Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Non-İnvaziv Kompresyona Bağlı Ön Çapraz Bağ (ACL) Yaralanması ve Farelerde Proteaz Aktivitesinin İn vivo Görüntülenmesi

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65249
Automatic Translation
1, 1
1Lawrence J. Ellison Musculoskeletal Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of California Davis Health

Summary

Non-invaziv ÖÇB yaralanması, farelerde travma sonrası osteoartriti (PTOA) başlatmak için güvenilir ve klinik olarak anlamlı bir yöntemdir. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda, proteazla aktive edilebilen yakın kızılötesi problar ve floresan yansıma görüntüleme kullanılarak yaralanma sonrası erken zaman noktalarında eklemdeki proteaz aktivitesinin in vivo olarak ölçülmesine izin verir.

Abstract

Ön çapraz bağ (ÖÇB) rüptürü veya menisküs yırtıkları gibi travmatik eklem yaralanmaları genellikle yaralanmayı takip eden 10-20 yıl içinde travma sonrası osteoartrite (PTOA) yol açar. Eklem yaralanmaları tarafından başlatılan erken biyolojik süreçleri anlamak (ör., inflamasyon, matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), katepsin proteazları, kemik rezorpsiyonu) PTOA'nın etiyolojisini anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, bu biyolojik süreçlerin in vivo ölçümü için çok az seçenek vardır ve OA'yı başlatmak için invaziv cerrahi teknikler veya enjeksiyonlar kullanılırsa erken biyolojik yanıtlar karıştırılabilir. PTOA çalışmalarımızda, farelerde non-invaziv kompresyona bağlı ACL hasarını takiben in vivo proteaz aktivitesini ölçmek için floresan yansıma görüntüleme (FRI) ile birlikte ticari olarak temin edilebilen yakın kızılötesi proteaz aktive edilebilir problar kullandık. Bu non-invaziv ÖÇB yaralanma yöntemi, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yakından özetler ve cildi veya eklem kapsülünü bozmayı içermediğinden tamamen aseptiktir. Bu yaralanma ve görüntüleme yöntemlerinin kombinasyonu, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben proteaz aktivitesinin zaman akışını birden fazla zaman noktasında incelememizi sağlar.

Introduction

Osteoartrit, Amerika Birleşik Devletleri'nde milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir sağlık sorunudur1. Travma sonrası osteoartrit (PTOA), ön çapraz bağ (ÖÇB) yırtılması, menisküs yaralanması veya eklem içi kırık gibi bir eklem yaralanması ile başlayan bir OA alt kümesidir2. PTOA olarak sınıflandırılabilecek semptomatik OA hastalarının oranı en az %12'dir3 ve bu etiyoloji tipik olarak idiyopatik OA'dan daha genç bir popülasyonuetkiler4. OA'nın fare modelleri, hastalık etiyolojisini ve potansiyel OA tedavilerini çok daha kısa bir zaman çizelgesinde (insanlarda 10-20 yıla kıyasla fare modellerinde 4-12 hafta) araştırmak için çok önemli araçlardır. Bununla birlikte, farelerde OA'yı başlatma yöntemleri genellikle ACL transeksiyonu 5,6, medial menisküs 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 veya ikisinin bir kombinasyonu gibi invaziv cerrahi teknikleri içerir 17,18,19, klinik olarak ilgili yaralanma koşullarını yeniden üretmez. Cerrahi modeller ayrıca eklem kapsülünün bozulması nedeniyle eklemdeki iltihabı şiddetlendirir ve bu da OA ilerlemesini hızlandırabilir.

Non-invaziv diz yaralanması fare modelleri, yaralanma sonrası erken zaman noktalarında biyolojik ve biyomekanik değişiklikleri inceleme fırsatı sağlar ve klinik olarak daha anlamlı sonuçlar verebilir20. Laboratuvarımız, farelerde ön çapraz bağ (ACL) rüptürünü indüklemek için harici olarak uygulanan tek bir tibial kompresyon aşırı yüklemesini kullanan non-invaziv bir yaralanma modeli oluşturmuştur 21,22,23,24. Bu non-invaziv yaralanma yöntemi, cildi veya eklem kapsülünü bozmadan aseptik bir eklem yaralanması üretebilir.

Floresan yansıma görüntüleme (FRI), belirli bir dalga boyunda kızılötesi ışıkla bir hedefi uyarmayı ve başka bir dalga boyunda yayılan yansıyan ışığı ölçmeyi içeren bir optik görüntüleme yöntemidir. Ticari olarak temin edilebilen proteaza özgü problar hayvan modellerine enjekte edilebilir ve FRI daha sonra diz eklemi gibi belirli bölgelerde proteaz aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, inflamasyon gibi biyolojik aktivitelerin in vivo tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulama için kullanılan problar, ilgili proteazlarla karşılaşana kadar floresan olarak söndürülür. Bu proteazlar daha sonra problar üzerindeki bir enzim bölünme bölgesini kıracak ve ardından yakın kızılötesi bir floresan sinyali üreteceklerdir. Bu problar ve bu görüntüleme yöntemi, kanser 25,26,27,28 ve ateroskleroz29,30,31,32 çalışmalarında kapsamlı bir şekilde doğrulanmış ve kullanılmıştır ve grubumuz bunları inflamasyon ve matris bozulması belirteçlerini ölçmek için kas-iskelet sistemi çalışmaları için kullanmıştır 23,24,33.

Birlikte, in vivo FRI ve proteaz aktive edilebilir problarla birleştirilmiş non-invaziv eklem yaralanması, travmatik bir eklem yaralanmasını takiben inflamasyonu ve proteaz aktivitesini izlemek için benzersiz bir yetenek sağlar. Bu analiz, yaralanmadan saatler hatta dakikalar sonra yapılabilir ve aynı hayvan, eklemdeki proteaz aktivitesinin zaman seyrini incelemek için birden çok kez değerlendirilebilir. Daha da önemlisi, bu görüntüleme yöntemi, OA'nın cerrahi modelleriyle birleştirildiğinde mümkün olmayabilir, çünkü cildin ve eklem kapsülünün bozulması, eklem içinden gelen sinyali karıştıracak bir floresan sinyaline neden olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Açıklanan tüm prosedürler, California Davis Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için 3 aylık erkek C57BL/6J fareler kullanıldı.

1. Non-invaziv ACL yaralanması

NOT: Harici olarak uygulanan bir basınç yükü tarafından üretilen ÖÇB yaralanması, insanlarda ÖÇB yaralanma koşullarını yakından özetleyen basit ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir yük çerçevesi cihazı için yazılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu), ancak benzer sistemler için uyarlanabilir.

  1. Yük çerçevesi cihazıyla uyumlu yazılımı açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve mevcut bir kontrol dosyasını seçin veya yeni bir dosya oluşturun.
  2. Aktüatörün gücünü açın.
  3. Kalibrasyon menüsünde, yük hücresinin kuvvet okumasını ayarlayın ve aktüatörün yer değiştirmesini 0 olarak ayarlayın.
  4. Fareleri uyuşturmak için oksijende %1-4 inhale izofluran kullanın ve hayvanların ayak parmağı tutamı ve/veya kuyruk tutamıyla tamamen uyuşturulmasını sağlayın.
  5. Fareyi platform üzerinde yüzüstü konuma getirin. Alt bacağı iki yükleme fikstürü arasına dikey olarak yerleştirin (Şekil 1) (bkz. Malzeme Tablosu). Ayağı üst fikstürün oyuğuna ve dizini alt fikstürün kabına yerleştirin.
  6. 1-2 N'luk bir ön yük uygulamak için alt fikstürün yüksekliğini manuel olarak ayarlayın (bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak izlenir) ve konumu korumak için ayar vidasını sıkın. Yaralanma yükünü uygulamadan önce bacağı doğru pozisyonda tutmak için ön yük gereklidir.
  7. Bir hedef kuvvete (~12-15 N) veya hedef yer değiştirmeye (~1.5-2.0 mm) tek bir basınç yükü uygulayın.
    NOT: Yükün daha yavaş bir yükleme hızında (~1 mm/sn) uygulanması, daha yüksek düzeyde gerçek zamanlı izleme ve kontrol sağlayacaktır, ancak muhtemelen ACL'de bir avülsiyon arızasına neden olacaktır. Daha hızlı bir yükleme hızı (~ 200 mm / s) uygulamak, orta madde ACL yaralanmasına neden olma olasılığı daha yüksek olacaktır22. Tibia kırığı veya başka bir aşırı yaralanmanın meydana geldiği belirlenirse, hayvan anesteziden iyileşmeden önce IACUC onaylı bir yöntem kullanarak hayvana ötenazi yapın.
    1. Yazılım kontrol dosyasında yükleme hızını ayarlayın ve zorla yer değiştirme verilerini kullanarak onaylayın.
      NOT: Tibial kompresyon yüklemesi sırasında kemik kırığı tipik olarak bir endişe kaynağı değildir, çünkü kırılma kuvveti (~ 20 N) ACL yaralanma kuvvetinden önemli ölçüde daha yüksektir. Bununla birlikte, bu palpasyonla izlenmelidir ve tibia kırığı oluşmadığını doğrulamak için görüntüleme (yani röntgen) kullanılabilir.
  8. Yaralanma tipik olarak bir ses ("klik" veya "çatırtı") ve kuvvet yer değiştirme grafiklerinde tanımlanabilen bir kuvvet serbest bırakma ile gösterilir (Şekil 1C). Daha yavaş bir yükleme hızı kullanılıyorsa, daha fazla yüklemeyi ve diğer eklem dokularına olası hasarı önlemek için yaralanmadan hemen sonra basınç yükünü durdurun.
    NOT: ACL yaralanması tipik olarak vücut kütlesine bağlı olarak 8-15 N'de meydana gelir34. Beklenen ACL yaralanma kuvvetinden daha büyük bir hedef kuvvet belirlemek önemlidir.
  9. Ön-arka çekmece testi35,36 veya eklem instabilitesinin karşılaştırılabilir değerlendirmesini kullanarak ACL yaralanmasını doğrulayın.
  10. Yaralanma sonrası farelere, ev kurumu IACUC tarafından önerilen ve onaylanan süre ve dozla, hayvan ağırlığına bağlı bir doz (örneğin, 0.05-0.1 mg / kg SC veya buprenorfin IP'si, Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın.
    NOT: NSAİİ'ler yaralanma sonrası PTOA'nın ilerlemesini değiştirebilir, bu nedenle çalışmanın özel bir amacı olmadıkça bu yaralanma modelinde ağrı yönetimi için NSAİİ'lerin kullanılması önerilmez.

2. FRI görüntüleme için hayvan hazırlığı

NOT: Optik görüntüleme için, hayvan kürkü (özellikle koyu kürk) ışığı engellemede, emmede ve dağıtmada oldukça etkilidir, bu nedenle görüntülemeden önce kürk diz eklemlerinin etrafındaki alandan mümkün olduğunca çıkarılmalıdır. Tüy dökücü bir krem tipik olarak tüy çıkarma için makaslardan daha etkilidir. Çıplak veya tüysüz fareler kürkün alınmasını gerektirmez. Bununla birlikte, en yaygın kullanılan fare suşları için tüylerin çıkarılması gereklidir (örneğin, C57BL / 6). Mümkünse, görüntülemeden önce fareleri düşük floresan saflaştırılmış yiyeceklerle besleyin. Standart fare yemi, yaklaşık 700 nm dalga boyunda otomatik floresan veren ve yakın kızılötesi FRI sisteminden veri toplamayı etkileyebilen klorofil içerir.

  1. Oksijende% 1 -% 4 inhale izofluran ile fareleri uyuşturun. Fareleri mümkün olduğunca bir ısıtma yastığı üzerinde tutun ve gözlerin tahriş olmasını önlemek için göz merhemi sürün.
  2. Diz eklemi çevresindeki farelerin bacaklarının ön (kraniyal) yönüne tüy dökücü krem ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulamak için pamuklu çubuk kullanın.
  3. Kremi ~ 1 dakika bekletin, ardından kremi ve kürkü bacaktan çıkarmak için mendil kullanın. Gerekirse tekrarlayın.
  4. Diz eklemleri, bölgeyi kaplayan herhangi bir kürk olmadan tamamen açığa çıktığında, kalan tüy dökücü kremi çıkarmak için bacakları alkollü mendillerle temizleyin.
    NOT: Tüy dökücü krem, bir çalışma boyunca aynı farelerde birden çok kez kullanılabilir, ancak cildin gereksiz tahriş olmasını önlemek için bu uygulamalar en az bir hafta arayla yapılmalıdır.

3. Prob çözeltisinin hazırlanması

  1. Gerekirse, floresan aktive edilebilir probu üreticinin talimatlarına göre steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin. Ticari olarak temin edilebilen probun bir şişesi (Malzeme Tablosuna bakınız) tipik olarak 0.15 mL 1x PBS'de 20 nmol içerir. Şişedeki çözeltiyi seyreltmek için, 1.5 mL 1x PBS'de 20 nmol yapmak için 1.35 mL 1x PBS ekleyin.
    NOT: Seyreltmeden sonra, fare başına 0.15 mL enjekte edilirken on fareyi görüntülemek için bir şişe kullanılabilir.
  2. Probun çözelti içinde çözünmesini sağlamak için çözeltiyi minimum hızda (~ 2000 rpm) 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından tüm sıvının kapaktan çıktığından emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin.
    NOT: Çözelti, 12 aya kadar ışıktan korunan bir yerde 2-8 °C'de saklanabilir.

4. Retro-orbital enjeksiyon

NOT: Bu prosedürün ayrıntıları ile ilgili olarak Yardeni ve ark.'ya bakın37.

  1. Fareleri uyuşturmak için oksijende% 1 -% 4 inhale izofluran kullanın ve fareyi burnu bir burun konisinde olacak şekilde yan yatırın.
  2. Prob çözeltisinin enjeksiyonu için ~ 29 G insülin şırıngaları kullanın (3. adımda hazırlanır).
  3. Işığa maruz kalmayı önlemek için kullanmadan önce şırıngayı kapalı tutun.
  4. Enjeksiyonu uygularken:
    1. Gözün içine (lakrimal karuncula) enjekte edin ve şırınganın eğiminin göze doğru açılı olduğundan emin olun. Sağ elini kullananlar için, hayvan sağa bakacak şekilde farenin sağ gözüne enjekte edilmesi önerilir.
    2. Enjekte etmeyen el ile, başı stabilize etmek ve gözün dışarı çıkmasına neden olmak için göz çevresindeki cildi nazikçe geri çekin.
    3. Şırıngayı farenin gövdesine paralel olarak açın.
    4. Şırıngayı sert bir dirençle karşılaşana kadar gözün yanından yavaşça ilerletin; Bu noktayı aşmaya çalışmayın.
    5. Prob solüsyonunu retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin, ardından iğneyi yavaşça göz yuvasından dışarı çekin. İğne ile herhangi bir çözelti çıkmazsa, enjeksiyon başarılıdır.
    6. Enjekte edilen göze salin veya göz merhemi sürün.
      NOT: Görüntüleme problarıyla birlikte verilen belgelere dayanarak, optimum görüntüleme süresi tipik olarak prob çözeltisinin enjeksiyonundan sonraki 1 ila 2 gün arasındadır. Mümkünse, her bir özel uygulama için en uygun görüntüleme süresini belirlemek için bir başlangıç zamanı taraması yapılması önerilir. Fareler, enjekte edilen probu yaklaşık 7 gün içinde metabolize eder, bundan sonra ek zaman noktaları istenirse yeni bir prob çözeltisi dozunun enjekte edilmesi gerekecektir.

5. Floresan yansıma görüntüleme

NOT: Bu bölümdeki prosedürler, piyasada bulunan bir optik görüntüleme sistemine özeldir (bkz. Benzer görüntülemeler benzer sistemlerle yapılabilir.

  1. Fareleri oksijende %1-4 inhale izofluran ile uyuşturun ve hayvanı burnu bir burun konisinde olacak şekilde görüntüleme sistemine sırtüstü yerleştirin.
  2. Fareyi, dizler hafifçe havaya bakacak şekilde alt bacakları uzatılmış olarak konumlandırın (ayakları bantlamak gerekebilir). Tüm hayvanlar için tutarlı bir konumlandırma kullanılması çok önemlidir.
  3. Görüntüleme sistemi bilgisayarında uyumlu yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu) açın; "Edinme Kontrol Paneli" görünecektir.
  4. Sistemi ısıtmak için Başlat'a tıklayın ve sıcaklık ışığı yeşile dönene kadar bekleyin.
  5. Imaging Wizard (Görüntüleme Sihirbazı) öğesine tıklayın ve "Imaging Wizard" (Görüntüleme Sihirbazı) penceresinin göründüğünden emin olun.
  6. Filtre Çifti'ne tıklayın ve ayarın 'Epi-Aydınlatma' üzerinde olduğundan emin olun, ardından İleri'ye basın.
  7. Doğru uyarma/emisyon ayarlarını seçmek için, açılır listeden ilgilendiğiniz probu bulun. Doğru probu bulamazsanız, 'Giriş Ex/Em' Adını bulun ve kullanılacak probun özelliğine göre Uyarma Zirvesi ve Emisyon Zirvesi değerini manuel olarak yazın (örneğin, Uyarma Zirvesi için 675 girin ve Emisyon Zirvesi için 720 girin). İleri'ye tıklayın.
  8. "Görüntüleme Konusu" için Fare'yi seçin. "Pozlama Parametreleri"nde, Otomatik Ayarlar'ın işaretli olduğundan ve Floresan ve Fotoğraf seçeneklerinin seçildiğinden emin olun. "Görüş Alanı" kontrol listesinden D-22,6 cm'yi seçin. İleri'ye basın.
  9. Görüntüleme ayarı, "Edinme Kontrol Paneli"nin sağ panelinde görülebilir ve değiştirilebilir. Tüm ayarların doğru olduğundan emin olun ve Sıra Al düğmesine basın. Görüntü göründükten sonra, görüntünün yeterli pozlamaya sahip olduğunu onaylayın. Değilse, pozlama süresi ayarını değiştirin ve tekrar Sıra Al'a tıklayın.
  10. Görüntüyü analiz etmek için, siyah beyaz görüntüde her diz ekleminin üzerine tutarlı boyutta bir ilgi bölgesi (ROI) dairesi yerleştirin (bu, floresan sinyal alanlarına dayalı önyargılı konumlandırmayı önler).
  11. Her diz eklemi için toplam radyant verimliliği ve/veya ortalama radyant verimliliği hesaplayın. Radyant verim kontralateral bacaklarda da hesaplanıyorsa, yaralı bacak için radyant verimlilik ölçümünü karşı bacağın radyant verimlilik ölçümüne bölerek verileri normalleştirin.
    NOT: Tüm dizler için tutarlı alana sahip bir ilgi bölgesi kullanılırsa, hem toplam radyant verimliliği hem de ortalama radyant verimliliği benzer sonuçlar verecektir. Farklı boyutlara sahip ilgi çekici bölgeler kullanılıyorsa, ortalama radyant verimliliğinin kullanılması önerilir. Yaralı eklemden gelen radyant verimlilik verilerinin yaralanmamış kontralateral dizden alınan verilerle normalleştirilmesi, enjekte edilen prob miktarındaki ve farklı hayvanlar arasındaki dağıtım verimliliğindeki herhangi bir farklılığı hesaba katmak için dahili bir kontrol sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3 aylık erkek C57BL / 6J farelerinin alt bacaklarına tek bir sıkıştırma kuvveti (yaralanmaya kadar 1 mm / s) uygulandıktan sonra, tüm farelerde sürekli olarak ACL yaralanması indüklendi. Diz yaralanmasında ortalama basınç kuvveti yaklaşık 10 N idi (Şekil 1).

FRI analizi, yaralanmadan 7 gün sonra non-invaziv ACL hasarına maruz kalan farelerin yaralı eklemlerinde önemli ölçüde daha fazla proteaz aktivitesi gösterdi (Şekil 2). Diz eklemlerinin FRI analizi, daha önce sıçanlarda 35,36,38 tarif edilene benzer şekilde, non-invaziv ACL yaralanmasından hemen sonra diz ekleminin cerrahi olarak yeniden stabilizasyonu yapılan farelerde de gerçekleştirildi. Bu analiz, yeniden stabilizasyon ameliyatına tabi tutulan farelerde, yaralanmadan sonraki 2 ve 4 haftada ameliyat olmayan farelere göre önemli ölçüde daha fazla floresan sinyali gösterdi. Bu veriler, invaziv cerrahi prosedürlerin eklemdeki proteaz aktivitesinin analizini karıştırabileceğini düşündürmektedir.

Figure 1
Şekil 1: Non-invaziv ACL yaralanma kurulumu ve yaralanma sırasında bir kuvvet-zaman grafiği. (A,B) Farenin alt bacağı, ayak bileği üst fikstürün bir çentiğine ve diz eklemi alt fikstürün sığ bir kabına yerleştirilecek şekilde sistemde dikey olarak konumlandırılmıştır. Alt fikstür, manuel olarak 1-2 N'lik bir ön yük uygulandıktan sonra bir ayar vidası ile yerine kilitlenir. (C) Yaklaşık 9 N'de ACL yaralanmasını gösteren kuvvet yer değiştirme grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fare diz eklemlerinde proteaz aktivitesini tespit eden floresan yansıma görüntüleme. (A,B) Yaralanma sonrası yaralanmamış (A) ve yaralı (B) farelerin temsili görüntüleri. (C) Non-invaziv ACL yaralanmasından bir hafta sonra yaralanmamış ve yaralı fareler için her iki diz ekleminin ortalama radyan etkinliği. Yaralı eklemler, kontralateral eklemlere ve yaralanmamış farelerden alınan eklemlere kıyasla %43 daha fazla ortalama radyan etkinlik gösterdi. (D) İnvaziv olmayan şekilde yaralanmış fareler ve eklem restabilizasyon ameliyatına tabi tutulan yaralı fareler için normalleştirilmiş toplam radyant verimlilik (R/L). Yaralanmadan 1-4 hafta sonra karşı eklemlere kıyasla yaralı eklemlerde ~% 30 -% 80 daha fazla radyan etkinlik gözlenmiştir. Buna karşılık, cerrahi olarak ameliyat edilen eklemler, kontralateral eklemlere kıyasla 4. haftada ~% 300 daha fazla radyan etkinlik sergiledi ve bu da ameliyatın kayda değer bir karıştırıcı etkisi olduğunu düşündürdü. **P < 0,01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, farelerdeACL hasarını indüklemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir yöntem oluşturmuş ve titizlikle tanımlamıştır 20,21,24,33. Bu basit ve etkili yaralanma yöntemi sadece birkaç dakika içinde gerçekleştirilebilir, bu da PTOA'nın yüksek verimli çalışmalarını kolaylaştırır. Bu yaralanma yöntemi aynı zamanda insan ACL yaralanması ile ilgili yaralanma koşullarını da yakından özetlemektedir. Farelerde OA'yı indüklemek için kullanılan cerrahi yöntemler, yaralanmayı takiben eklemdeki proteaz aktivitesinin zaman seyrini ve büyüklüğünü ölçmek için in vivo görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasını engelleyebilir. Buna karşılık, FRI ile birleştirilmiş non-invaziv OA fare modelleri (20'de gözden geçirilmiştir), yaralanmayı takiben fare diz eklemlerinde proteaz aktivitesinin in vivo görüntülenmesi için benzersiz bir yetenek sağlar.

Yaralanma sonrası inflamatuar yanıt, OA progresyonunda kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, eklemdeki iltihabı analiz etmek için kullanılan yöntemler tipik olarak pahalı, zaman alıcı ve yıkıcıdır. Örneğin, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) veya RNAseq gibi teknikler, tüm eklemlerde, tek tek dokularda veya tek hücrelerde çok çeşitli genleri ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, farelerin yaralı ve yaralanmamış diz eklemleri elde etmek için ötenazi yapılmasını gerektirir. Bu fareler, pik proteaz yanıtı sırasında erken bir zaman noktası (yani, yaralanmadan 3-14 gün sonra) ve OA'nın daha şiddetli olduğu daha sonraki bir zaman noktası (yani, yaralanmadan 4-6 hafta sonra) gibi birden fazla zaman noktasında analiz edilemez. Buna karşılık, non-invaziv eklem yaralanması ile birlikte FRI, farelerin diz eklemlerinde birden fazla zaman noktasında proteaz aktivitesini analiz etme yeteneği sağlar in vivo39. Bu, aynı farelerin uzunlamasına analizine izin verir ve FRI'yi RT-PCR veya RNAseq'ten nispeten daha düşük maliyetli bir sonuç haline getirir. Ek olarak, farklı amaçlar için birden fazla sonuç sağlayabilen farklı dalga boylarında aynı anda birden fazla prob veya hedef görüntülenebilir. FRI kullanılarak eklemdeki proteaz aktivitesinin ölçülmesi, OA ilerlemesi sırasında meydana gelen tüm enflamatuar süreçlerin titiz bir şekilde ölçülmesini sağlamaz, ancak bu yöntemle sağlanan in vivo ve uzunlamasına veriler, eklem hasarını takiben inflamatuar proteaz aktivitesinin büyüklüğünü ve zaman seyrini izlemek için hala yararlı olabilir.

Proteaz aktivitesinin FRI görüntülemesi için kullanılan floresan aktive edilebilir prob çözeltisi intravenöz olarak verilmelidir (IV). Farelerde IV enjeksiyonu gerçekleştirmenin en yaygın yolları kuyruk damarı enjeksiyonu ve retro-orbital enjeksiyondur. Retro-orbital enjeksiyonun gerçekleştirilmesi genellikle daha kolaydır ve gerekli enjeksiyon hacmini kuyruk ven enjeksiyonundan daha kolay kolaylaştırır. Literatür ayrıca, retro-orbital uygulamanın, kuyruk ven enjeksiyonuna kıyasla ilaç dağıtımı veya etkinliğinde hiçbir fark olmaksızın farelerde daha az strese neden olabileceğini göstermektedir40. Bu bulgular, retro-orbital enjeksiyonun, FRI görüntüleme için floresan aktive edilebilir prob çözeltisinin enjekte edilmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

FRI'nin çözünürlüğü diğer bazı görüntüleme tekniklerine kıyasla nispeten düşüktür, ancak kantitatif sonuçlar, OA progresyonu sırasında inflamatuar proteaz yanıtının zaman seyri ve büyüklüğü hakkında yeterli bilgi sağlayabilir. Bu tekniğin bir sınırlaması, doku otofloresansının sonuçları etkileyebilmesidir, ancak bu sorun deneyden önce kapsamlı bir planla çözülebilir (prob tipi, farelerin suşu, hayvan konumlandırma, vb.). Diğer klinik öncesi görüntüleme yöntemlerinden (örneğin, microPET, microSPECT, microCT, MRI) farklı olarak, ışık penetrasyon derinliği sınırlı olduğundan, fareler ve insanlar arasındaki boyuttaki ciddi farklılıklar nedeniyle FRI doğrudan bir klinik görüntüleme yöntemine çevrilemez. Bununla birlikte, kemirgen modelleri kullanılarak yapılan klinik öncesi çalışmalarda, diz eklemi minimum yumuşak doku kaplaması ile cilde yakındır. Sonuç olarak, FRI, farelerin diz eklemindeki proteaz aktivitesini tespit etmek için etkili bir araçtır.

Sonuç olarak, non-invaziv ÖÇB yaralanması, farelerde PTOA'yı başlatmak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu yaralanma yöntemi ayrıca, OA ilerlemesi sırasında fare eklemlerinde inflamatuar proteaz aktivitesinin zaman seyrinin ve büyüklüğünün in vivo ölçümü için proteazla aktive edilebilir probların ve Floresan Yansıma Görüntülemenin kullanımını kolaylaştırır. Gelecekteki çalışmalar, farklı yaş, cinsiyet ve genetik geçmişe sahip farelerde OA progresyon mekanizmalarını araştırmak veya eklem yaralanmasından sonra OA ilerlemesini yavaşlatmak veya önlemek için potansiyel tedavileri değerlendirmek için bu teknikleri ve ticari olarak temin edilebilen çok sayıda yakın kızılötesi floresan aktive edilebilir probları kullanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir parçası olan Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından R01 AR075013 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate-Buffered Saline Tissue Protech PBS01-32R or equivalent
Air Anesthetia System Isoflurane vaporizor with induction chamber and nose cone
Buprenorphine Analgesic post-injury 
Depilatory Cream Veet B001KYPZ4G or equivalent
Fixtures Custom-made knee fixture, ankle fixture, and platform
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Can also use comparable optical imaging system
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 06-666 or equivalent
Living Image software  Perkin Elmer
Materials testing systems  TA Instruments Electroforce 3200 or equivalent
ProSense680 Perkin Elmer NEV10003 Can also use other probes such as OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense, etc.
Sterile Syringe with Needle Spectrum Chemical Mfg. Corp. 550-82231-CS Covidien 1 mL TB Syringe with 28 G x 1/2 in. Needle, Sterile or equivalent
Uniaxial load cell TA Instruments 20 N capacity
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc. SI-0236 or equivalent
WinTest software  TA Instruments compatible with Electroforce 3200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research (Hoboken. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  2. Carbone, A., Rodeo, S. Review of current understanding of post-traumatic osteoarthritis resulting from sports injuries. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 397-405 (2017).
  3. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of posttraumatic osteoarthritis. Journal of Athletic Training. 52 (6), 491-496 (2017).
  4. Wang, L. J., Zeng, N., Yan, Z. P., Li, J. T., Ni, G. X. Post-traumatic osteoarthritis following ACL injury. Arthritis Research & Therapy. 22 (1), 57 (2020).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  6. Kamekura, S. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
  7. Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  8. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 18 (4), 572-580 (2010).
  9. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nature Medicine. 16 (6), 687-693 (2010).
  10. Moodie, J. P., Stok, K. S., Muller, R., Vincent, T. L., Shefelbine, S. J. Multimodal imaging demonstrates concomitant changes in bone and cartilage after destabilisation of the medial meniscus and increased joint laxity. Osteoarthritis Cartilage. 19 (2), 163-170 (2011).
  11. Li, J., et al. Knockout of ADAMTS5 does not eliminate cartilage aggrecanase activity but abrogates joint fibrosis and promotes cartilage aggrecan deposition in murine osteoarthritis models. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 516-522 (2011).
  12. Shapiro, F., Glimcher, M. J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint. Clinical Orthopaedics and Related Research. 147, 287-295 (1980).
  13. Meacock, S. C., Bodmer, J. L., Billingham, M. E. Experimental osteoarthritis in guinea-pigs. Journal of Experimental Pathology (Oxford). 71 (2), 279-293 (1990).
  14. Armstrong, S. J., Read, R. A., Ghosh, P., Wilson, D. M. Moderate exercise exacerbates the osteoarthritic lesions produced in cartilage by meniscectomy: a morphological study. Osteoarthritis Cartilage. 1 (2), 89-96 (1993).
  15. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  16. Wancket, L. M., et al. Anatomical localization of cartilage degradation markers in a surgically induced rat osteoarthritis model. Toxicologic Pathology. 33 (4), 484-489 (2005).
  17. Karahan, S., Kincaid, S. A., Kammermann, J. R., Wright, J. C. Evaluation of the rat stifle joint after transection of the cranial cruciate ligament and partial medial meniscectomy. Comparative Medicine. 51 (6), 504-512 (2001).
  18. Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 13 (7), 632-641 (2005).
  19. Jones, M. D., et al. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis & Rheumatology. 62 (9), 2726-2735 (2010).
  20. Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
  21. Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
  22. Lockwood, K. A., Chu, B. T., Anderson, M. J., Haudenschild, D. R., Christiansen, B. A. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 32 (1), 79-88 (2014).
  23. Satkunananthan, P. B., et al. In vivo fluorescence reflectance imaging of protease activity in a mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1461-1469 (2014).
  24. Hsia, A. W., et al. Post-traumatic osteoarthritis progression is diminished by early mechanical unloading and anti-inflammatory treatment in mice. Osteoarthritis Cartilage. 29 (12), 1709-1719 (2021).
  25. Zhang, H., et al. Biochromoendoscopy: molecular imaging with capsule endoscopy for detection of adenomas of the GI tract. Gastrointestinal Endoscopy. 68 (3), 520-527 (2008).
  26. Gounaris, E., et al. Live imaging of cysteine-cathepsin activity reveals dynamics of focal inflammation, angiogenesis, and polyp growth. PLoS One. 3 (8), e2916 (2008).
  27. Sheth, R. A., Mahmood, U. Optical molecular imaging and its emerging role in colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (4), G807-G820 (2010).
  28. Clapper, M. L., et al. Detection of colorectal adenomas using a bioactivatable probe specific for matrix metalloproteinase activity. Neoplasia. 13 (8), 685-691 (2011).
  29. Nahrendorf, M., et al. Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct. Circulation Research. 100 (8), 1218-1225 (2007).
  30. Jaffer, F. A., et al. Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor. Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).
  31. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  32. Razansky, D., et al. Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques. Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).
  33. Hsia, A. W., et al. Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).
  34. Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).
  35. Murata, K., et al. Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).
  36. Murata, K., et al. Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation. Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).
  37. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Laboratory Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  38. Kokubun, T., et al. Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model. The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).
  39. Bhatti, F. U., et al. Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice. Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783 (2022).
  40. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).

Tags

Non-invaziv Kompresyona Bağlı Ön Çapraz Bağ (ÖÇB) Yaralanması In Vivo Görüntüleme Proteaz Aktivitesi Fareler Travmatik Eklem Yaralanmaları Travma Sonrası Osteoartrit (PTOA) Biyolojik Süreçler Enflamasyon Matriks Metalloproteinazlar (MMP'ler) Katepsin Proteazları Kemik Rezorpsiyonu PTOA Etiyolojisi İn Vivo Ölçüm Cerrahi Teknikler Enjeksiyonlar Yakın Kızılötesi Proteaz Aktive Edilebilir Problar Floresan Yansıma Görüntüleme (FRI) Proteaz Aktivitesinin Ölçülmesi Non-invaziv ACL Yaralanması Yöntem Klinik Olarak İlgili Yaralanma Durumları Aseptik Cilt Bozulması Eklem Kapsülü
Non-İnvaziv Kompresyona Bağlı Ön Çapraz Bağ (ACL) Yaralanması ve <em>Farelerde Proteaz Aktivitesinin İn vivo</em> Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. Y., Christiansen, B. A.… More

Lin, Y. Y., Christiansen, B. A. Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice. J. Vis. Exp. (199), e65249, doi:10.3791/65249 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter