадок не образуется после определения и соблюдения оптимальных условий. Затем образец диализуют против буфера в течение ночи, чтобы удалить небольшое количество органического растворителя, который был добавлен в смесь вместе с биологически активным агентом. После диализа нанодиск продукта можно хранить при температуре 4 °C в течение длительного времени. Если инкорпорированный биологически активный агент подвержен окислению, то образец нанодиска следует хранить в закрытом сосуде под газом N2 .

Различные методы были использованы для характеристики и подтверждения того, что нанодиски действительно сформировались. Возможно, наиболее точным методом является электронная микроскопия26,27. Этот метод предоставляет информацию о морфологии частиц, диаметре и неоднородности размера популяции. Этот метод считается окончательным для формирования нанодисков. Родственный метод, атомно-силовая микроскопия, также использовался для исследования свойств нанодисков, содержащих биологически активные агенты 17,24,28. Для практических целей, однако, гель-фильтрационная хроматография с быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC) удобна и, как правило, достаточна для характеристики размера (~ 200 000 Да) и однородности данного образца нанодиска биологически активного агента20,22. После того, как установлено, что биоактивные агенты нандиски сформировались, также важно и полезно определить эффективность солюбилизации биологически активного агента. Если биологически активный агент обладает характерными свойствами поглощения на данной длине волны, то УФ/ВИД спектроскопия поглощения представляет собой удобный метод. Одним из потенциально осложняющих факторов является поглощение белка каркаса на длине волны 280 нм. Однако, если данный биологически активный агент поглощает на другой длине волны, то это не проблема. Если известен коэффициент экстинкции для интересующего биологически активного агента, то можно точно определить количество биологически активного агента, растворенного в нанодисках. В противном случае можно использовать стандартную кривую, полученную из спектров известных количеств биологически активного агента в соответствующем растворителе. Альтернативные методы включают флуоресцентную спектроскопию17,22 или анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)20,24.

Основной процесс рецептуры, описанный для биологически активного агента, содержащего нанодиски, поддается широкому спектру применений. Например, нанодиски, содержащие контрастные вещества, использовались в исследованиях медицинской визуализации для диагностики и оценки прогрессирования заболевания29. Другой подход заключается в интеграции модифицированных липидами белков в бислой нанодисков. Например, Lalefar et al. успешно включили белок «Wnt» в нанодиски путем вставки его ковалентно связанного фрагмента30 олеиновой кислоты. Впоследствии было показано, что нанодиски Wnt представляют собой водорастворимый транспортный носитель Wnt, способный стимулировать экспансию гемопоэтических стволовых клеток ex vivo. В другом исследовании Crosby et al. сконструировали каркасную белковую химеру, состоящую из апоА-I, слитого с одноцепочечным вариабельным фрагментом антитела (scFv), направленным против поверхностного антигена В-клеток CD2031. Последующая формулировка нанодисков куркумина с α-CD20 scFv·apoA-I в качестве компонента каркаса обеспечивала нацеливание на В-клетки, тем самым усиливая доставку биологически активного агента. Эта стратегия обеспечивает новый подход к минимизации токсичности, связанной с химиотерапевтическими агентами, путем направления их конкретно на тип клеток-мишеней. В другом примере синтетический катионный липид 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан хлорид (DMTAP) был включен в бислой нанодисков32. Эта стратегия формулировки эффективно придавала положительный зарядовый характер поверхности бислоя нанодиска и, тем самым, способствовала стабильному связывающему взаимодействию с короткой интерферирующей (si) РНК. Затем было показано, что обогащенные миРНК нанодиски DMTAP обладают биологической активностью в исследованиях нокдауна генов-мишеней. В еще одном примере нанодиски были составлены с кардиолипином в качестве единственного фосфолипидного компонента. Известно, что этот уникальный анионный глицерофосфолипид связывает различные лиганды, включая двухвалентный минерал кальций, гемопротеин цитохром с, антрациклиновый противораковый агент доксорубицин и другие33,34,35,36. Кардиолипиновые нанодиски были использованы для детальной характеристики этих связывающих взаимодействий, используя преимущества растворимости нанодисков, их наноразмерный размер и наличие доступного кардиолипинового бислоя8. Основываясь на этих и других приложениях, очевидно, что технология нанодисков является универсальной платформой для множества приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R37 HL-64159).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193 нанодиски амфотерицин В фосфолипид аполипопротеин восстановленный липопротеин высокой плотности биологически активный агент
Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I.,… More

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter