Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

Abstract

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler), bakteriyel enfeksiyona veya travmatik doku hasarına yanıt olarak nötrofiller tarafından salınır, ancak aynı zamanda otoimmün hastalıklarda ve steril inflamasyonda da rol oynar. Çift sarmallı DNA filamentleri, histonlar ve antimikrobiyal proteinlerden oluşan ağ benzeri yapılardır. Serbest bırakıldıktan sonra, NET'ler kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayabilir ve öldürebilir. Ayrıca, NET'ler trombosit adezyonunu ve pıhtılaşmayı uyararak homeostatik regülasyona katılırlar. Bununla birlikte, NET'lerin düzensiz üretimi, sepsis veya otoimmün bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir ve bu da onları terapötik müdahale için umut verici bir hedef haline getirmektedir. Elektron mikroskobunun yanı sıra, immünofloresan görüntüleme kullanılarak NET'lerin görüntülenmesi, şu anda dokudaki NET etkileşimlerini göstermek için bilinen tek yöntemlerden biridir. Bu nedenle, NET'leri görselleştirmek için çeşitli boyama yöntemleri kullanılmıştır. Literatürde farklı boyama protokolleri tanımlanmış ve protokoller arasında yüksek değişkenlik gösteren dört anahtar bileşen tanımlanmıştır: (1) kullanılan antikor tipleri, (2) otofloresan azaltıcı ajanların kullanımı, (3) antijen elde etme yöntemleri ve (4) geçirgenlik. Bu nedenle, in vitro immünofloresan boyama protokolleri, farklı türler (fare, insan) ve dokular (cilt, bağırsak, akciğer, karaciğer, kalp, omurilik) için uygulanabilir hale getirmek için bu çalışmada sistematik olarak uyarlanmış ve geliştirilmiştir. Fiksasyon ve parafin gömüldükten sonra 3 μm kalınlığındaki kesitler slaytlara monte edildi. Bu örnekler, modifiye bir boyama protokolüne göre miyeloperoksidaz (MPO), sitrüline histon H3 (H3cit) ve nötrofil elastaz (NE) için birincil antikorlarla boyandı. Slaytlar sekonder antikorlarla boyandı ve geniş alan floresan mikroskobu kullanılarak incelendi. Sonuçlar bir değerlendirme formuna göre analiz edildi ve farklılıklar yarı nicel olarak kaydedildi.

Burada, farklı dokular için uygun optimize edilmiş bir NET boyama protokolü sunuyoruz. H3cit için boyama yapmak için yeni bir primer antikor kullandık ve otofloresan indirgeyici bir ajan ile spesifik olmayan boyamayı azalttık. Ayrıca, NET boyamanın sabit bir yüksek sıcaklık ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesini gerektirdiğini gösterdik.

Introduction

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) ilk olarak Brinkmann ve ark. 2004yılında apoptoz ve nekrozdan farklı bir hücresel ölüm yolu olarak 1. Bu yolda, nötrofiller, daha önce granüllerde veya sitozolde depolanan antimikrobiyal proteinlerle kaplı büyük ağ benzeri yapılar oluşturmak için yoğunlaştırılmış kromatinlerini hücre dışı boşluğa bırakırlar. Bu antimikrobiyal proteinler, NET'lerin dolaylı immünofloresan tespiti için yaygın olarak kullanılan nötrofil elastaz (NE), miyeloperoksidaz (MPO) ve sitrüline histon H3'ü (H3cit) içerir2. Bu yöntem sadece bu proteinlerin kantitatif varlığını tanımlamakla kalmaz; gerçekten de, NET benzeri yapıları özel olarak tespit etme avantajına sahiptir. NET'lerde, söz konusu proteinler, her bir boyanmış proteinin ve hücre dışı DNA'nın floresan sinyallerinin üst üste binmesiyle tespit edilebilen hücre dışı DNA ile birlikte lokalize olur. NET'lerde hücre dışı DNA ve protein kolokalizasyonuna bağlı örtüşen sinyallerin aksine, sağlam nötrofiller kolokalizasyon göstermez. Burada, NET bileşenleri genellikle granüllerde, çekirdeklerde ve sitozol3'te ayrı olarak depolanır.

İlk keşflerinden bu yana, NET'lerin başta inflamasyon olmak üzere birçok hastalıkta merkezi bir rol oynadığı gösterilmiştir. NET'ler, kan ve dokudaki hücre dışı patojenleri yakalayıp öldürerek enfeksiyon sırasında antimikrobiyal işlevler gösterir 4,5. Bununla birlikte, NET'ler sistemik lupus eritematozus, romatizmal artrit ve alerjik astım gibi otoimmün hastalıklar ve hiperinflamatuar yanıtlarla da bağlantılıdır 6,7,8. NET'ler aterosklerozda, trombosit yapışmasında vazo-oklüzyon ve inflamasyonu teşvik eder ve metastatik kanserde rol oynadığı tahmin edilmektedir 9,10,11. Bununla birlikte, proinflamatuar sitokin düzeylerini azaltarak anti-inflamatuar özelliklere sahip oldukları düşünülmektedir12. NET'ler daha geniş bir araştırma alanına daha fazla ilgi gösterse de, gelecekteki araştırmalar için sağlam bir NET algılama yöntemi esastır.

İmmünofloresan görüntüleme kullanılarak farklı dokulardaki NET'lerin görüntülenmesi karmaşık ve özelleştirme gerektirse de, elektron mikroskobu dışında, şu anda NET'ler ve hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için en bilinen yöntemlerden biridir ve ağırlıklı olarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda (FFPE) kullanılmaktadır13,14. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar kendi özelleştirilmiş protokollerini kullandığından, NET görüntülemeyi karşılaştırmak zordur. Bu protokoller antikor, antijen alımı veya geçirgenlik yöntemi kullanımlarında farklılık gösterir ve genellikle belirli bir doku tipi için optimize edilmiştir 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Brinkmann ve ark. FFPE dokusunda NET'lerin immünofloresan görselleştirmesini kullanan ilk metodik çalışmayı yayınladıktan sonra, bu protokolü daha geniş bir doku ve tür çeşitliliği için optimize etmek istedik15. Ek olarak, geniş çapta uygulanabilir bir immünofloresan protokolü oluşturmak için, NET'leri tespit etmek için FFPE dokusunda immünofloresan yöntemlerini kullanan çalışmalardan farklı modifiye protokolleri test ettik 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Ayrıca, daha spesifik hücre dışı boyama için yeni bir H3cit antikoru denedik28. Mevcut boyama protokollerini farklı türlere ve dokulara sistematik olarak uyarlayarak, in vitro görüntülemenin geliştirilebileceğini ve bunun sonucunda nötrofiller ve NET'ler arasındaki etkileşimin hem lokal hem de sistemik olarak daha iyi temsil edilebileceğini varsayıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma, Hamburg Eyalet Hayvan Araştırmaları İdaresi, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Almanya (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16) tarafından onaylanan deneylerden elde edilen fare dokularını içermektedir. Kullanılan dokular septik bir modelden fare akciğeri ve kolon ve yanmış deriydi. 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullandık. Tüm deneyler için bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uyulmuştur. Anonimleştirilmiş insan örnekleri, yenidoğan enterokolit, yanmış cilt, biliyer atrezi, spondilodiskit ve miyokard dokularını içeriyordu. Hamburg Tıbbi Araştırma Etik Kurulu'na göre, numunelerin bilgilendirilmiş onam almasına gerek yoktu, ancak çalışma komite tarafından onaylandı (WF-026/21).

1. Örnek fiksasyon

  1. Numune fiksasyonu, dehidrasyon, parafin gömme, kesit alma ve montaj için Abu Abed ve Brinkmann'dan türetilen aşağıdaki protokolü kullanın 3,15.
    1. 40 g paraformaldehiti (PFA) 800 mL Tris tamponlu salin, pH 7.4 (TBS) içinde çözerek% 4 formaldehit çözeltisi hazırlayın.
    2. Karışımı 60 °C'de çeker ocak altında PFA eriyene kadar karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) getirin ve TBS ile ses seviyesini 1.000 mL'ye ayarlayın.
    3. PH'ı 7.4'e ayarlayın. 4 °C'de 2-3 hafta veya -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
  2. Numune fiksasyonu için, taze dokuyu TBS tamponuna yerleştirin ve 20 mm x 30 mm x 3 mm'den daha küçük parçalara ayırın. Doku bölümlerini 12-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine daldırın.
    NOT: Orijinal protokol %2'lik bir PFA çözeltisi ve 8-20 saatlik bir sabitleme süresi kullandı. Bu yöntemle bazı doku kesitleri 20 saat sonra tam olarak fikse edilmediği için PFA konsantrasyonu %4 PFA'ya çıkarıldı.
  3. Numuneleri etiketli doku işleme kasetlerine aktarın. Etiketleme için solvente dayanıklı işaretleyiciler veya kurşun kalemler kullanın.
  4. Kasetleri 1 saat boyunca %70 etanole batırarak numune dehidrasyonunu başlatın. Ardından, her adım 1 saat sürecek şekilde %80 etanol, %90 etanol, %96 etanol ve iki kez %100 etanole daldırın.
  5. Her seferinde 1 saat boyunca iki kez %100 ksilene (dimetilbenzen) ve ardından iki kez 60 °C parafine daldırın.
  6. Montaj için gömme kalıpları kullanın ve kalıbı çıkarmadan önce parafinin katılaşmasına izin verin.
  7. 3 μm kalınlığındaki doku kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın.
  8. Kesilen bölümleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirmek için cımbız kullanın ve doku kesiklerini germek için yüzeyde yüzmelerine izin verin.
  9. Bölümleri yapışkan cam slaytlara (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve gece boyunca 40 °C'lik bir ısı odasında kurumaya bırakın.

2. Örnek rehidrasyon

  1. Deparafinizasyon için, slaytları bir slayt rafına istifleyin ve her biri 5 dakika boyunca ksilen ikame ortamı limonene (Malzeme Tablosu) iki kez ve bir kez 5: 1 limonen / etanol karışımına 1 dakika daldırın.
    DİKKAT: Limonen 50 °C'de yanıcıdır ve alerjik reaksiyonlara neden olabilir. Göz koruması ve eldivenli bir çeker ocak altında kullanın. Açık ateşten uzak tutun.
  2. Kayar rafı iki kez %100 etanole ve bir kez %96 etanole, %90 etanole, %80 etanole ve %70 etanole her biri 5 dakika daldırarak numuneleri azalan bir etanol serisinde yeniden sulandırın.
  3. Kalan etanolü temizlemek için sürgülü rafı 5 dakika boyunca deiyonize suya (DI su) daldırın.

3. Otofloresan bloke etme ve antijen alımı

  1. Veri sayfasına göre pH 6 sitrat hedef alma çözeltisini (TRS) (Malzeme Tablosu) hazırlayın. Bu TRS 10 kez konsantre edilmiştir. Bu nedenle 1:10 oranında DI su ile seyreltin. Plastik bir boyama kavanozunda 96 °C'ye ısıtın.
    NOT: TRS, antijen epitoplarını açığa çıkarmak için numune fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırar. Bu, birincil antikorların hedef antijenlerine bağlanmasına izin verir. Konsantre TRS'yi 2-8 °C'de 8 ay saklayın. Her zaman taze TRS hazırlayın.
  2. Slaytları sürgülü raftan çıkarın ve ıslak bir odaya yerleştirin. Her numuneye bir ila iki damla otofloresan azaltıcı madde (Malzeme Tablosu) pipetleyin. 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Otofloresan azaltıcı ajan, endojen floroforlar ve fiksatiflerin neden olduğu doğal doku otofloresansını bloke eder. Otofloresan azaltıcı ajanı RT'de 1 yıla kadar saklayın.
    NOT: Numunelerin kurumasını veya inkübasyon süresini aşmasını önlemek için yalnızca küçük doku bölümleriyle çalışın.
  3. Slaytları tekrar sürgü rafına istifleyin ve kullanılmayan tüm otofloresan azaltıcı reaktif yıkanana kadar yukarı ve aşağı hareketlerle %60 etanol içinde 1 dakika durulayın.
  4. Sürgülü rafı 5 dakika boyunca DI suya daldırın.
  5. Antijen alımı için, slaytları önceden ısıtılmış TRS ile bir boyama kavanozuna aktarın. Bir su banyosunda 96 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: TRS 96 °C'ye önceden ısıtılırsa ve 96 °C'de 10 dakikalık inkübasyon süresi sağlanırsa, 96 °C'lik su banyosu bir mikrodalga fırın veya buharlı pişirici ile ikame edilebilir.
  6. Boyama kavanozunu çıkarın ve yaklaşık 60-90 dakika RT'ye kadar yavaşça soğumaya bırakın.
    NOT: Protokol burada 4 saate kadar duraklatılabilir ve slaytlar TRS'de bırakılabilir.
  7. TRS'yi çıkarın, ancak slaytları kavanozda saklayın. Kalan TRS kalıntılarını yıkamak için her biri 3 dakika boyunca %0.05 Tween (TBST, pH 7.4) içeren Tris tamponlu salin ile iki kez durulayın.
  8. Geçirgenlik için, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde% 0.2 Triton hazırlayın ve numuneleri 10 dakika geçirgenleştirmek için boyama kavanozuna doldurun.
    NOT: Permeabilizasyon, primer antikorların sabit numunelerdeki hücre içi hedef proteinlere bağlanmasını arttırır.
  9. Slaytları her seferinde 3 dakika boyunca TBST'de iki kez tekrar durulayın.
  10. Islak hazneyi hazırlayın ve slaytları yerleştirin. Slaytlardaki fazla suyu kağıt mendillerle silin. Antikor çözeltisinin akmasını önlemek için her numuneyi hidrofobik bir bariyer kalemle daire içine alın.
    NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. Küçük bölümlerle çalışmak en iyisidir.

4. Spesifik olmayan antikor bağlanmasının engellenmesi

  1. Eşek serumu (Malzeme Tablosu) ile kullanıma hazır engelleme solüsyonu alın ve her numuneye bir damla pipetleyin. RT'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Bu bloke edici adım, ikincil antikorun numune üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerine bağlanmasını en aza indirir. Bu spesifik olmayan epitopları bloke ettikten ve birincil antikoru uyguladıktan sonra, ikincil antikor birincil antikora bağlanacak ve dokunun yüzeyi ile etkileşime girmeyecektir. Bu kullanıma hazır bloke edici reaktif, 6 ay boyunca 2-8 °C'de saklanır.
  2. Kızakların kenarını sert bir yüzeye vurarak fazla engelleme solüsyonunu slaytlardan çıkarın. Onları durulamayın.

5. Birincil antikor

  1. Antikor seyreltme tamponundaki primer antikorları seyreltin (Malzeme Tablosu). Her numune için yaklaşık 100 μL nihai çözelti kullanın. NE ve H3cit (R8) antikoru ve izokontrolü için 5 μg/mL'lik bir konsantrasyona seyreltin. MPO ve karşılık gelen izokontrol için 10 μg/mL kullanın. Her primer antikor için bir tüp ve her izokontrol antikoru için bir tüp hazırlayın.
    NOT: H3cit (R8)/MPO veya NE/MPO ve bunların izokontrolleri NET'lerin boyanması için birleştirilebilir. H3cit (R8)/MPO kombinasyonu için, H3cit (R8) için 5 μg/mL ve MPO için 10 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. NE / MPO için, NE için 5 μg / mL ve MPO için 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona, numune başına 100 μL'lik bir nihai hacme seyreltin. İzokontrol için, karşılık gelen her bir antikor ile aynı konsantrasyonu kullanın. Kullanılan her antikor için her zaman yeni bir pipet ucu kullanın. Primer antikorlar 4 °C'de 1-2 hafta ve −20 °C veya −80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  2. Bir slaytta iki numune ile, izokontrol antikorları için bir tane ve MPO / H3cit veya MPO / NE antikor seyreltmesi için bir tane kullanın. Her numune için yaklaşık 100 μL kullanın ve antikor solüsyonunu eşit şekilde yayın.
    NOT: Numunelerin kurumasına izin vermeyin. İzokontrol ve primer antikorları karıştırmaktan kaçınmaya dikkat edin.
  3. Islak bir odada gece boyunca 4 °C'de saklayın.
  4. Ertesi gün, slaytlardaki fazla primer antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları bir küvette istifleyin. Kalan primer antikor solüsyonunu yıkamak için her seferinde TBST ile 5 dakika boyunca üç kez durulayın.

6. İkincil antikor

  1. İkincil antikor çözeltisini hazırlayın. İki farklı floresan sekonder antikor kullanın: MPO için eşek anti-keçi ve H3cit boyama için eşek anti-tavşan. Her birini antikor seyreltme tamponu ile 7.5 μg/mL konsantrasyona seyreltin (Malzeme Tablosu).
    NOT: Çift boyama için, farklı uyarma alanlarına ve minimum spektral örtüşmeye sahip iki floresan antikor kullanın. Her iki ikincil antikoru birleştirin ve numune başına 100 μL'lik bir nihai hacim için her bir antikor için 7.5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Antikorları ışıktan koruyun. İkincil antikorlar 2-8 °C'de 6-8 hafta veya -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  2. Slaytları ıslak odada tutun ve her numuneye 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika inkübe etmelerine izin verin ve ışıktan koruyun.
  3. Fazla ikincil antikor solüsyonunu hafifçe vurun ve slaytları sürgülü rafa istifleyin. Kalan bağlanmamış antikorları yıkamak için PBS ile dolu bir boyama kavanozuna her biri 5 dakika boyunca üç kez daldırın.
  4. DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve DI su ile 1 μg/mL konsantrasyona seyreltin. Sürgülü rafı DAPI solüsyonu ile bir boyama kavanozuna daldırın ve karanlıkta RT'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: DAPI, çift sarmallı DNA için floresan lekesi olarak kullanılır. Hazırlanan DAPI çözeltisi birden çok kez kullanılabilir. Hazırlanan DAPI çözeltisini RT'de saklayın. DAPI konsantresi −20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
  5. Fazla DAPI solüsyonunu yıkamak için sürgülü rafı 5 dakika boyunca PBS'li bir boyama kavanozuna daldırın.

7. Numunelerin montajı ve saklanması, mikroskobik analiz

  1. Numuneleri lameller ve montaj ortamı ile monte edin (Malzeme Tablosu).
    NOT: Yalnızca az miktarda montaj ortamı kullanın ve fazla ortamı ıslak mendillerle silin. Eldiven giyin ve lameller veya slaytlardan herhangi bir ortamı yanlışlıkla silmekten kaçının. Kabarcık oluşumundan kaçının ve slaytlardaki kabarcıkları gidermek için lamellere hafifçe bastırmak için pamuklu çubuklar kullanın.
  2. Görüntüleme için geniş alan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın.
    NOT: Önce izokontrolün bir görüntüsünü alın. Floresan filtrelerin (DAPI için mavi filtre hariç) maruz kalma süresini neredeyse hiç sinyal algılanmayana kadar azaltın. Ardından, ilgili örnekleri incelemek için bu ayarı kullanın. Floresan kanalını kullanarak her bir numunede bir floresan sinyalinin tespit edilebileceği alanları arayın. Alanın bir görüntüsünü aldıktan sonra, program tüm kanalların bileşik bir görüntüsünü oluşturur ve farklı floresan sinyallerini farklı renklerin üst üste binmesi olarak gösterir. Görüntü daha sonra ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla birlikte yerelleştirme için daha fazla analiz edilebilir.
  3. Slaytları 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol optimizasyonumuza başlamadan önce, NET'lerin immün boyanması için FFPE dokusu kullanan çalışmalar için PubMed'de arama yaparak başarılı boyama için temel adımları belirledik ve protokollerini karşılaştırdık. En umut verici protokol farklılıkları, protokol optimizasyonu için anahtar adımlar olarak belirlenirken, çoğunlukla birbirine karşılık gelen adımlar değiştirilmemiştir (Tablo 1).

Tablo 1: NET'lerin FFPE immün boyaması için PubMed Araştırması. Bu tablo, incelenen çalışmalarda immün boyama protokolündeki değişkenleri göstermektedir. Kullanılan protokoller temel adımlarına bölündü ve daha sonra birbirleriyle karşılaştırıldı. En umut verici farklılıklara sahip adımlar daha sonra optimizasyon için temel adımlar olarak atıldı ve protokolümüze uyarlandı. Primer antikorun inkübasyon süresi (gece boyunca, 4 °C) gibi çoğunlukla birbirine karşılık gelen adımlar değişmedi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bulgularımıza dayanarak, epitopları hedeflemek için seçilen antikorların ilk kritik adım olduğu sonucuna vardık. En az 10 farklı protokolde triH3cit antikoru kullanılmıştır (bakınız Tablo 1; Birincil antikor kolonu). Bununla birlikte, Thålin ve ark. H3cit (R8) klonunun, sitrüline olmayan histonlara karşı daha az hedef dışı çapraz reaktivite gösterdiğini ve ihmal edilebilir lotlar arası değişkenlik gösterdiğini buldu. Bu nedenle triH3cit ve H3cit (R8) boyama sonuçlarını birbirleri ile karşılaştırmaya karar verdik28.

Dört çalışmada insan / fare MPO antikoru kullanıldı. Ayrıca, fare dokusu için MPO (2D4) ve insan dokusu için MPO (2C7) uygulanan diğer iki protokol (bakınız Tablo 1; Birincil antikor kolonu). Bu nedenle, MPO'yu (2C7) insan dokuları için insan/fare MPO antikoru ve MPO'yu (2D4) fare dokuları için insan/fare MPO antikoru ile ayrı ayrı karşılaştırdık. NE, en az beş farklı antikor kullanılarak tespit edildi, ancak bunlardan sadece üçü sağlanan görüntülerde iyi boyama sonuçları gösterdi. Bununla birlikte, bir antikor artık piyasada mevcut değildi, bu nedenle insan dokularındaki test serimiz için bir tavşan konakçısından alınan NE antikorunu bir fare konakçısından alınan antikorla karşılaştırdık. Fare örnekleri için, bu çalışmanın başlangıcında tavşan konakçısında ortaya çıkan NE antikoruna mevcut ve güvenilir bir alternatif yok gibi görünüyordu. Bir NE ve her iki H3cit antikoru aynı tavşan konakçısından türetildiğinden, bu protokolle çift boyama için birleştirilemezler. İkincil antikor, yükseltildiği konakçı tarafından belirlenen birincil antikorun sabit bölgesine özgüdür. Aynı konakçıdan türetilen iki primer antikor kullanılırsa, sekonder antikor her iki primer antikora bağlanabilir ve boyama spesifik olmaz. Bununla birlikte, tek boyamaya göre çift boyama tercih edilir, çünkü daha fazla NET bileşeni tespit edilebilir ve birlikte lokalize edilebilir. Bu nedenle, boyama sonucu daha spesifik olacaktır. Sonuç olarak, daha sağlam bir algılama protokolü elde etmek için H3cit ve MPO için çift boyama yaptık.

Kullanılan antikorlardaki benzerliklere rağmen, antikorlar için dilüsyonlar neredeyse tüm protokollerde değişmiştir; örneğin, triH3cit için konsantrasyon aralığı 0,5 μg/mL ila 20 μg/mLarasındaydı 17,18. Kullanılan her antikor için farklı dilüsyonlar denedik ve literatürde bildirilen tüm aralıkta tatmin edici boyama sonuçları elde ettik.

Ayrıca, primer antikorun inkübasyon süresi (gece boyunca 4 °C'de) ve sekonder antikorun kullanımı ve seyreltilmesi konusunda birçok benzerlik bulunabilir (bakınız Tablo 1; İnkübasyon primer antikor kolonu). Bu nedenle, test serimizde bu adımları değiştirmedik ve yukarıda açıklanan protokole göre gerçekleştirdik.

Literatürden belirlenen bir sonraki kritik adım antijen alımıydı. Bu adım önemlidir, çünkü formalin fiksasyonu nedeniyle, antikorların epitopları, doku bölümünün uygun bir tampondaısıtılmasıyla tersine çevrilebilen metilen köprüleri yoluyla maskelenir 29. pH 6'da sitrat TRS ve pH 9'da EDTA TRS tamponu literatürde eşit sıklıkta kullanılmış ve benzer sonuçlar vermiştir (bakınız Tablo 1; TRS tampon sütunu). Bu nedenle, test serimiz için pH 6 sitrat TRS'de karar kıldık. Antijen alımı için iki farklı ısıtma yöntemini test ettik: bir mikrodalga (önce 360 W'ta 1 dakika ve ardından 90 W'ta 9 dakika) ve bir su banyosu (90 dakika boyunca 60 ° C, 10 dakika boyunca 96 ° C).

Literatürde bir miktar değişkenlik gösteren son adım, Triton X-100 ile geçirgenlikti. Bu adım optimizasyon gerektiriyordu çünkü deterjan tedavisi ile hücre zarı antikorlara karşı geçirgen hale geliyor ve hücre içi epitoplaraulaşılabiliyor 30. Önceki protokoller %1 ila %0.1 arasında değişen farklı Triton X-100 konsantrasyonları kullanıyordu (bakınız Tablo 1; Geçirgenlik sütunu). Bu nedenle, iki Triton X-100 konsantrasyonu (%0.2 ve %0.5) ve Triton geçirgenliği olmayan bir seri denedik.

Bu önemli adımları belirledikten sonra bunları değiştirdik ve protokolü optimize etmeye çalıştık. Daha sonra görüntüler bir değerlendirme kağıdına göre incelendi ve farklılıklar yarı kantitatif olarak kaydedildi ve karşılaştırıldı (bkz. Tablo 2).

Tablo 2: Protokol adımlarını optimize etmek için sonuç tablosu. Bu tablo, uyarlanan adımların sonuçlarını göstermektedir: otofloresan azaltıcı ajan, antijen alımı ve geçirgenlik. Bu test serisine başlamadan önce, en iyi antikor kombinasyonunu ve konsantrasyonunu test ettik. Slaytlar 10 farklı alanda değerlendirildi ve daha sonra negatif bir sonuç için (-) 'den pozitif NET içeren bir sonuç için (++) 'ye kadar bir temsili alan puanlandı. Kısmen pozitif sonuçlar, nötrofil olmayan hücrelerin daha yüksek bir diffüz arka plan boyamasını içeriyordu. Kısaltmalar: n/u = kullanılmaz; - = olumsuz sonuç; +/- kısmen pozitif boyama; + = orta derecede spesifik boyama; + = NET'lerin ve nötrofillerin iyi boyanması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Birincil antikorlar
Protokolü uyarlamadan önce en iyi antikor kombinasyonunu bulmaya çalıştık. Burada, triH3cit, H3cit'den (R8) daha fazla hücre içi histon boyaması gösterdi. NET'leri saptamak için protokol optimizasyonumuz için H3cit (R8) antikorunu kullanmaya karar verdik. Bu antikor sadece hücre dışı H3cit'e bağlandı ve bu konsantrasyonda hücre içi H3cit boyanması göstermedi (bkz. Şekil 1A, B).

MPO boyama için, insan / fare MPO antikorunu insan dokusu için MPO (2C7) (bkz. Şekil 1C, D) ve fare dokusu için MPO (2D4) (bkz. Şekil 1E, F) ile karşılaştırdık. MPO (2D4) ve MPO (2C7) antikorları, çoklu doku tipleri için tutarlı boyama elde edemezken, insan / fare MPO'su MPO için güvenilir, iyi boyama ile sonuçlandı. Bu nedenle, boyama protokolümüz için insan/fare MPO'sunu seçtik.

NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE antikorunun güvenilir boyanmasına kıyasla beş örnekten sadece birinde NE boyaması gösterdi. Ek olarak, bir tavşan konakçısından alınan NE antikoru, insan ve fare dokusuna uygulanabilir. (bkz. Şekil 1G,H).

Figure 1
Şekil 1: Farklı dokularda primer antikor karşılaştırması. (A) İnsan yenidoğan enterokolit (NEC) dokusu H3cit (R8) (kırmızı) ile boyanmıştır. Burada sadece hücre dışı bir sinyal tespit edilebilir. (B) Aynı doku triH3cit (R2,8,17) (kırmızı) ile boyanmıştır. Bu antikor, sitrüline histonların (sarı oklar) yoğun hücre içi boyanması ile daha geniş bir sinyal oluşturur. (C,E) İnsan NEC dokusu (C) ve fare volvulus dokusu (E), H3cit (R8) (kırmızı) ve fare / insan MPO (yeşil) için iyi boyama. H3cit, MPO ve DAPI (mavi) sinyal birlikte lokalizasyonu NET oluşumunu (beyaz oklar) gösterir. (D,F) Buna karşılık, (D) insan NEC dokusu için MPO (2C7) ve fare volvulus dokusu için (F) MPO (2D4) (yeşil) kullanılarak, MPO sinyali elde edilemedi. (G) Bir tavşan konakçıdan (macenta) alınan NE antikoru için çok güçlü boyama ile yanmış insan derisi örneği, bir fare konakçısından alınan NE antikoru için (H) negatif boyama sonucuna kıyasla. İzotip kontrolü için Ek Şekil İzokontrol 1'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Deparafinizasyon
Burada, ksilen, arka planda daha az otofloresan ile doku örneklerinin ksilene kıyasla daha iyi deparafinizasyonuna eşdeğer olan limonen ile değiştirildi (bkz. Şekil 2A, B).

Otofloresan azaltıcı ajan
Sudan Black bazlı kullanıma hazır otofloresan azaltıcı ajan 2-20 dakika boyunca uygulanabilir. Burada 0 dk, 5 dk ve 10 dk uyguladık. Herhangi bir engelleme kullanılmadığında, bazı fare örnekleri daha spesifik olmayan boyama gösterdi ve kısmi pozitif boyamaya ulaşılabildi (bkz. Şekil 2C). 5 dakikalık engelleme süresi, fare akciğer ve cilt dokusunda H3cit ve MPO hariç tüm doku tiplerinde iyi sonuçlar göstermiştir (bakınız Tablo 2). Bazı örneklerde 10 dakikalık engelleme süresinde, boyama daha az parlak olmaya başladı, bu nedenle 5 dakikalık zaman dilimi otofloresansı engellemek için en iyi seçimdir (bkz. Şekil 2D, E).

Figure 2
Şekil 2: Deparafinizasyon yöntemleri ve otofloresan indirgeyici ajanın kullanımı. (A) Limonen ile deparafine edilmiş ve H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için boyanmış insan spondilodiskit dokusu. Sinyallerin örgülü oluşumu ve kısmi birlikte lokalizasyon, NET'lerin varlığını gösterir (beyaz ok). (B) Aynı doku numunesi, ksilen ile deparafinleştirilmiş, benzer boyama sonuçları ile sonuçlanmıştır, bu da yaygın olarak kullanılan ksilenin bir ikame ortamı ile ikame edilebileceğini gösterir. (C-E) Otofloresan indirgeyici ajan için farklı inkübasyon süreleri kullanıldığında farklı NE boyama paternleri (macenta) gösteren indüklenmiş sepsis sonrası fare akciğer dokusu. Otofloresan düşürücü kullanılmadığında, görüntü C hala eritrositlerin hafif bir arka plan boyamasını göstermektedir (kırmızı ok). Buna karşılık, resim D, bir otofloresan indirgeyici ajan ile 5 dakikalık inkübasyondan sonra net bir sinyal yayıldığını göstermektedir. 10 dakika sonra, görüntü E'deki boyama kalitesi düşer ve sinyal daha az parlak hale gelir. İzotip kontrolü için Ek Şekil İzokontrol 2'ye bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antijen elde etme yöntemleri
NE boyama için, numuneleri pH 6 sitrat tamponunda mikrodalgada 10 dakika (önce 360 W'da 1 dakika ve daha sonra 90 W'da 9 dakika), 96 °C'de bir su banyosunda 10 dakika veya 60 °C'de bir su banyosunda 90 dakika ısıttık. Burada, mikrodalga ve su banyosundaki daha yüksek sıcaklıklar, sürekli olarak orta ila iyi antijen alımı gösterdi (bkz. Şekil 3A). Mikrodalga ve 96 °C su banyosu arasında önemli bir fark bulunmamıştır (bakınız Tablo 2). Ayrıca, 60 °C'lik bir su banyosunda, lekelenmenin sadece kısmen pozitif olduğu veya hiç lekelenme olmadığı gösterilmiştir (bkz. Şekil 3B). Sadece insan ileumu ve insan miyokardları iyi spesifik sonuçlar gösterdi. 60 °C su banyosu ile NE için yeterli boyama elde edilemediğinden, H3cit ve MPO için 60 °C su banyosu test serisi atıldı.

MPO ve H3cit ile çift boyama için, numuneleri pH 6 sitrat tamponunda mikrodalgada 10 dakika (önce 360 W'ta 1 dakika ve ardından 90 W'da 9 dakika) veya 96 ° C'de bir su banyosunda 10 dakika ısıttık. Burada, her iki yöntem de 96 °C su banyosu için biraz daha olumlu sonuçlarla iyi spesifik sonuçlar göstermiştir (bkz. Şekil 3C). Sadece fare akciğeri ve cilt dokusu orta düzeyde bir genel sıralama elde edebilir (bakınız Tablo 2).

Bununla birlikte, 96 ° C'de 40 dakikalık inkübasyon süresinin aşılması, daha az yoğun antikor boyaması ile sonuçlanırken, önemli ölçüde daha fazla arka plan boyaması gözlenebildi (bkz. Şekil 3D).

Figure 3
Şekil 3: Antijen elde etme yöntemleri. (A) Isı alımı için 96 ° C'de 10 dakikalık bir inkübasyon süresi kullanılarak NE (macenta) için boyanan fare volvulus dokusu, numuneyi 60 ° C'lik bir su banyosunda 90 dakika inkübe ederken (B)'den önemli ölçüde daha güçlü bir sinyal gösterir. (C) Ayrıca, 96 ° C antijen alımında 10 dakikalık inkübasyon, kombine NET boyama (beyaz oklar) ile H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için güçlü bir sinyal ile sonuçlanır. D: Bununla birlikte, numunelerin 40 dakikadan fazla kaynatılması, daha az spesifik hücre dışı H3cit boyaması ve MPO boyaması olmaması ile sonuçlanır. İzotip kontrolü için Ek Şekil İzokontrol 3'e bakınız. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Geçirgenlik
Numuneleri Triton X-100 ile iki seyreltmede (%0.2 ve %0.5) 10 dakika geçirgen hale getirmeyi denedik ve bunu deiyonize suda 10 dakika ile karşılaştırdık. Burada, %0.2 Triton ile 10 dakika, %0.5 Triton ve deiyonize su koşullarına kıyasla farklılıklar küçük olmasına rağmen, tüm doku tiplerinde iyi sonuçlar elde etti (bakınız Tablo 2).

Ek Şekil İzokontrol 1: Şekil 1 için izotip kontrolleri. Tüm görüntüler iyi DAPI (mavi) boyama gösteriyor, ancak floresan antikor için sinyal yok. Bu, Şekil 1'deki primer antikorların bağlanmasının hedef antijene özgü olduğunu ve spesifik olmayan bağlanma veya protein etkileşimlerinin bir sonucu olmadığını doğrular. (A) H3cit (R8) (kırmızı) için izokontrol antikoru ile boyanmış insan yenidoğan enterokolit (NEC) dokusu. (B) H3cit (R2,8,17) (kırmızı) için izokontrol antikoru ile boyanmış NEC dokusu. (C) NEC dokusu (E) ve fare volvulus dokusu, H3cit (R8) (kırmızı) ve fare / insan MPO (yeşil) için izokontrol antikorları ile boyanmıştır. (D) H3cit (R8) (kırmızı) ve MPO (2C7) (yeşil) için izokontrol antikorları ile boyanmış NEC dokusu. (F) H3cit (R8) (kırmızı) ve MPO 2D4 (yeşil) için izokontrol antikorları ile boyanmış fare volvulus dokusu. G: Bir tavşan konakçısından (macenta) alınan NE antikoru için izokontrol antikoru ile boyanmış yanmış insan derisi örneği. (H) Bir fare konakçısından (macenta) alınan NE antikoru için izokontrol antikoru ile boyanmış aynı doku. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil İzokontrol 2: Şekil 2 için izotip kontrolleri. Tüm görüntüler iyi DAPI (mavi) boyama gösteriyor, ancak floresan antikor için sinyal yok. Bu, Şekil 2'deki primer antikorların spesifik bağlanmasını doğrular. C-E görüntüleri, uzun pozlama süreleri nedeniyle hala macenta renkte bir miktar arka plan lekesi gösteriyor. Bununla birlikte, Şekil 2'deki NE sinyali, arka plan boyamadan ayırt edilebilir. (Bir) İnsan spondilodiskit dokusu limonen ile deparafine edilmiş ve H3cit (R8) (kırmızı) ve fare / insan MPO (yeşil) için izokontrol antikorları ile boyanmıştır. (B) Aynı doku örneği ksilen ile deparafinlenmiş ve H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikorları ile boyanmıştır. (C) Fare akciğer dokusu, otofloresan azaltıcı ajan kullanılmadan NE (macenta) için izokontrol antikoru ile boyandı. (D) Aynı doku, NE (macenta) için izokontrol antikoru ve bir otofloresan indirgeyici ajan ile 5 dakikalık inkübasyon ile boyandı. (E) NE (macenta) için izokontrol antikoru ile boyanmış aynı doku ve bir otofloresan indirgeyici ajan ile 10 dakikalık inkübasyon. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil İzokontrol 3: Şekil 3 için izotip kontrolleri. Tüm görüntüler iyi DAPI (mavi) boyama gösterir, ancak floresan antikoru için spesifik bir sinyal yoktur. Bu, Şekil 3'teki primer antikorların spesifik bağlanmasını doğrular. (A) Isı alımı için 96 ° C'de 10 dakikalık bir inkübasyon süresi kullanılarak NE (macenta) için izokontrol antikoru ile boyanmış fare volvulus dokusu. (B) Aynı doku, NE (macenta) için izokontrol antikoru ile boyanır ve 60 ° C'lik bir su banyosunda 90 dakika boyunca ısı alımı. (C) H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikoru ile boyanmış aynı doku ve A'dakiyle aynı ısı alma koşulları. Yeşil nokta, toplanmış ikincil antikorların boyama artefaktını gösterir. (D) Aynı doku, H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikoru ile boyanmış ve ısı alımı için 96 ° C'de 40 dakikalık bir inkübasyon süresi kullanılmıştır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil İzokontrol 4: Şekil 4 için izotip kontrolleri. Aşağıdaki tüm izokontroller, karşılık gelen "başarısız" deneyle aynı slayttandır. Başarısız girişimler kasıtlı olarak yapılmadı, bu nedenle numune kullanılmamışken bazı izokontroller kullanılabilir görünüyor. (A) H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikoru ile boyanmış NEC dokusu. Bu numune kurumadan daha hızlı işlendi. Bu nedenle, aşırı arka plan lekelenmesi görünmez. Yeşil ve kırmızı yapılar ikincil antikor agregatlarıdır. (B) Spondilodiskit dokusu NE (macenta) için izokontrol antikoru ile boyanmıştır. Burada deparafinizasyon başarılı oldu, bu nedenle parafin kalıntısı görülmüyor. (C) NEC dokusu H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikoru ile boyandı. Aynı yanlış depolanmış ikincil antikorlar kullanılmış olsa bile, bu izokontrol görüntüsü için herhangi bir boyama beklenmezdi. Bu nedenle, bu görüntü ilgili görüntünün belirli bağlamasını değerlendirmek için kullanılamaz. (D) Yanmış insan derisi, H3cit (kırmızı) ve MPO (yeşil) için izokontrol antikoru ile boyanmıştır. Burada montaj daha dikkatli yapıldı ve hava kabarcıklarından ışık saçılımı görülmüyor. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, gerçek boyama işleminden başlayarak, NET'lerin görüntülenmesi için mevcut protokolleri daha fazla doku tipine uyarlamayı ve optimize etmeyi amaçladık. Bu yöntem için ilk kritik adım, en uygun antikorların seçilmesidir. NE için, insan dokusu üzerinde bir fare konakçısından bir NE antikoru denedik, bu da bir tavşan konakçısından alınan NE'ye kıyasla güvenilir bir lekelenme göstermedi. Ayrıca, Thålin ve ark. hücre dışı boyama için daha spesifik bir antikor olarak H3cit (R8) önerdi. Bu antikoru yaygın olarak kullanılan triH3cit (R2, R8, R17) ile karşılaştırdık. Çalışmamız, H3cit (R8) antikorunun, kullanılan konsantrasyonlarda sadece hücre dışı bir sinyal için boyandığını ve lamlar üzerindeki NET'lerin daha kolay tanınmasını sağladığını göstermiştir. Bu bulgu, Thålin ve ark. H3cit (R8) klonunun, sitrüline olmayan histonlara karşı azaltılmış hedef dışı çapraz reaktivite ile iyi bir NET sinyali sağlayabileceği28. Ayrıca MPO boyama için insan ve fare dokusu için MPO antikorlarını karşılaştırdık. Sonuçlarımız, fare / insan MPO antikorunun daha güvenilir boyama gösterdiğini ve insan ve fare örneklerinde aynı anda kullanılabileceğini ve laboratuvarda kullanımını basitleştirdiğini göstermektedir. Sonuç olarak, bu antikor kombinasyonunu, H3cit (R8) ve fare / insan MPO'sunu gelecekteki araştırmalar için kullanmanızı ve protokolümüzde uygulamanızı öneririz.

Bununla birlikte, bu antikor seçimi ile çoklu boyama girişimleri için bir sınırlama vardır. Bu protokol, farklı konakçılardan alınan primer antikorları kullanacak şekilde değiştirildi. Aksi takdirde, bir ikincil antikor her iki birincil antikora da bağlanabilir. H3cit antikoru, NE antikoru ile aynı konakçıdan gelir, bu nedenle NE ve H3cit'i birlikte boyayamadık. Bu çalışmada üçlü boyama (NE, H3cit, MPO) yapılmamış olsa da, bu protokol gelecekte üçlü boyama deneyleri için bir temel oluşturabilir. Üçlü boyama veya NE ve H3cit çift boyama için olası bir seçenek, bu antikorlardan birini farklı bir konakçıdan güvenilir bir antikorla değiştirmek olabilir. Bu durumda, olası bir kombinasyon ortağı, Knackstedt ve ark.24 tarafından kullanılan koyunlardan alınan NE antikoru (Santa Cruz; sc-55549) olabilir. Duler ve ark. 2021'de yayınlandı, burada ardışık bir çift boyama yöntemi kullandılar ve bir tavşan konakçısından NE ve H3cit'i birleştirdiler26. Çoklu boyama yönteminin umut verici bir başka uygulaması da intravasküler ve ekstravasküler NET oluşumu arasındaki ayrımdır. NET belirteçleri için üçlü boyama yerine, çift NET boyama ek vasküler boyama ile birleştirilebilir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı gibi spesifik hastalıkların patomekanizmaları hakkında daha fazla bilgi edinmek için NET'lerin intravasküler ve ekstravasküler dağılımını inceleyen çalışmaların sayısı giderek artmaktadır. Smyth ve ark.31 , iki olası lokalizasyon arasında ayrım yapmak için bizimkine benzer umut verici ve derinlemesine bir protokol tanımladı. Endotel hücrelerini etiketlemek için biyotinillenmiş bir lektin ekleyerek mevcut NET boyama protokollerini değiştirdiler ve lektinin immünofloresan boyaması için florofor konjuge streptavidin kullandılar. Aynı görüntüde lektin ve NET belirteçlerinin birlikte lokalizasyonunu inceleyerek intravasküler NET'leri tanımlayabildiler31. Bu bağlamda, protokolümüzün uygulamasının yaygınlaştırılması için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

En uygun antikor kombinasyonunu bulduktan sonra, bir sonraki kritik adım, bir otofloresan azaltıcı ajanın eklenmesidir. Formaldehit fiksatifleri kullanılarak numune fiksasyonu gibi eksojen faktörler ve eritrositler gibi endojen faktörler yüksek otofloresansa neden olabilir ve bu da birlikte lokalizasyonun belirlenmesini zorlaştırır32. Bu sorun esas olarak mavi (uyarma alanı: 430-480 nm) ve yeşil floresan spektrumlarında (uyarma alanı: 500-550 nm) ortaya çıkar ve aynı uyarma alanına sahip bir floresan antikoru kullanıldığında sonuçsuz boyama sonuçlarına neden olabilir3. Literatür, Sudan Black'in doğal doku otofloresansını azaltmak için etkili bir ajan olduğunu bildirmektedir33. Sudan Siyahı, mavi veya yeşil floresan kanallarını kullanarak daha net boyama sonuçları elde etmeyi mümkün kılar. Bu uyarma alanı, gelecekteki çoklu boyama girişimleri için gerekli olacaktır, çünkü dördüncü bir floresan boya kullanılırken mavi ve yeşil kanallara ihtiyaç vardır. Çalışmamız, optimum inkübasyon süresinin, boyama işleminde kullanılan doku tipine ve antikorun türüne bağlı olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, bu çalışmada, 5 dakikalık otofloresan indirgeyici ajan genellikle tüm doku tiplerinde iyi sonuçlar verdi ve numuneyi siyaha boyama avantajına sahipti, böylece slaytlarda görmeyi kolaylaştırdı. Bu da özellikle küçük örneklerle boyama işleminde dokuların eksik kalan kısımlarının oluşmasını engelledi.

Bu protokolün başarısı için bir diğer önemli faktör, antijen alma adımı için sabit bir yüksek sıcaklıktır. Araştırmamız, önceki 15 çalışmanın 10'unun antijen alımı için 96 °C'nin üzerindeki sıcaklıkları kullandığını gösterdi 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Bu, numunelerin 96 ° C'lik bir su banyosunda veya mikrodalgada inkübe edilmesinin önemli bir fark olmadan iyi sonuçlar verdiği sonuçlarımızla tutarlıydı. Bununla birlikte, eşit ısı dağılımı için bir su banyosu kullanmanızı öneririz. Mikrodalgayı kullanırken, boyama kavanozunun üst ve alt kısmı arasında tamponda 5 °C'ye kadar bir sıcaklık gradyanı bulduk. Ek olarak, su banyosunun kullanımı daha kolaydır ve tamponun kaynama riski daha düşüktür. Geçirgenlik için, Triton X-100'ün boyama üzerinde daha az etkisi olduğunu bulduk. Bu nedenle, protokoldeki bu adımı atlamak, sonucu olumsuz etkilemeden mümkündür. Genel olarak, insan örnekleri fare örneklerinden daha iyi sonuçlar verdi. Bunun bir nedeni, insanların farelerden daha yüksek bir nötrofil yüzdesine sahip olması olabilir34,35. Ek olarak, fare akciğer örnekleri görünür makroskopik inflamasyon ve daha az nötrofil gösterirken, fare bağırsak örnekleri makroskopik olarak iltihaplandı ve iyi boyama sonuçları gösterdi. Bu nedenle, çalışmamızdaki düşük puanlar, protokolün en iyi şekilde çalışmamasından değil, düşük inflamasyondan kaynaklanmış olabilir.

Sorun giderme için, protokoldeki küçük hatalar veya numunelerin dikkatli bir şekilde kullanılmaması, boyama sonuçları üzerinde büyük etkilere sahip olabilir. Tespit ettiğimiz önemli bir sorun, numune dehidrasyonuydu. Burada, aynı anda 10-15'ten fazla slaytı işlemenin kritik olduğunu gördük çünkü her adım zaman alıcıdır ve numunelerin dehidrasyonuna neden olabilir. Susuz numuneler, yüksek arka plan lekelenmesi ve tespit edilebilir spesifik floresan sinyali olmaması nedeniyle artık kullanılamaz (bkz. Şekil 4A). Ek olarak, boyama protokolüne başlamadan önce numuneler tamamen deparafinleştirilmelidir. Parafin kalıntısı güçlü bir arka plan sinyali ile sonuçlandı ve lekeli parafinde kesme çizgileri görülebiliyordu (bkz. Şekil 4B). Ayrıca, 20'den fazla donma-çözülme döngüsünden sonra, MPO'ya ikincil antikor için hiçbir sinyal tespit edilemedi (bkz. Şekil 4C). Görüntü kalitesi üzerinde büyük etkisi olan bir diğer önemli adım, son montaj adımının ele alınmasıdır. Bu çalışmada, lamel altındaki hava kabarcıkları, floresan sinyalin saçılmasına ve dolayısıyla bulanık bir görüntüye neden oldu (bkz. Şekil 4D).

Figure 4
Şekil 4: Sorun giderme ipuçları. (A) Bu panel, kurumuş bir numunenin sonucunu gösterir. Düz kırmızı arka plan boyama, numunenin herhangi bir şekilde değerlendirilmesini engeller. (B) Burada kırmızı ok, yetersiz bir deparafinizasyondan sonra oluklu görünüm ile karakterize edilen parafin kalıntılarını göstermektedir. Bu kalıntılar, yüksek arka plan sinyaline ve daha düşük kaliteli görüntülere neden olur. (C) Yetersiz antikor depolaması veya 20'den fazla donma-çözme döngüsü, ikincil antikorun (yeşil oklar) toplanmasına ve MPO'ya bağlanmamasına neden olur. (D) Dikkatli yapılmayan montaj, hava kabarcıklarına ve dolayısıyla floresan ışığının (mavi ok) saçılmasına neden olabilir. Bu, özellikle saçılma hedefi bulanıklaştırdığında görüntü kalitesini önemli ölçüde etkileyebilir. İzotip kontrolü için Ek Şekil İzokontrol 4'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NET'ler bilimsel araştırmalarda giderek daha fazla popülerlik kazanmasına rağmen, NET saptama yöntemlerine odaklanan yeterli çalışma yoktur 3,13,17,26. Bildiğimiz kadarıyla, FFPE dokusunda NET'lerin immünofloresan görüntülemesi için farklı çalışmalardan elde edilen protokolleri karşılaştıran ilk çalışmayı sunuyoruz. Daha önce yayınlanmış özelleştirilmiş protokoller, antikor veya antijen elde etme yöntemlerinde farklılık gösteriyordu ve genellikle sadece bir doku tipi için tasarlandı, bu da NET görüntüleme sonuçlarının karşılaştırılmasını zorlaştırdı. Bu nedenle, bu çalışmada kritik adımları belirledik ve farklı fare ve insan dokularına uygun bir protokol oluşturduk. Bunu, H3cit boyaması için yeni bir primer antikor kullanarak ve otofloresan azaltıcı bir ajan ile arka plan boyamasını azaltarak başardık. Ayrıca, sabit bir yüksek sıcaklığın çok önemli olduğunu ve numunelerin dikkatli bir şekilde işlenmesinin başarılı NET boyama için temel olduğunu gösterdik. Bu nedenle, bu çalışma NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol geliştirmek için gerekli adımları sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu araştırma Alman Araştırma Derneği (BO5534) tarafından kurulmuştur. Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer ve PD Dr. Ingo Königs'e bize örnekler sağladıkları için teşekkür ederiz. Ek olarak, yazarlar immünofloresan mikroskobu ile ilgili destek için UKE Mikroskopi Görüntüleme Tesisi (Çekirdek tesis, UKE Tıp Fakültesi) ekibine teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Tags

İmmünofloresan Görüntüleme Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklar NET'ler Bakteriyel Enfeksiyon Travmatik Doku Hasarı Otoimmün Hastalıklar Steril İnflamasyon Çift Sarmallı DNA Filamentleri Histonlar Antimikrobiyal Proteinler Patojenler Homeostatik Regülasyon Trombosit Adezyonu Pıhtılaşma Sepsis Otoimmün Bozukluklar Terapötik Müdahale Elektron Mikroskobu Boyama Yöntemleri Antikorlar Otofloresan Azaltıcı Ajanlar Antijen Eldektif Yöntemleri Geçirgenleştirme

Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter