Summary
يظهر هنا بروتوكول لعزل أنسجة الرئة الخلوية الإقليمية. يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لدراسة التعقيدات في المصفوفة خارج الخلية وتفاعلات مصفوفة الخلية.
Abstract
غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل المتأخرة من مرض الرئة الحاد ، ولكن هذا محدود بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع. يعد التحقق من مناهج الهندسة الحيوية الجديدة لاستبدال الرئتين المريضة أمرا ضروريا لتحسين بقاء المريض على قيد الحياة وتجنب المضاعفات المرتبطة بمنهجيات الزرع الحالية. يتضمن النهج البديل استخدام رئتين كاملتين منزوعتين للخلايا تفتقر إلى المكونات الخلوية التي عادة ما تكون سبب الرفض الحاد والمزمن. نظرا لأن الرئة عضو معقد ، فمن المهم فحص مكونات المصفوفة خارج الخلية لمناطق معينة ، بما في ذلك الأوعية الدموية والممرات الهوائية والأنسجة السنخية. الغرض من هذا النهج هو إنشاء طرق بسيطة وقابلة للتكرار يمكن للباحثين من خلالها تشريح وعزل الأنسجة الخاصة بالمنطقة من الرئتين المنزوع الخلايا بالكامل. تم وضع البروتوكول الحالي لرئتي الخنازير والإنسان ، ولكن يمكن تطبيقه على الأنواع الأخرى أيضا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تحديد أربع مناطق من الأنسجة: مجرى الهواء والأوعية الدموية والحويصلات الهوائية وأنسجة الرئة السائبة. يسمح هذا الإجراء بشراء عينات من الأنسجة التي تمثل بدقة أكبر محتويات أنسجة الرئة منزوعة الخلايا بدلا من طرق التحليل السائبة التقليدية.
Introduction
أمراض الرئة ، بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، والتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والتليف الكيسي (CF) ، لا تزال حاليا بدون علاج1،2،3،4. غالبا ما يكون زرع الرئة هو الخيار الوحيد للمرضى في المراحل اللاحقة ، ولكن هذا يظل خيارا محدودا بسبب توفير رئتي المتبرع المناسبة والرفض الحاد والمزمن بعد الزرع3،5،6. على هذا النحو ، هناك حاجة ماسة لاستراتيجيات علاج جديدة. أحد الأساليب الواعدة في الهندسة الحيوية التنفسية هو تطبيق السقالات المشتقة من الأنسجة المحضرة من أنسجة الرئة الأصلية منزوعة الخلايا. نظرا لأن سقالات الرئة الكاملة اللاخلوية تحتفظ بالكثير من تعقيد تكوين المصفوفة خارج الخلية الأصلية (ECM) والنشاط الحيوي ، فقد تمت دراستها بشكل مكثف لهندسة الأعضاء الكاملة وكنماذج محسنة لدراسة آليات أمراض الرئة7،8،9،10. في موازاة ذلك ، هناك اهتمام متزايد باستخدام الأنسجة منزوعة الخلايا من أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الرئتين ، كهلاميات مائية وركائز أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM في نماذج زراعة الأنسجة العضوية وغيرها11،12،13،14،15،16،17. توفر هذه النماذج أكثر صلة من الركائز المتاحة تجاريا ، مثل Matrigel ، المشتقة من مصادر الورم. ومع ذلك، فإن المعلومات المتعلقة بالهلاميات المائية المشتقة من الرئة البشرية محدودة نسبيا في الوقت الحاضر. لقد وصفنا سابقا الهلاميات المائية المشتقة من رئتي الخنازير منزوعة الخلايا وميزنا خصائصها الميكانيكية والمادية ، بالإضافة إلى إثبات فائدتها كنماذج لزراعة الخلايا18,19. قام تقرير حديث بتفصيل التوصيف الميكانيكي واللزج الأولي للهلاميات المائية المشتقة من رئتي الإنسان الطبيعية والمريضة (COPD ، IPF)20. لقد قدمنا أيضا بيانات أولية تميز محتوى الجليكوزامينوجليكان في الرئتين البشرية الطبيعية ومرض الانسداد الرئوي المزمن ، بالإضافة إلى قابليتها للتطبيق لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM11.
توضح هذه الأمثلة قوة استخدام ECMs الرئة البشرية منزوعة الخلايا لأغراض التحقيق. ومع ذلك ، فإن الرئة عضو معقد ، ويختلف كل من الهيكل والوظيفة في مناطق مختلفة من الرئة ، بما في ذلك تكوين ECM وخصائص أخرى مثل الصلابة21,22. على هذا النحو ، من المهم دراسة ECM في مناطق فردية من الرئة ، بما في ذلك القصبة الهوائية والممرات الهوائية الكبيرة ، والممرات الهوائية متوسطة الحجم والصغيرة ، والحويصلات الهوائية ، وكذلك الأوعية الدموية الكبيرة والمتوسطة الحجم والصغيرة. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتشريح رئتي الإنسان والخنازير منزوعة الخلايا وبالتالي عزل كل من تلك المناطق التشريحية. وقد سمح ذلك بتحليل تفاضلي مفصل لمحتوى البروتين الإقليمي في كل من الرئتين الطبيعية والمريضة21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقا ل IACUC بجامعة فيرمونت (UVM). تم الحصول على جميع الرئتين البشرية من خدمات تشريح الجثة UVM وتم إجراء الدراسات ذات الصلة وفقا لإرشادات IRB من UVM.
ملاحظة: تم وصف إزالة الخلايا من رئتي الخنازير والإنسان سابقا من قبل مجموعتنا7،8،9،10،21. باختصار ، يتم إزالة الخلايا من فصوص الرئة الكاملة من خلال التروية المتسلسلة للممرات الهوائية والأوعية الدموية بسلسلة من محاليل المنظفات والإنزيم سعة 2 لتر باستخدام مضخة تمعجية: 0.1٪ Triton-X 100 ، 2٪ ديوكسي كولات الصوديوم ، 1 M كلوريد الصوديوم ، 30 ميكروغرام / مل DNase / 1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2 ، 0.1٪ حمض البيراسيتيك /4٪ إيثانول ، وغسل ماء منزوع الأيونات. تشمل الطرق القياسية لتأكيد إزالة الخلايا الفعالة تحديد <50 نانوغرام / ملغ من الحمض النووي المزدوج المتبقي داخل الرئتين المنزوع الخلايا وغياب شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، والتلوين النووي بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) 9,21.
1. الإعداد
- اجمع كل المعدات اللازمة لإجراء التشريح ، بما في ذلك طبق خزفي زجاجي ، وزوجين من الملقط الجراحي ، وزوج واحد من الملقط ، ومقص جراحي ، والأوتوكلاف قبل الاستخدام.
- احصل على جزء من الرئة ، وضعه في طبق خزفي زجاجي ، وقم بتوجيهه بحيث يمكن رؤية الطرف العلوي من مجرى الهواء بوضوح.
- حدد الطرف القريب من الأوعية الدموية واحتفظ بها سليمة حتى خطوات لاحقة. يجب أن تكون نهاية الأوعية الدموية مرئية بوضوح ولونها أبيض معتم تماما.
- باستخدام زوج من الملقط والمقص الجراحي ، قم بإزالة أي غشاء الجنب الذي قد يكون مبطنا للجزء الخارجي من الرئة وتخلص منه.
2. كشف مجرى الهواء
- باستخدام تقنية الانتشار مع المقص الجراحي ، اعمل برفق على كشف مجرى الهواء الإضافي.
- حدد موقع أكبر مجرى هوائي ، والذي يبلغ قطره عادة حوالي 2-4 سم. هناك طريقة أخرى لتحديد مجرى الهواء وهي من خلال مراقبة حلقات الغضاريف ، والتي يمكن اكتشافها بصريا أو عن طريق ملامسة الأنسجة.
- باستخدام زوج من الملقط ، قم بجس طول مجرى الهواء من أجل تحديد موقع مجرى الهواء غير المرئي على عمق 1 بوصة تقريبا.
ملاحظة: كونها مبطنة بحلقات غضروفية ، فإن مجرى الهواء أصعب بشكل مميز من أنسجة الرئة الأخرى. على هذا النحو ، يجب أن يكون العثور على مجرى الهواء غير المرئي وجسه بسيطا نسبيا. - أمسك المقص الجراحي بالتوازي مع مجرى الهواء ، أدخل الأطراف المغلقة في الأنسجة المحيطة مباشرة بمجرى الهواء غير المرئي.
- افتح المقص الجراحي ببطء لسحب الغشاء المحيط برفق. بعد ذلك ، قم بإزالة المقص الجراحي وتجنب قطع أي نسيج على الإطلاق.
- كرر هذه العملية بشكل متقطع طوال إجراء التسلخ لمواصلة تعريض مجرى الهواء.
- باستخدام المقص الجراحي ، قم بقطع مجرى الهواء عند نقاط التفرع وتشريح أي من الفرعين بشكل مستقل.
ملاحظة: نقطة التفرع هي الموقع الذي ينقسم فيه مجرى هوائي واحد إلى مجاريين هوائيين منفصلين. - المناطق المقطوعة من مجرى الهواء بمجرد التأكد من أن النهايات السليمة ستظل قابلة للتحديد ويمكن تحديد موقعها بسهولة لمزيد من التشريح.
- ضع المناطق المقطوعة من مجرى الهواء في الأنبوب المقابل. يختلف حجم المناطق المقطوعة اعتمادا على العينة ، ولكن بشكل عام ، سيتراوح طولها بين 1-5 سم. يختلف العرض بناء على الموقع النسبي على طول شجرة مجرى الهواء ، مع احتفاظ المناطق البعيدة بعرض أصغر من المناطق القريبة.
3. تعريض واستئصال مناطق الأوعية الدموية
- ضع ضغطا لطيفا على الأوعية الدموية وابتعد ببطء عن مجرى الهواء. اسمح للأوعية الدموية بالتمدد قليلا واستخدم المقص الجراحي لفصل الأوعية الدموية عن مجرى الهواء.
ملاحظة: الكثير من الضغط سوف يمزق الأوعية الدموية. إذا تمزق الوعاء، فما عليك سوى وضع هذا الجزء من الأوعية الدموية في الأنبوب المسمى المقابل وتحديد نهايته السليمة. - عندما يتم الكشف عن نقطة متفرعة في شجرة الأوعية الدموية ، استخدم المقص الجراحي والملاقط لفضح المزيد من المناطق السفلية من الأوعية الدموية.
- ابدأ بإدخال الأطراف المغلقة للمقص الجراحي أسفل نقطة التفرع مباشرة وبين منطقتي الأوعية الدموية المقابلتين.
- افتح المقص ببطء لنشر الأنسجة الكامنة.
- بشكل متقطع ، استخدم زوجا من الملقط لإزالة الأنسجة التي انتشرت باستخدام المقص الجراحي ، وكذلك أي نسيج آخر يحيط مباشرة بالأوعية الدموية.
- عندما تغطي الأوعية الدموية مناطق مجرى الهواء أو تصبح مرهقة لأي خطوة في إجراء التشريح ، قم بقطع الأوعية الدموية عند نقطة متفرعة وقم بتشريح أي من الفرعين بشكل مستقل.
- المناطق المقطوعة من الأوعية الدموية بمجرد التأكد من أن النهايات السليمة ستظل قابلة للتحديد ويمكن تحديد موقعها بسهولة لمزيد من التشريح.
4. تحديد واستئصال الأنسجة السنخية
- باستخدام زوج من الملقط أو الملقط ، قرصة ثم تمزيق مناطق صغيرة من الأنسجة السنخية برفق.
- حدد موقع منطقة الأنسجة التي ليست في المنطقة المجاورة مباشرة لمجرى الهواء أو الأوعية الدموية.
- باستخدام الملقط ، قرصة منطقة صغيرة من الأنسجة التي تبدو خالية من أي الأوعية الدموية أو مجرى الهواء.
- تمزيق المنطقة مقروص من الأنسجة من الرئة.
- راقب منطقة الأنسجة التي تمت إزالتها وتأكد مما إذا كانت الأنسجة السنخية أم لا.
ملاحظة: الأنسجة السنخية موجودة في جميع أنحاء الرئة ، لذلك يمكن ويجب إزالتها طوال عملية التشريح. يجب تصنيف أي نسيج لا يمكن تحديده بسهولة على أنه الحويصلات الهوائية أو الأوعية الدموية أو مجرى الهواء بشكل أساسي على أنه نسيج سائب ووضعه في الأنبوب المسمى المقابل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 مخططا عاما للبروتوكول. بمجرد إتقانها ، يمكن بسهولة استنساخ التشريح الإقليمي لأنسجة الرئة منزوعة الخلايا. يعد تحديد تصنيف كل عينة من الأنسجة المقطوعة أمرا ضروريا لنجاح إجراء التشريح. الأنسجة الوعائية أكثر مرونة بكثير من مجرى الهواء ، لذا فإن استخدام الملقط لتمديد الأنسجة غالبا ما يكون مؤشرا قويا على ما إذا كانت عينة معينة عبارة عن الأوعية الدموية أو مجرى الهواء. عادة ، تعمل الأنسجة الوعائية بالتوازي مع مجرى الهواء (الشكل 2 أ). تميل الأنسجة الوعائية أيضا إلى الظهور أكثر بياضا ومعتما في اللون (الشكل 2 ب) من أنسجة مجرى الهواء (الشكل 2 ج). يتم تصوير تقنية نشر المقص الجراحي الموصوفة في البروتوكول في الشكل 3. يتم تضمين عينات أكبر من مجرى الهواء بواسطة حلقات من الغضروف التي تبدو أكثر بياضا قليلا من مجرى الهواء نفسه. وبالتالي ، فإن مراقبة حلقات الغضروف هي مؤشر فوري على أن العينة المعنية هي مجرى الهواء (الشكل 4). يعد تحديد ما إذا كانت العينة من الحويصلات الهوائية في المقام الأول أكثر تعقيدا إلى حد ما بسبب وجود الحويصلات الهوائية في جميع أنحاء الرئة وصغر حجمها بحيث لا يمكن ملاحظتها بالعين المجردة. بمجرد إزالته ، يميل النسيج السنخي إلى التراجع إلى شكل يشبه البصلة ويبدو متجانسا نسبيا (الشكل 5). في بعض الأحيان ، يمكن أن تظهر الأنسجة السنخية مرقطة ، ولكن لا ينبغي أبدا أن تحتوي على خطوط بيضاء مرئية لأن هذا قد يشير إلى وجود مجرى هوائي أو أوعية متوسطة إلى كبيرة الحجم. في الحالات التي لوحظت فيها خطوط بيضاء أو غيرها من الهياكل غير المحددة ، يجب تصنيف عينة الأنسجة على أنها رئة سائبة ووضعها في الأنبوب المسمى المقابل. عملية التشريح هذه غير دقيقة ، وعلى هذا النحو ، فإننا نصنف فئة الأنسجة السنخية على أنها غنية بالسنخية. باستخدام هذا البروتوكول ، من المستحيل الحصول على عينة من الأنسجة السنخية النقية بنسبة 100٪. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا باستخدام قياس الطيف الكتلي أن تكوين ECM يختلف بين المناطق الفردية للرئتين غير الخلوية ، بما في ذلك ECM للرئة بالكامل (wECM) ، ECM المخصب بالسنخية (aECM) ، ECM مجرى الهواء (airECM) ، و ECM الوعائي (vECM) (الشكل 6A-F) 21. على وجه الخصوص ، في الرئتين منزوعة الخلايا التي تم الحصول عليها من المرضى الذين ليس لديهم تاريخ من أمراض الرئة ، قمنا بتمييز إثراء البروتينات المرتبطة بالغشاء القاعدي (أي اللامينين) في aECM ، بينما يتم إثراء airECM ببروتينات ECM المرتبطة بالغضروف ، مثل aggrecan (ACAN) ، ويتم إثراء vECM بالفبرونيكتين (FN1) وبروتينات ECM الأخرى القابلة للذوبان المرتبطة بالأوعية الدموية (الشكل 6G ، ح)21. علاوة على ذلك ، أثبتنا سابقا أن تكوين ECM يتغير في المرضى الذين يعانون من IPF أو COPD بطريقة خاصة بالمنطقة ، مما يسلط الضوء على ضرورة وجود طرق لاستجواب مناطق الرئة الفردية كما هو موضح هنا21.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لعملية إزالة الخلايا وتسلخ الرئة بأكملها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مثال يوضح الفرق بين مجرى الهواء المنزوع الخلايا والأنسجة الوعائية أثناء التسلخ. أ: التشريح الأولي مع الممرات الهوائية والأوعية الدموية جنبا إلى جنب. (ب) مجرى الهواء، و(ج) الأوعية الدموية التي يمسك كل منها بالملقط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إجراءات تحديد الأوعية الدموية وحصادها. أ: وضع منطقة كبيرة من الأوعية الدموية الرئوية في وضع مستقيم بالملقط. لا توجد حلقات غضروفية والأنسجة لديها درجة معينة من المرونة ، مما يؤكد أن العينة وعائية. (ب) يستخدم المقص الجراحي لقطع الجزء العلوي من الأوعية الدموية بعناية. (ج) يحتفظ بأوعية وعائية أكثر من كافية أسفل الجرح بحيث يمكن نقلها بسهولة وتشريحها. د: جزء من الأوعية الدموية البعيدة يمكن تقسيمه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: إجراءات تحديد مجرى الهواء وحصاده . (أ) منطقة كبيرة من مجرى الهواء مثبتة بشكل مستقيم بالملقط. تظهر الصورة حلقات غضروفية شفافة، مما يؤكد أن العينة مجرى الهواء. (ب) يستخدم المقص الجراحي لقطع الجزء العلوي من مجرى الهواء بعناية. (ج) يتم الاحتفاظ بمجرى هوائي أكثر من كاف أسفل الجرح بحيث يمكن نقله بسهولة وتشريحه. (د) يوضع مجرى الهواء المقطوع في الأنبوب المسمى المناظر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مثال يوضح عينة ممثلة من الأنسجة السنخية. الأنسجة السنخية المعزولة يتم تعليقها للفحص باستخدام زوج من الملقط. عينة الأنسجة السنخية كروية بعد الاستخراج من الرئة ولها لون موحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تختلف أمومة الرئة منزوعة الخلايا باختلاف المنطقة التشريحية. صورة تمثيلية لرئة بشرية منزوعة الخلايا على الجانب البطني (A) والظهري (B) والتشريح اللاحق لأشجار مجرى الهواء المعزول (C) والأوعية الدموية (D). € مساحيق ECM المطحونة بالنيتروجين السائل من ECM الرئة الكاملة منزوعة الخلايا (wECM) ، وكذلك ECM من المناطق المخصبة بالسنخية (aECM) ، والمخصب بمجرى الهواء (airECM) ، والمناطق المخصبة بالأوعية الدموية (vECM). (F) مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) الذي يوضح تشابه التركيب الكلي للأمومة بين العينات الخاصة بالمنطقة. (ز) نسبة متوسط تكوين الغشاء القاعدي من المناطق الخاصة بالرئة المنزوعة الخلايا. (H) خريطة حرارية لأفضل 25 بروتينا أموميا في جميع مناطق الرئة الخالية من الخلايا. أعيد طبع هذا الرقم من Hoffman et al.21. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كثيرا ما تستخدم الأنسجة المنزوعة الخلايا من البشر والأنواع الأخرى كمواد حيوية لدراسة تكوين ECM وكذلك تفاعلات الخلايا ECM في نماذج الاستزراع خارج الجسم الحي ، بما في ذلك الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد12،13. على غرار الأعضاء الأخرى ، تم استخدام الرئتين منزوعة الخلايا سابقا لتحديد الاختلافات التركيبية ECM في الرئتين السليمة مقابل المريضة (أي انتفاخ الرئة و IPF) ويتم استخدامها بشكل متزايد كهلاميات مائية لدراسة ديناميكيات ECM وتفاعلات ECM الخلوية7،8،9،10،11،14،15،16،17 ، 18،19،20. ومع ذلك ، فإن الدراسات البروتينية والهيدروجيل في الرئتين المنزوعة الخلايا قد نظرت فقط في الرئة ككل ، وبالتالي فهي غير قادرة على تحديد دور المناطق التشريحية الفردية في نتائج الدراسة الإجمالية. نظرا لأن الرئة عضو معقد يختلف اختلافا جذريا في الدور الفسيولوجي والتكوين والبنية بين المناطق التشريحية ، فمن الأهمية بمكان تطوير طرق لدراسة هذه المناطق الفردية بشكل منفصل21,22. هنا ، نصف طريقة مبتكرة لاشتقاق المناطق التشريحية الفردية (المناطق المخصبة بالسنخية ، ومجرى الهواء ، والأوعية الدموية) من الرئتين المنزوعة الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك كل من التوصيف البروتيني ودراسات هيدروجيل خارج الجسم الحي 21
بعد إزالة الخلايا من الرئة بالكامل ، تصف طريقتنا بروتوكول تشريح تدريجي لإثراء أشجار مجرى الهواء والأوعية الدموية. يعد الشروع في توخي الحذر أهم جانب في إجراء التشريح حتى لا يتم التعرف بشكل خاطئ على عينة معينة أو قطع منطقة من الأنسجة بشكل عشوائي. والنتيجة المحتملة لهذا الأخير هي فقدان مسار مجرى الهواء أو الأوعية الدموية داخل الرئة. في الوقت الحالي ، من أفضل الممارسات الاحتفاظ بمجرى الهواء أو الأوعية الدموية بالملقط حتى تتعرض الأنسجة إلى النقطة التي يمكن جمعها فيها. في المستقبل ، يمكن أن تشمل التعديلات على هذا البروتوكول تطبيق مشبك على الطرف المكشوف من مجرى الهواء أو الأوعية الدموية ، مما يسمح بالتحديد المستمر للأنسجة التي يتم تشريحها بنشاط. تضمنت التعديلات السابقة إدخال تقنية الانتشار بالمقص الجراحي ، والتي تم وصفها في البروتوكول. قبل استخدام تقنية الانتشار ، تم إجراء طريقة يدوية لتعريض مجرى الهواء أو الأوعية الدموية والتي تضمنت تمزيق الأنسجة المحيطة. هذا التعديل أكثر فعالية في تعريض مجرى الهواء أو الأوعية الدموية ويحد من مقدار الضرر الذي يلحق بالأنسجة المحيطة ، والتي يمكن بعد ذلك تشريحها إلى عينات خاصة بالمنطقة.
أحد قيود هذا الإجراء هو أن تجنب القطع العرضي للأوعية الدموية الصغيرة ومجرى الهواء قد يكون صعبا ، لأنه بمجرد وصولها إلى أقطار أصغر ، تصبح حساسة بشكل متزايد. على هذا النحو ، يصبح من المفيد التخلي عن شراء مجرى الهواء والأوعية الدموية الصغيرة للغاية وتصنيف المنطقة على أنها سائبة بدلا من ذلك. هذا مقبول تماما ، حيث أن أنسجة الرئة السائبة تهدف إلى احتواء خليط من جميع أنواع أنسجة الرئة. هناك قيد آخر يتمثل في صعوبة عزل الأنسجة السنخية النقية دون احتواء العينة على كميات ضئيلة من الأوعية الدموية أو مجرى الهواء. طريقة سهلة لتجنب ذلك هي جمع عينات صغيرة من الأنسجة السنخية (حوالي 5 مم3) ، بحيث يكون مركز عينة الأنسجة أقل عرضة لاحتواء أنواع الأنسجة غير المرغوب فيها.
الطرق الموصوفة جديدة ولسنا على علم حاليا بأي طرق أخرى لتشريح الرئة خاصة بالمنطقة. يوفر هذا البروتوكول القدرة على التمييز بين مناطق مختلفة من الرئة ، مما يؤسس فهما علميا أكثر قوة للتكوين.
قد يكون لبروتوكول التشريح هذا تطبيقات في توليد الهلاميات المائية لتطبيقات زراعة الخلايا 2D و 3D ، بالإضافة إلى تطوير الأحبار الحيوية لتطبيقات الطباعة ثلاثية الأبعاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون خدمات تشريح الجثة UVM لشراء الرئة البشرية ودكتوراه روبرت بوليوت لمساهماتهم في تقنيات التشريح الشاملة. تم دعم هذه الدراسات بواسطة R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B.
- Raherison, C., Girodet, P. -O.
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M.
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F.
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
