Maus Lendenwirbel Uniaxiale Kompressionsprüfung mit Einbettung der Belastungsfläche

Altersbedingte Knochenveränderungen werden aufgrund des damit verbundenen erhöhten Risikos für Knochenbrüche weithin als problematisch angesehen. Knochenbrüche beim Menschen können zu chronischen Schmerzen, eingeschränkter Mobilität, langfristigen Behinderungen, einem erhöhten Sterberisiko und wirtschaftlichen Belastungen führen¹. Zu den gängigen Therapien, die untersucht werden, um die Symptome altersbedingter Knochenveränderungen zu behandeln, gehören Nahrungsergänzungsmittel, Hormonbehandlungen und Medikamente 2,3,4,5,6,7,8,9. Erste Untersuchungen solcher Behandlungen für menschliche Probanden werden üblicherweise unter Verwendung von Kleintiermodellen (z. B. Laborratten und Mäusen) durchgeführt, die die beiden Haupttypen von Knochen besitzen, die im menschlichen Skelett gefunden wurden¹⁰. Lange Blinddarmknochen wie Oberarmknochen, Oberschenkelknochen und Schienbein sind reich an kortikalem (d. h. kompaktem) Knochen, während Wirbel reich an spongiösem Knochen (^{d. h}. gewebtem, schwammigem oder trabekulärem Knochen) sind4. Es gibt immer mehr Erkenntnisse darüber, dass sich die Mechanismen der Knochenregulation und der Signalwege zwischen kortikalem Knochen (z. B. Mitteldiaphyse des langen Knochens) und spongiösem Knochen (z. B. Wirbelzentrum) ^{unterscheiden2}. Aus diesem Grund können Therapien unterschiedliche Effekte haben, die knochenspezifisch oder sogar ortsspezifisch innerhalb desselben Knochens sind ^2,3,4.

Die Anwendung von Kraft auf ein Objekt (z. B. Knochen) führt dazu, dass das Objekt je nach den Randbedingungen des Objekts beschleunigt, verformt oder verformt wird. Wenn der Knochen eingeengt ist, widersetzt sich eine entgegengesetzte Kraft gleicher Größe der Beschleunigung des Knochens, und es kommt zu einer Verformung. Wenn sich der Knochen verformt, entsteht ein innerer Widerstand, der als Spannung bezeichnet wird und von dem es zwei grundlegende Arten gibt: Normalkraft in Form von Zug oder Druck und Scherkraft¹⁰. Häufig wird eine Kombination der Grundarten von Spannungen erzeugt, abhängig vom aufgebrachten Kraftsystem¹⁰. Die Stärke eines Materials ist seine Fähigkeit, Belastungen standzuhalten, ohne zu versagen. Wenn immer größere Kräfte auf ein Material ausgeübt werden, erfährt es schließlich eine dauerhafte Verformung, an der es von einem elastischen Zustand (d. h. es kehrt in seine ursprüngliche Form zurück, wenn die Kraft entfernt wird) in einen plastischen Zustand übergegangen ist (d. h. es kehrt nicht in seine ursprüngliche Form zurück, wenn die Kraft entfernt wird)¹¹. Der Punkt, an dem der Übergang von einem elastischen in einen plastischen Zustand erfolgt, wird als Streckgrenze bezeichnet. Da über die Streckgrenze hinaus noch größere Kräfte auf das Material ausgeübt werden, kommt es zunehmend zu Mikrobrüchen (d. h. Schäden), bis es zu einem vollständigen Bruch kommt. Zu diesem Zeitpunkt soll das Material versagt haben^11,12. Die Fraktur eines Knochens stellt ein Versagen sowohl auf struktureller als auch auf Gewebeebene^{dar 10}. Zum Beispiel tritt der Bruch eines Wirbelknochens auf, weil nicht nur mehrere Trabekel auf struktureller Ebene versagen, sondern auch extrazelluläre Matrixelemente wie Kollagen und Hydroxylapatitkristalle in einer einzelnen Trabekel auf Gewebeebene.

Die mechanischen Ereignisse, die zum Versagen eines Materials führen, können mit einer Vielzahl von Prüfmethoden gemessen werden. Die Dreipunktbiegung ist eine gängige Methode, um die mechanischen Eigenschaften von Röhrenknochen aus dem Blinddarmskelett zu testen. Diese Methode ist einfach und reproduzierbar, was sie für viele Forscher zur bevorzugten Methode biomechanischer Tests macht¹³. Durch das Absenken eines Kreuzkopfbalkens auf die mittlere Diaphyse eines langen Knochens, der auf zwei unteren Stützbalken ruht, werden bei dieser Methode gezielt die mechanischen Eigenschaften der mittleren Diaphyseregion getestet, bei der es sich um einen dicht organisierten kortikalen Knochen handelt. Aus Last-Weg-Kurven lassen sich unter anderem Zugkrafteinflüsse auf Elastizität, Zähigkeit, Kraft bis zum Versagen und den Übergang vom elastischen zum plastischen Verhalten von Knochenmaterialien bestimmen.

Bei der zweiten Art von Knochen, die als trabekulärer, schwammiger, gewebter oder spongiöser Knochen bezeichnet wird, werden Knochenelemente zu einer Reihe von Stäbchen und Balken geformt, die als Trabekel bezeichnet werden, was ihnen ein "schwammiges" Aussehen verleiht. Die Hauptwirbelkörper (d. h. Centra) sind reich an spongiösem Knochen und sind beim Menschen häufig die Lokalisationen altersbedingter Kompressionsknochenbrüche¹⁴. Lendenwirbel (d. h. Wirbel des unteren Rückens) sind die größten Wirbel, tragen den größten Teil des Körpergewichts und sind die häufigste Stelle für Wirbelbrüche^15,16. Die mechanischen Eigenschaften von Wirbelkörpern lassen sich am besten direkt mit uniaxialen Druckprüfverfahren beurteilen, da die axiale Kompression die normale Kraftbelastung ist, die in vivo auf Wirbelsäulen ausgeübt wird ¹⁷. Die Kompression der Wirbelkörper in vivo erfolgt als Folge von Muskel- und Bänderkontraktionen, der Schwerkraft und Bodenreaktionskräften¹⁸.

Ex-vivo-Kompressionstests von Kleintierwirbeln können aufgrund ihrer geringen Größe, unregelmäßigen Form und Zerbrechlichkeit schwierig sein. Die Form der Wirbelkörper kann als Parallelogramm mit leichter ventraler Kippung und leichter kranialer Konkavität abgeschätzt werden¹⁷. Diese Form stellt eine Herausforderung für die Durchführung von uniaxialen Druckprüfungen ex vivo dar, da ohne angemessene Vorbereitung der Belastungsfläche Druckkräfte nur auf einen Teil der Belastungsfläche ausgeübt werden, was zu einem "lokalen Kontakt" ^führt17,19. Dies kann zu inkonsistenten Ergebnissen und vorzeitigem Ausfall führen¹⁹. Dies ist in vivo nicht der Fall, da die Belastungsfläche an den Wirbelgelenken von Bandscheiben umgeben ist, wodurch die Last über die kraniale Endplatte verteilt werden kann. Der Bandscheiben-Schädel-Endplatten-Komplex spielt eine wichtige Rolle bei der Krafteinleitung über den gesamten Wirbelkörper und der Biomechanik der Fraktur auf den Wirbelkörper^14,20. Während die Kompressionsprüfung auf dem Gebiet der Biologie nicht neu ist, gibt es Einschränkungen bei den derzeitigen Methoden der mechanischen Prüfung von Knochen. Zu diesen Einschränkungen gehören das Fehlen von Prädiktormodellen und Simulationen für die Knochenmechanik, eine einzigartige geometrische Raumarchitektur und sogar inhärente probenbasierte biologische Variationen²¹. Noch wichtiger ist, dass das Feld durch eine mangelnde Standardisierung zwischen den Methoden und einen allgemeinen Mangel an berichteten Methoden in der Literatur herausgefordert wird²².

In der Literatur werden zwei Methoden zur Präparation von Nagetier-Lendenwirbeln beschrieben, um eine einachsige Kompressionsprüfung zu erreichen: die Schneidemethode und die Einbettungsmethode 17,19,23,24,25,26. Das Schneideverfahren erfordert, dass die Wirbelfortsätze, die kraniale Endplatte und die kaudale Endplatte aus dem Wirbelkörper herausgeschnitten werden. Pendleton et ^al.19 haben bereits über eine detaillierte Methode zur Anwendung dieser Methode an Lendenwirbeln von Mäusen berichtet. Diese Methode stellt die Herausforderung dar, perfekt parallele Schnitte sowohl an der kaudalen als auch an der kranialen Endplatte zu erzielen und gleichzeitig eine Beschädigung der Probe zu vermeiden. Es hat auch die Einschränkung, dass die kraniale Endplatte entfernt wird. Die kraniale Endplatte enthält eine dichte Hülle aus kortikalem Knochen und spielt eine wichtige Rolle bei der Verteilung von Lasten aus den Bandscheiben in vivo und ist am Versagen des Knochens bei in vivo Frakturen beteiligt 17,20,27. Im Gegensatz dazu werden bei der Einbettungsmethode die Wirbelfortsätze entfernt, während die kraniale Endplatte des Wirbelkörpers intakt bleibt. Die Belastungsfläche wird dann annähernd horizontal hergestellt, indem eine kleine Menge Knochenzement auf das kraniale Ende des Wirbelkörpers aufgetragen wird. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die technischen Herausforderungen, die mit der Schneidemethode verbunden sind, überwindet und den Mechanismus der Lastaufbringung und des Knochenversagens in vivo aufgrund der Erhaltung der kranialen Endplatte besser nachahmen kann. Dieser Ansatz wurde bereits in Studien dokumentiert, in denen uniaxiale Kompressionstests an Rattenknochen durchgeführt wurden. Soweit uns bekannt ist, wurde es jedoch bisher nicht im Zusammenhang mit kleineren Lendenwirbeln der Maus dokumentiert 17,25,26. Die fragliche Methode wurde zuvor von Chachra et ^al.25 detailliert beschrieben und verwendete ursprünglich eine Knochenprobe, die zwischen zwei Platten mit jeweils einem zylindrischen Hohlraum gehalten und dann mit Polymethylmethacrylat (PMMA) gefüllt wurde. Dieselbe Forschungsgruppe verbesserte später die Methode, bei der ein Ende sanft geschliffen (kaudal) und das andere Ende mit einem kleinen Fleck Knochenzement (kranial) versehen ^wird26. Diese Methode ist eine Verbesserung gegenüber der vorherigen Methode, da sie das Material zwischen den Platten minimiert und im Mittelpunkt dieses Artikels steht. Trotz der Herausforderungen, die mit der uniaxialen Wirbelkompressionsprüfung verbunden sind, handelt es sich um eine Methode, die wertvolle Informationen über die Auswirkungen einer vorgeschlagenen Therapie auf den Knochen liefern kann, insbesondere in Kombination mit der Dreipunktbeugung.

Hier wird der Einsatz einer umrüstbaren Dreipunkt-Biege-/Druckprüfmaschine vorgestellt, die eine einfache Prüfung sowohl von langen Knochen als auch von Wirbelkörpern mit einer einzigen Maschine ermöglicht. Des Weiteren wird die Verwendung eines Einbettungsverfahrens zur Erzielung einer einachsigen Kompressionsprüfung von Lendenwirbeln von Mäusen vorgestellt. Die vorliegende Studie wurde als Teil einer größeren Studie durchgeführt, die darauf abzielte, die Einflüsse einer Nahrungsergänzung mit Hanfsamen auf die Eigenschaften des Skelettknochens bei jungen, wachsenden weiblichen C57BL/6-Mäusen zu untersuchen ^5,6. Der Dreipunkt-Biegetester wurde ursprünglich von Dozenten und Studenten der Ingenieurabteilung der Colorado State University-Pueblo entwickelt und von unserer Forschungsgruppe in Dreipunkt-Biegetests an langen Knochen [Oberschenkelknochen und Schienbein der Ratte⁷ und Oberarmknochen, Oberschenkelknochen und Schienbein der Maus 5,6,8,9 ]. Seine Modifikation und Anwendung für den Einsatz bei Wirbelkörperkompressionstests an Mäusen wurde jedoch nicht untersucht. Die Konstruktion und der Aufbau der Dreipunktbiegemaschine wurden bereits^{beschrieben 7}. Dieser Bericht konzentriert sich auf Methoden, die verwendet werden, um die Maschine für die Druckprüfung zu modifizieren und die Systemverschiebung zu korrigieren. Zweitens wird die Einbettungsmethode für die Oberflächenpräparation von Wirbelkörperbelastungen von Mäusen beschrieben, zusammen mit Methoden für einachsige Drucktests und die Analyse von Last-Weg-Daten.

Alle Experimente und Protokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokollnummer: 000-000A-021). Detaillierte Verfahren für die Tierpflege wurden bereits beschrieben ^5,6. Die Mäuse wurden im Alter von drei Wochen im Rahmen einer breiteren Studie gewonnen, die darauf abzielte, die Auswirkungen einer mit Hanfsamen ergänzten Ernährung auf junge, wachsende weibliche C57BL/6-Mäuse zu untersuchen (siehe Materialtabelle). Im Alter von 5 bis 29 Wochen wurden die Mäuse mit einer von drei Diäten aufgezogen: Kontrolle (0 % Hanfsamen), 50 g/kg (5 %) Hanfsamen oder 150 g/kg (15 %) Hanfsamen, mit acht Mäusen pro Gruppe ^5,6. Während der gesamten Studie hatten die Mäuse ad libitum Zugang zu ihrer jeweiligen Nahrung und ihrem Wasser, wurden paarweise in Polycarbonatkäfigen untergebracht und in einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkelzyklus gehalten (mit eingeschaltetem Licht von 06:00 bis 18:00 Uhr). Das Gewicht und der Gesundheitszustand der Mäuse wurden wöchentlich beurteilt, und alle Mäuse schlossen die Studie erfolgreich ab, ohne irgendwelche gesundheitlichen Beeinträchtigungen zu entwickeln. Im Alter von neunundzwanzig Wochen wurden die Mäuse mit Isoflurangas tief betäubt und durch Zervixluxation euthanasiert ^5,6. Es wurde ein Mittellinienschnitt auf der ventralen Oberfläche vom Brustbein bis zum Schwanz gemacht, und alle intrathorakalen, peritonealen und retroperitonealen Organe wurden von den Kadavern entfernt. Die ausgeweideten Kadaver wurden in 0,9%iger Natriumchloridlösung bei -70 °C bis zur Knochendissektion für Wirbeluntersuchungen, die etwa ein Jahr später erfolgte, konserviert.

1. Umbau einer Dreipunktbiegemaschine zu einer Druckprüfmaschine

1. Schrauben Sie die Traverse ab, die am Lastsensor der Dreipunktbiegemaschine⁷ befestigt ist (siehe Werkstofftabelle) (Bild 1A,B).
2. Schrauben Sie eine selbstausrichtende obere Platte auf den Lastsensor (siehe Werkstofftabelle) mit einem Gewinde, das mit dem der Traverse identisch ist (Abbildung 1C).
3. Bohren Sie jeweils zwei horizontale Löcher in die unteren Stützen, an denen später die untere Platte befestigt wird (Abbildung 1D).
4. Gewinde in die beiden Seiten einer untersten Platte aus Edelstahl einschneiden, um sie an den Bohrungen in den unteren Stützen auszurichten (Abbildung 1E).
5. Befestigen Sie die untere Platte mit Sechskantschrauben mit Gewinde an den beiden unteren Stützen und ziehen Sie sie fest, bis sie sicher ist (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Sechskantschrauben müssen Gewinde haben, die mit den Gewindebohrungen an den unteren Stützen und den oberen/unteren Platten übereinstimmen. Die Verwendung einer selbstausrichtenden oberen Platte kann dazu beitragen, einen gleichmäßigen Kontakt zwischen der oberen Platte und der Ladefläche zu erreichen, ist jedoch angesichts der Konkavität des kranialen Endes von Wirbelkörpern nicht ausreichend. Eine weitere Vorbereitung mit einer Ladeflächenvorbereitungsmethode ist erforderlich. Bei der Konstruktion einer Druckprüfmaschine für Kleintierknochen, die kleiner und schwächer sind als viele industrielle/technische Materialien, ist es wichtig, die Tragfähigkeit des Lastsensors und die Größe des Lastrahmens zu berücksichtigen. Darüber hinaus sollten Maschinen regelmäßig gereinigt und geschmiert werden, um genaue Ergebnisse und einen reibungslosen Betrieb zu gewährleisten.

2. Korrektur der Verschiebung der Druckprüfmaschine

1. Wenn sich zwischen der oberen und der unteren Platte kein Testmaterial befindet, senken Sie die obere Platte auf die untere Platte ab, bis ein leichter Kontakt hergestellt ist (~0,3-0,5 N Vorspannkraft).
2. Schalten Sie die Maschine mit einer konstanten Senkgeschwindigkeit (~1 mm/min) ein, um mit der Kompressionsprüfung zu beginnen. Erfassen Sie Last- (N) und Wegmessungen (mm) mit digitaler Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle) für die Datenerfassung mechanischer Prüfungen.
   HINWEIS: Da sich kein Material zwischen der oberen und unteren Platte befindet, sind alle beobachteten Verschiebungen allein auf die Verschiebung der Maschine (_Δx-Maschine) zurückzuführen (Rahmen, Wägezelle, Platten, Kupplungen usw.).
3. Senken Sie die obere Platte mit konstanter (d. h. monotoner) Geschwindigkeit weiter auf die untere Platte, bis Kräfte erreicht sind, die höher sind als das, was aus allen Knochenproben gewonnen wird.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.3 insgesamt dreimal.
5. Zeichnen Sie die Daten für die Systemverschiebung (_Δx-Maschine, mm) vs. aufgebrachten Last (Kraft, N).
6. Passen Sie eine Regressionsgerade mit der besten Anpassung an die Daten an (Abbildung 2A-D).
7. Verwenden Sie in einer Tabelle mit den Daten eines Knochenkompressionstests die Gleichung der Regressionsanalyse, um den Betrag der Maschinenverschiebung (_Δx-Maschine) zu bestimmen, der die aufgezeichnete Verschiebung (Δx-Gesamtaufzeichnung) für einen Datenpunkt eines Maus-Lendenwirbelkompressionstests beeinflusst.
   ANMERKUNG: Betrachten Sie z. B. einen Datenpunkt, an dem eine Kraft von 18 N ausgeübt wird und eine Verschiebung von 2,730 mm aufgezeichnet wurde (Δx_{gesamt aufgezeichnet}). Gemäß dem Beispiel der polynomialen Regressionsgleichung dritter Ordnung (Abbildung 2D) [Δx-Maschine = (4 × 10-7 x aufgebrachte Last³) - (8 × ^10-5 x aufgebrachte Last²) + (0,0044 x aufgebrachte Last)] sind 0,056 mm der aufgezeichneten Verschiebung auf die Maschinenverschiebung (_Δx-Maschine) zurückzuführen.
   _{Δx insgesamt aufgezeichnet = Δx-Maschine} + Δx-Probe
8. Korrigieren Sie die aufgezeichnete Verschiebung für den Datenpunkt.
   HINWEIS: Betrachten Sie zum Beispiel das obige Beispiel. Wenn eine Verschiebung von 2,730 mm aufgezeichnet wird (Δx-Gesamtpunkt) und die Maschinenverschiebung _{(Δx-Maschine}) 0,056 mm der Gesamtverschiebung ausmacht, beträgt die Verschiebung der betreffenden Probe (d. h. Knochen) (_Δx-Probe) 2,664 mm. Somit ist 2,664 mm die tatsächliche Verschiebung, die der Wirbel erlitten hat (Δx-Probe) und ist der Wert, der für die Analyse der Last-Weg-Kurve verwendet werden soll.
   _Δx-Probe = _{Δx-Gesamtaufnahme - Δx-Maschine}
9. Wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.8 für jeden Datenpunkt, der für jede einzelne Probe (Knochen) gesammelt wurde.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt ist wichtig, da bei der Druckprüfung die beobachtete Verschiebung nicht nur auf die Verschiebung der Probe zurückzuführen ist, sondern die beobachtete Verschiebung eine Kombination aus Maschinenverschiebung (_Δx-Maschine) (z. B. Kompression/Verschiebung des Rahmens, der Wägezelle, der Platten, Kupplungen usw.) und der Probe (Δx-Probe). Bei Proben, die relativ geringen Verschiebungen unterliegen, wie z. B. bei einem kleinen Tier (z. B. einer Maus), kann die Systemverschiebung (_Δx-Maschine) zu großen Fehlern führen. Die hier beschriebenen Verfahren zur Korrektur der Systemverschiebung wurden bereits von Kalidindi und Abusafieh²⁸ beschrieben, die neben der hier beschriebenen auch zwei weitere Methoden detailliert beschreiben. Es wurde festgestellt, dass einige Forscher mehr als eine Methode zur Bestimmung der Systemverschiebung verwenden¹⁷. Jede Maschine kann einzigartige Muster und Grade der Systemverschiebung aufweisen, wenn Lasten auf sie einwirken. Aus diesem Grund muss der Korrekturfaktor für die Systemverschiebung für jede Maschine bestimmt werden und ist nicht zwischen zwei Maschinen gleich. Im Gegensatz zur Druckprüfung eines Wirbelknochens wird bei der Messung der Systemverschiebung keine große Kraftreduzierung beobachtet, da sich kein Material zwischen der oberen und unteren Platte befindet.

3. Dissektion des 5^. Lendenwirbels (L5) aus dem Mauskadaver

1. Tauen Sie gefrorene Mäusekadaver bei Raumtemperatur auf und achten Sie darauf, dass Weichgewebe und Knochen durch regelmäßiges Auftragen einer isotonischen Lösung von 0,9 % NaCl mit Feuchtigkeit versorgt werden.
2. Machen Sie einen kleinen (<0,5 cm) Schnitt in die Haut an der dorsalen Mittellinie in der Nähe des Schwanzansatzes, verlängern Sie dann den Schnitt über jede Hintergliedmaße und ziehen Sie vorsichtig, um das Fell von der Schwanzwurzel bis zum Kopf des Tieres zu entfernen.
3. Schneiden Sie die Bauchwandmuskulatur weg, bis die Wirbelsäule gut sichtbar ist.
4. Visualisieren Sie unter einem Präpariermikroskop die beiden Iliosakralgelenke und das kraniale Ende des Kreuzbeins.
5. Machen Sie mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell einen feinen Schnitt, um den letzten Lendenwirbel (L6) vom kranialen Ende des Kreuzbeins zu trennen.
6. Schneiden Sie wieder zwischen dem Zwischenwirbelraum, entfernen Sie L6 und L5 aus der Wirbelsäule und legen Sie L5 für die Analyse beiseite (Abbildung 3).
7. Untersuchen Sie den Wirbel unter einem Präpariermikroskop und entfernen Sie alle Weichteile aus dem Knochen, einschließlich der Bandscheibe, meist mit Mullbinden und bei Bedarf vorsichtig mit einer Pinzette.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurde der L5 als Wirbel von Interesse ausgewählt, aber es können auch andere Lendenwirbel für Kompressionstests ausgewählt werden.

4. Vorbereitung der L5-Wirbelbelastungsfläche für die uniaxiale Druckprüfung mit der PMMA-Knochenzement-Einbettungsmethode

1. Führen Sie mit einer Diamanttrennscheibe (siehe Materialtabelle), die an einem Rotationswerkzeug befestigt ist, einen Schnitt an jedem Stiel durch, um den Querfortsatz und den Dornfortsatz zu entfernen (Abbildung 4). Wenn Wirbelfortsätze am Zentrum befestigt bleiben, können sie zu lokalen Kontakten mit den oberen/unteren Platten an den Fortsätzen selbst führen, im Gegensatz zu einer Verteilung der Last im gesamten Zentrum.
2. Schleifen Sie das kaudale Ende des Wirbels vorsichtig mit feinem Schleifpapier der Körnung 120 (siehe Materialtabelle) ab, um alle Bandscheiben, Weichteile und Unregelmäßigkeiten zu entfernen.
3. Markieren Sie das abgeschliffene kaudale Ende mit einem Permanentmarker, um es später leicht identifizieren zu können.
4. Mischen Sie den PMMA-Knochenzement gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
5. Wenn der PMMA-Knochenzement noch halbweich ist, geben Sie eine minimale Menge auf das kraniale (unmarkierte) Ende des Wirbels mit der Vorderseite nach oben und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist, während der Wirbel in einem Kochsalzbad sitzt, um die Knochenprobe hydratisiert und kühl zu halten.
6. Wenn das PMMA noch halbweich ist, positionieren Sie den Wirbel mit der kaudalen (markierten) Seite nach unten auf der unteren Platte (Abbildung 5).
7. Schalten Sie die Maschine ein, um die Antriebsräder einzurasten, und senken Sie die obere Platte langsam auf den Wirbel + PMMA-Knochenzementkomplex ab, bis der Knochenzement berührt wird und eine minimale Kraft (<0,5 N) ausgeübt wird, um das PMMA gleichmäßig auf der Knochenoberfläche zu verteilen. Die obere Platte in einer neutralen Position kann als horizontal geschätzt werden und bewirkt, dass das PMMA beim Druck auf halbweiches PMMA die Konkavität am kranialen Ende des Wirbels füllt und eine flache horizontale Fläche unter der oberen Platte bildet.
8. Drücken Sie die obere Platte vorsichtig auf den PMMA-Knochenzement und lassen Sie die Probe ungestört stehen, bis der PMMA-Knochenzement vollständig ausgehärtet ist (~10 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers für den in der vorliegenden Studie verwendeten PMMA-Knochenzement). Bewahren Sie die Probe in einem Kochsalzbad auf oder besprühen Sie sie während dieser Zeit häufig mit Kochsalzlösung, um die Probe hydratisiert und kühl zu halten.
9. Sobald der PMMA-Knochenzement vollständig ausgehärtet ist, kann mit der Druckprüfung begonnen werden. Sammeln Sie Daten für Last (d. h. Kraft) (N) und Verschiebung (d. h. Durchbiegung) (mm) von den Sensoren in Echtzeit in einer Tabelle mit digitaler Software, die für die Datenerfassung mechanischer Prüfungen entwickelt wurde (siehe Werkstofftabelle).
10. Nach der Basisdatenerfassung für 5 s, die mit einer minimalen Vorspannkraft von <0,5 N aufgebracht wurde, beginnen Sie mit dem Absenken der oberen Platte auf die Probe mit einer einzigen (d. h. monotonen), vorbestimmten Absenkgeschwindigkeit, um den Drucktest (~1 mm/min) zu starten.
11. Beenden Sie die Datenerfassung, sobald eine starke Verringerung der Last (N) beobachtet wurde, die auf ein Materialversagen hinweist.
    HINWEIS: In den Anweisungen des Herstellers ist die ungefähre Aushärtungszeit für PMMA-Knochenzement angegeben. Die Aushärtungszeit des PMMA-Knochenzements kann je nach Art des verwendeten PMMA-Knochenzements unterschiedlich sein. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Wartezeit für die PMMA-Härtung zu bestimmen. Als Indikator dafür, dass der PMMA-Knochenzement vollständig ausgehärtet ist, kann jedoch gleichzeitig mit der Probe eine zusätzliche Probe des PMMA-Knochenzements gemischt werden, die auf den Wirbel gelegt wird, aber beiseite gelegt und überprüft wird, ob sie noch weich oder vollständig ausgehärtet ist. Bei vollständiger Aushärtung kann dies darauf hindeuten, dass auch das PMMA am Knochen vollständig ausgehärtet ist, ohne den Knochen + PMMA-Komplex zu stören. Die Knochenprobe muss während der gesamten PMMA-Härtungs- und Testphase gut hydratisiert und kühl bleiben. Bereits wenige Minuten Einwirkung trockener Luft können zu Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften führen. Einige Forscher verwenden Druckprüfmaschinen, die mit einem Kochsalzbad ausgestattet sind¹⁹. Die Druckprüfmaschine verfügte in der vorliegenden Studie nicht über ein Kochsalzbad. Stattdessen wurde während der gesamten PMMA-Härtungs- und Testphase regelmäßig ein feiner Nebel aus Kochsalzlösung aufgetragen.

5. Analyse von Last-Weg-Kurven für einachsige L5-Wirbeldruckversuche

1. Kopieren Sie die Daten zum Laden (N) und zum korrigierten Verschieben (mm) aus der Tabellenkalkulation und fügen Sie sie in eine technische Grafik- und Datenanalysesoftware ein (siehe Materialtabelle).
2. Erzeugen Sie ein Diagramm mit der Last (N) auf der y-Achse und der korrigierten Probenverschiebung (_Δx-Probe, mm) auf der x-Achse (Abbildung 6). Tun Sie dies in der Software, indem Sie zuerst auf Windows, Neue Tabelle und dann auf Tun Sie es klicken, um eine Tabelle zu erstellen. Kopieren Sie korrigierte Verschiebungs- (mm) und Lastdaten (N) aus der Rohdatentabelle in die neue Tabelle.
3. Generieren Sie als Nächstes eine Wellenform, um Rohdaten darzustellen, indem Sie auf Daten klicken, dann auf XY-Paar zu Wellenform klicken und korrigierte Verschiebungsdaten für die X-Welle auswählen und Daten für die Y-Welle laden. Stellen Sie sicher, dass die richtige Anzahl von Datenpunkten im Feld "Anzahl der Punkte" angegeben ist, benennen Sie die Wellenform und klicken Sie dann auf Wellenform erstellen. Sobald eine Wellenform erstellt wurde, generieren Sie ein Diagramm, indem Sie auf Windows und dann auf Neues Diagramm klicken, und platzieren Sie die Wellenform auf der Y-Achse und "berechnet" auf der X-Achse.
4. Verwenden Sie das Cursor-Werkzeug, um Punkte/Regionen von Interesse im Diagramm für die Analyse zu markieren. Einige der Punkte/Regionen, die für die Berechnung gemeinsamer mechanischer Eigenschaften des gesamten Knochens von Interesse sind, werden in den Schritten 5.4 bis 5.8 (Abbildung 6) erwähnt und umfassen die Arbeit bis zum Versagen (N x mm), die maximale Belastung (N), die Steifigkeit (N/mm), die Streckgrenze (N) und die Verschiebung nach der Fließgrenze (mm).
5. Für die Berechnung der Werkstückbelastung (N x mm) ist ein Cursor (A) am Anfang der Prüfung und ein Cursor (B) an der Stelle unmittelbar vor dem Versagen des Materials zu platzieren (d. h. an der maximalen Belastung, die während der Prüfung erreicht wird, bevor eine starke Abnahme der Last beobachtet wird).
   ANMERKUNG: Daher klammern die Cursor A-B die gesamte Prüfung ab, von dem Zeitpunkt an, an dem das Material beginnt, Kräften zu widerstehen und sich zu bewegen, bis zu dem Punkt, an dem das Material versagt. Die Arbeitsfähigkeit ( N x mm) kann als Gesamtfläche unterhalb der Kurve (d. h. die Fläche unter der Kurve zwischen den Cursorn A und B) gemessen werden.
6. Berechnen Sie die maximale Last (N) als höchsten Wert für die Last, die während des Tests beobachtet wird (d. h. die Last am Cursor B).
7. Berechnen Sie die Steifigkeit (N/mm) des Materials als Steigung des linearen elastischen Bereichs (d. h. die Steigung zwischen den Cursorn C und D).
8. Die Streckgrenze (N) ist die Last, bei der die Last-Weg-Kurve von der Linearität abweicht und in den plastischen Bereich eintritt, wodurch eine bleibende Verformung (d. h. eine Belastung am Punkt D) entsteht. Berechnen Sie dies, indem Sie die Last am Cursor D messen.
9. Die Nachstreckgrenze (mm) ist ein Indikator für die Duktilität eines Materials. Messen Sie dies als Verschiebung zwischen der Streckgrenze und dem Punkt des Materialversagens (d. h. die Verschiebung zwischen den Cursorn D und B).
   HINWEIS: Die oben aufgeführten Parameter sind nur einige der üblichen mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens. Es handelt sich nicht um eine vollständige Liste aller mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens, die aus einer Last-Weg-Kurve gewonnen werden können. Weitere Parameter der mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens sind die Gesamtverschiebung (mm), die absorbierte elastische Energie (N x mm), die elastische Verschiebung (mm), die absorbierte plastische Energie (N x mm) und die plastische Verschiebung (mm), um nur einige zu nennen. Darüber hinaus sind die knochenmechanischen Eigenschaften auf Gewebeebene nicht aufgeführt; Diese erfordern Datentransformationen unter Verwendung spezifischer anatomischer Messungen, wie z. B. des Knochendurchmessers. Beispielcode für die Messungen aus der Last-Weg-Kurve in der Software ist in der Zusatzdatei 1 aufgeführt.

Mit diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll, das die Einbettung der L5-Belastungsfläche und eine umrüstbare Dreipunkt-Biegemaschine/Druckprüfmaschine verwendet, ist es möglich, Kompressionstests an Lendenwirbeln von Mäusen für Vergleiche zwischen Gruppen durchzuführen. Insgesamt wurden vierundzwanzig L5-Wirbel der Maus mit der Embedding-Methode präpariert. Drei der Proben wurden jedoch bei der Entfernung der Wirbelfortsätze mit einer Diamanttrennscheibe an einem Rotationswerkzeug beschädigt und somit nicht untersucht. Vor diesem Hintergrund wurden die aufgeführten mechanischen Eigenschaften erfolgreich aus einundzwanzig von vierundzwanzig Proben unter Verwendung der Einbettungsmethode erhalten. Die Proben wurden nach jedem Test visuell geprüft, und die PMMA-Kappe wurde bei keinem der Tests beschädigt. Wie bereits erwähnt, waren die in der vorliegenden Studie verwendeten Mäuse Teil einer größeren Studie, die darauf abzielte, die Auswirkungen von diätetischen Hanfsamen auf die Knochen junger und wachsender weiblicher C57BL/6-Mäuse zu bestimmen. In Tabelle 1 finden Sie deskriptive Statistiken zu fünf häufig berichteten mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens. Die Last-Weg-Kurven für alle einundzwanzig Proben sind in Abbildung 7 dargestellt.

Abbildung 1: Der Umbau einer Dreipunktbiegemaschine zu einer Druckprüfmaschine. (A) Die Maschine ist vollständig für den Betrieb als Dreipunktbiegemaschine ausgerüstet, wobei der Wegsensor und der Lastsensor angegeben sind (weiße Pfeile). (B) Die Maschine, nachdem der Traversenträger entfernt wurde. (C) Die Maschine, nachdem eine selbstausrichtende obere Platte an der Stelle platziert wurde, an der zuvor der Traversenträger platziert war. (D) Die unteren Stützbalken mit eingebohrten Löchern. (E) Die untere Platte aus rostfreiem Stahl mit vier Gewindebohrungen und einer Schraube, die teilweise in eines der Löcher eingeschraubt ist. Die anderen beiden Löcher, die auf dem Foto nicht zu sehen sind, befinden sich auf der gegenüberliegenden Seite. (F) Die unteren Stützbalken, an denen die untere Platte mit vier Sechskantschrauben befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ein Beispiel für eine Systemverschiebung (Δx-Maschine) im Vergleich zum Lastdiagramm, das mit einer linearen (A), logarithmischen (B), Polynomregression zweiter Ordnung (C) und Polynomregression dritter Ordnung (D) ausgestattet ist. In diesem Beispiel bietet das Polynom dritter Ordnung die beste Anpassung proR2-Wert, und seine Regression wird als Korrekturfaktor für die Systemverschiebung verwendet. Die Bilder stellen Beispieldaten dar, um die Regressionsanpassung zu demonstrieren, und müssen von den Forschern für einzelne Maschinen erhalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Lendenwirbelsäule der Maus. Eine Lendenwirbelsäule der Maus unter einem Präpariermikroskop, bevor L6 entfernt wurde (A) und nachdem L6 entfernt wurde, wobei L5 befestigt wurde (B). L5 wird anschließend entfernt und für den Druckversuch vorbereitet. Bei den weiß gefärbten Bändern handelt es sich um die Bandscheiben, die präpariert und entfernt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Anatomie des L5-Wirbels. Ein repräsentativer L5-Wirbel der Maus in kranialer, kaudaler, dorsaler und ventraler Ansicht unter einem Präpariermikroskop. Wichtige Maße für den Wirbelkörper sind die Höhe, die dorsoventrale Breite und die laterale Breite, wie durch die farbigen Linien dargestellt. Die schwarz gestrichelten Linien zeigen ungefähr, wo Schnitte gemacht werden müssen, um die Wirbelfortsätze zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Aushärtungszeit von PMMA-Knochenzement. Ein Beispiel für einen L5-Wirbel mit PMMA-Knochenzement (grün), der auf die kraniale Endplatte gelegt wurde, und die obere Platte, die auf den PMMA-Knochenzement + Knochenkomplex abgesenkt wurde. Sobald der PMMA-Knochenzement vollständig ausgehärtet ist, beginnt der Drucktest. Die obere Platte wird weiter abgesenkt, bis ein Versagen des Materials festgestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Belastungs-Verschiebungskurve und Datenanalyse des Wirbelknochenkompressionstests der Maus. Cursor A markiert den Beginn des Kompressionstests. Cursor B markiert den Punkt des Materialversagens. Der Cursor C markiert den Anfang des linearen elastischen Bereichs, während der Cursor D das Ende (d. h. die Streckgrenze) markiert. Der hellgrau schattierte Bereich ist der lineare elastische Bereich, in dem das Material in seine ursprüngliche Form zurückkehrt, wenn die Last entfernt wird. Der dunkelgrau schattierte Bereich ist der plastische Bereich, in dem sich das Material dauerhaft verformt hat und nicht in seine ursprüngliche Form zurückkehrt, wenn die Last entfernt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Last-Weg-Kurven für alle einundzwanzig Knochenproben. Die Muster variierten zwischen den Knochen. Im Allgemeinen war die größte Variabilität bei der Verschiebung nach der Fließgabe, wobei einige (n = 5) der Knochen eine relativ kleine Verschiebung nach der Fließgrenze und andere (n = 16) eine relativ große Verschiebung nach der Fließgrenze aufwiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Repräsentative Werte für häufig berichtete mechanische Eigenschaften des gesamten Knochens, die mit der Einbettungsmethode der Ladeflächenvorbereitung ermittelt wurden. Die Werte wurden unter Verwendung aller in der vorliegenden Studie beschriebenen Protokolle ermittelt. Somit stellen die Werte diejenigen dar, die mit den hier beschriebenen Methoden erhalten werden können. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM. Die Gruppen repräsentieren weibliche C57BL/6-Mäuse, die im Alter von 5 bis 29 Wochen mit einer mit ganzen Hanfsamen angereicherten Nahrung in Konzentrationen von 0 % (CON), 50 g/kg (5 %) (5 HS) oder 150 g/kg (15 %) (15 HS) gefüttert wurden. Für einen der Parameter (Work-to-Failure) scheint es, dass die Diät die Werte pro Einweg-ANOVA beeinflusst (p < 0,05). Werte mit demselben hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant (p > 0,05), während Werte mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben signifikant unterschiedlich sind (p < 0,05), so die Tukey-Kramer-Post-hoc-Analyse.

Ergänzungsdatei 1: Beispielcode zur Ermittlung der mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.