Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

Abstract

רשת המיקרוטובולים היא מרכיב חיוני במערכת העצבים. מוטציות בחלבוני בקרה רבים של מיקרוטובולים קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירולוגיות, כגון חלבון טאו הקשור למיקרוטובולים למחלות נוירודגנרטיביות, חלבון ניתוק מיקרוטובולים ספסטין וקטנין 60 גורמים לשיתוק ספסטי תורשתי ולהפרעות נוירו-התפתחותיות, בהתאמה. זיהוי רשתות מיקרוטובולים בנוירונים הוא יתרון להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות. עם זאת, הגודל הקטן של תאי עצב והסידור הצפוף של צרורות מיקרוטובולים אקסונליים הופכים את הדמיה של רשתות המיקרוטובולים למאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה לדיסקציה של הצומת העצבית-שרירית של הזחל ותאי שריר, כמו גם צביעה חיסונית של α-טובולין וחלבון Futsch הקשור למיקרוטובול כדי לדמיין רשתות מיקרוטובולים בדרוזופילה מלנוגסטר. הצומת העצבית-שרירית מאפשרת לנו לצפות הן במיקרוטובולים קדם-סינפטיים והן לאחר סינפטיים, והגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובולים. כאן, על ידי מוטציה וביטוי יתר של קטנין 60 בדרוזופילה מלנוגסטר, ולאחר מכן בחינת רשתות המיקרוטובולים בצומת העצבית-שרירית ובתאי השריר, אנו חושפים במדויק את תפקיד הבקרה של קטנין 60 בהתפתחות עצבית. לכן, בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

Introduction

מיקרוטובולים (MTs), כאחד המרכיבים המבניים של השלד הציטו-שלד, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל חלוקת תאים, גדילה ותנועתיות של תאים, הובלה תוך-תאית ושמירה על צורת התא. דינמיקה ותפקוד של מיקרוטובולים מווסתים על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים, כגון MAP1, MAP2, טאו, קטנין וקינסין 1,2,3,4,5.

בנוירונים, מיקרוטובולים חיוניים להתפתחות ותחזוקה של אקסונים ודנדריטים. הפרעות במיקרוטובולים מובילות לתפקוד לקוי ואפילו למוות של נוירונים. לדוגמה, במוחם של חולי אלצהיימר, זרחן יתר של חלבון טאו מפחית את יציבות רשת המיקרוטובולים, וגורם לאי סדירות נוירולוגית6. לפיכך, בחינת רשתות מיקרוטובולים תתרום להבנת ההתפתחות העצבית והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות.

הצומת העצבית-שרירית (NMJ) היא סינפסה היקפית הנוצרת בין מסוף אקסון נוירון מוטורי לבין סיב שריר, שהיא מערכת מודל מצוינת ורבת עוצמה לחקר המבנה והפונקציות הסינפטיות7. פוטש הוא חלבון בדרוזופילה שהוא הומולוגי לחלבון קושר המיקרוטובולים MAP1B שנמצא ביונקים8. הוא מתבטא רק בתאי עצב וממלא תפקיד בהתפתחות הכפתורים הסינפטיים 8,9 של NMJ. בצרורות נימה מסוג פראי שרצים לאורך מרכז תהליכי NMJ מדמיינים על ידי הכתמה חיסונית עם אנטי-פוטש. כאשר מגיעים לקצה של NMJ, צרור זה יש את היכולת או ליצור לולאה המורכבת microtubules או לאבד את המבנה נימה שלה, וכתוצאה מכך מראה מפוזר ניקוב10. לולאות מיקרוטובולים קשורות לקונוסי גדילה מושהים, מה שמרמז על כך שמערך המיקרוטובולים יציב11. לכן, אנו יכולים לקבוע בעקיפין את התפתחות המיקרוטובול היציב ב- NMJ על ידי צביעת פוטש. הגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובול. הגורמים המשפיעים על יציבות רשת המיקרוטובולים ניתן למצוא על ידי ניתוח הצפיפות והצורה של מיקרוטובולים. במקביל, ניתן להצליב את מצב רשת המיקרוטובולים של תאי שריר עם התוצאה של NMJ כדי לקבל מסקנות מקיפות יותר.

פרוטוקולים רבים שימשו לחקר הרשת והדינמיקה של מיקרוטובולים. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו לעתים קרובות במחקרי מבחנה 12,13,14,15,16. לחלופין, כמה ניסויים in vivo השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לזהות את שלד הציטו-שלד17. על פי הקישור הספציפי של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית או צבעים כימיים לחלבונים או לדנ"א, השיטות המוצגות כאן מאפשרות זיהוי של רשתות מיקרוטובולים ב- NMJ ברמה של נוירונים בודדים in vivo, עם תוצאות שאומתו על ידי תצפיות בתאי שריר. פרוטוקול זה הוא פשוט, יציב וניתן לחזרה כאשר הוא משולב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה הזמינים ב- Drosophila melanogaster, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות פנוטיפיות ובדיקות גנטיות לתפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דיסקציה של זחלים

הערה: תמיסת הניתוח תמיסת מלח דמוית המולימפה (HL3.1)18 ותמיסת הקיבוע 4% פרפורמלדהיד (PFA)19,20 משמשים בטמפרטורת החדר מכיוון שהמיקרוטובולים מתפרקים כאשר הטמפרטורה נמוכה מדי.

  1. בחר זחל נודד 3rd instar עם מלקחיים קהים ארוכים. שטפו אותו עם HL3.1 והניחו אותו על צלחת הדיסקציה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
    הערה: זחל נודד 3rd instar מזוהה על ידי spiracle קדמי מסועף וזוחל סביב הצינור בערך 96 שעות (25 ° C)21.
  2. מקמו את הזחל עם הצד הגבי או הגחוני כלפי מעלה. זהה את הצד הגבי על ידי שתי קנה הנשימה הארוך ואת הגחון על ידי חגורות הדנטיקולה הבטן.
    1. בהתאם לרקמה להתבונן, לבחור דיסקציה גבית או גחון. זה יאפשר תצוגה מדויקת ומפורטת יותר של תחום העניין הספציפי. עבור NMJ ותצפית תאי שריר, חתכו את אזורי הזחל, הגב והגחון, בהתאמה.
  3. נעצו את ווי הפה ואת הזנב. כוונן את הפינים כדי לשמור על הזחל במצב מורחב. הוסיפו טיפה של HL3.1 לזחל כדי למנוע ממנו להתייבש.
    הערה: Ca2+ -free HL 3.1 ניתן להשתמש כדי למזער את התכווצות השרירים במהלך דיסקציה.
  4. השתמש במספריים המנתחים כדי לבצע חתך רוחבי קטן קרוב לקצה האחורי, אך אל תחתוך את הקצה האחורי. לאחר מכן חותכים לאורך קו האמצע הגחוני לכיוון הקצה הקדמי.
  5. הכניסו ארבע סיכות חרקים בארבע פינות הזחל. התאימו מחדש את סיכות החרקים כך שהזחל יימתח באופן מקסימלי לכל הכיוונים.
  6. השתמש במלקחיים כדי להסיר איברים פנימיים מבלי לפגוע בשרירים.

2. קיבעון

  1. הוסף 100 μL של PFA (4%) כדי לטבול פגרים במשך 40 דקות כאשר הפגרים עדיין נעוצים על צלחת הניתוח.
    אזהרה: אמצעי הגנה יעילים ננקטים כדי למנוע מגע ישיר עם העור או שאיפה, שכן PFA מהווה סכנה.
  2. פרקו את הפינים והעבירו את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. יש לשטוף את PFA במי מלח חוצצים פוספט 1x המכיל 0.2% Triton X-100 (0.2% PBST) כדי למלא צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל למשך 10 דקות על שייקר הסרת הצבע במהירות 15 סל"ד. חזור על תהליך הכביסה 5x.

3. אימונוציטוכימיה

  1. יש לטבול את הפגרים בחומר חוסם (סרום עיזים 5% ב-0.2% PBST) ולחסום למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את החומר החוסם והחלף אותו ב- 200 μL של הנוגדן הראשוני (למשל, אנטי α-טובולין, 1:1000; אנטי פוטש, 1:50) מדולל עם 0.2% PBST ב 4 ° C למשך הלילה. לדמיין microtubules שריר על ידי immunostaining עם חד שבטי אנטי α-tubulin. Anti-Futsch יכול לשקף בעקיפין את המורפולוגיה microtubule ב NMJ.
  3. לאחר הדגירה של הנוגדן הראשוני, יש לשטוף את הזחלים עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5x.
  4. לדגור על הזחלים עם 200 μL של נוגדן משני (למשל, עז נגד עכבר-488, 1:1000) מדולל עם 0.2% PBST בטמפרטורת החדר במשך 1.5 שעות בחושך.
  5. לאחר מכן, הוסיפו צבע גרעיני כגון TO-PRO(R) 3 יודיד (T3605) בריכוז של 1:1000 לתוך צינור הדגירה למשך 30 דקות בעת צביעת המיקרוטובולים בחושך20,22.
  6. יש לשטוף את הנוגדן המשני ואת הצבע הגרעיני עם 0.2% PBST למשך 10 דקות. חזור על הפעולה 5 פעמים בחושך.

4. הרכבה

  1. הניחו את פגר הזחל ב-0.2% PBST על מגלשת זכוכית והתאימו אותו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. ודא שהמשטח הפנימי של פגר הזחל פונה כלפי מעלה וכל פגרי הזחל מסודרים כרצונך.
  2. יש לספוג את עודפי תמיסת PBST בעזרת מגבון ולהוסיף בעדינות טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה.
  3. הניחו פתק כיסוי על המגלשה כדי לכסות את הזחלים המנותחים לאט ובעדינות כדי למנוע בועות.
  4. יש למרוח לק סביב הכיסוי. מקם את המגלשה בחלל החשוך כדי להפחית את הנחתת הפלואורסצנט.

5. רכישת תמונות

  1. כדי לקבל את התמונות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר, בחר את מטרת טבילת השמן 60x (צמצם מספרי 1.42) או דומה, והתאם את עוצמת הלייזר ואורך הגל בהתבסס על הניסוי.
  2. כדי לזהות את ה-NMJ, צלמו תמונות בשריר 4 במקטע A3 (כפי שמוצג במיקום באיור 1F). בחר מדפסת לייזר של 488 ננומטר כדי להפעיל את α-tubulin או Futsch ו- 543 ננומטר כדי להפעיל את מסלול ההדמיה של HRP. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 800 פיקסלים x 800 פיקסלים, זום דיגיטלי של 2.0 ומרווח הדמיה של 0.8 מיקרומטר ב-NMJ (איור 2).
  3. כדי לזהות את המיקרוטובולים בשריר, צלמו תמונות של שריר 2 במקטע A3-A5 (כפי שמוצג במיקום באיור 1G), מאחר שיש לו פחות ענפים בקנה הנשימה. בחר לייזר 488 ננומטר להפעלת α-טובולין ולייזר 635 ננומטר להפעלת מסלול ההדמיה T3605. התאימו את הפרמטרים לגודל מסגרת של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים, זום דיגיטלי של 3.0 ומרווח הדמיה של 0.4 מיקרומטר בתאי שריר (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדגמנו הליך שלב אחר שלב להדמיית רשת המיקרוטובולים הן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) והן בתאי שריר. לאחר דיסקציה בהתאם לתרשים הסכמטי (איור 1A-E), מתבצעת צביעה חיסונית, ולאחר מכן התמונות נצפות ונאספות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי (איור 1F,G).

ארגון מיקרוטובולים קדם-סינפטי ופוסט-סינפטי של NMJ יכול להיות מסומן עם אנטי-α-טובולין, ועל-ידי בחירת עובי השכבה של המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק בלייזר, המורפולוגיה של המיקרוטובולים של פרוסות שונות תוצג (איור 2A-C). פוטש שימש גם למעקב עצבי על ידי חשיפת ארגון המיקרוטובולים באקסונים של נוירונים. Anti-HRP משמש כדי לתייג את הקרום העצבי 10,23,24. צביעה משותפת עם נוגדנים נגד פוטש ונגד HRP מבוצעת כדי לזהות את מצב המיקרוטובולים באקסונים של נוירונים. צביעת פוטש יכולה לשקף את שפע המיקרוטובולים היציבים בנוירונים הפרה-סינפטיים של NMJ9. מלווה ספציפי לטובולין E (TBCE) ממלא תפקיד מכריע בפיתוח שלד הציטושלד MT. כאשר TBCE מופל בנוירונים פרה-סינפטיים, האות של אנטי-פוטש נעשה חלש ודק יותר, והכתמים בבוטונים הסופניים אינם ברורים או נעדרים23. טאו הוא חלבון הקשור למיקרוטובול שיש לו תפקיד חשוב בהרכבה וייצוב של מיקרוטובולים25,26. בדרוזופילה עם ביטוי חוץ רחמי של חלבון טאו אנושי פראי ומוטנטי אנושי, מתגלה ירידה בעוצמת אות פוטש במסופי NMJ20. לפי התוצאות של צביעת פוטש, עוצמת הצביעה של גזע האקסון הייתה חזקה יותר מזו של הענפים (איור 2D-F). מיקרוטובולים בקצה הענפים פחות יציבים ונוטים יותר לשינויים מורפולוגיים, כך שהדינמיקה של מיקרוטובולים יכולה לבוא לידי ביטוי על ידי צביעת המיקרוטובולים הסופיים.

שינויים מורפולוגיים של microtubules ניתן גם לדמיין בקלות22. ניתן להכתים לולאות מיקרוטובולים באנטי-פוטש ואנטי-α-טובולין. יתר על כן, ניתן להציג בבירור את צורתה של לולאה אחת, המאפשרת ניתוח כמותי. לדוגמה, קטנין הוא חלבון קוטע מיקרוטובולים הממלא תפקיד חשוב בוויסות הדינמיקה של מיקרוטובול. דווח כי תת-היחידה הקטליטית קטנין 60 משפיעה על המורפולוגיה של מיקרוטובולים22. מאו בנה מוטציה של קטנין 60 על ידי כריתה בתיווך P-element ו-uas-Katanin 60 על ידי החדרת pUAST-attB-Katanin 60 לכרומוזום השני ב-51D. העלייה בלולאות מיקרוטובולים שנגרמה על-ידי מוטציות Katanin 6017A הודגמה בבירור (איור 2A,B,D,E). נוסף על כך, בביטוי היתר של קטנין 60 ניתן היה לראות באופן משמעותי גם שברי MT קצרים בתוך הבוטונים הסופיים (איור 2C).

ניתן לראות את רשת המיקרוטובולים על ידי צביעה בנוגדנים α-טובולין בתאי שריר. רשת של מיקרוטובולים שהשתרעה סביב הגרעין נראתה בבירור (איור 3A). חלבון ניתוק המיקרוטובול קטנין מווסת את התפלגות רשת המיקרוטובולים22. במוטציה Katanin 6017A , תאי שריר היו בעלי עוצמת MT פרי-גרעינית מוגברת באופן משמעותי והציגו צרורות חזקים יותר בהשוואה לסוג הבר (איור 3B). יוצג פיצול של סיבי מיקרוטובול שנגרם על-ידי ביטוי יתר של קטנין 60 (איור 3C). לפיכך, הפרוטוקול מאפשר הדמיה של רשת המיקרוטובולים הן בתאי עצב והן בתאי שריר.

Figure 1
איור 1. הליך דיסקציה גבי של זחל דרוזופילה . (א-ה) הנוהל להכנת פגרי זחלים (שונה מ21). (A) הכנס שתי סיכות כל אחת לתוך ווי הפה והזנב של הזחל. (B) השתמש במספריים המנתחים כדי ליצור חתך רוחבי קטן קרוב לקצה האחורי. (C) חתכו לאורך קו האמצע הגחוני לכיוון הקצה הקדמי. (D) הכניסו ארבע סיכות חרקים בארבע פינות הזחל. (ה) השתמש במלקחיים כדי להסיר איברים פנימיים ולהתאים מחדש את מיקום הסיכות כדי למקם את הזחל בתנוחה מתאימה לצילום. (F) פאלואדין משמש לסימון שלד התא כדי לדמיין את השריר, ו-HRP משמש לתיוג קרום התא של תאי עצב. האזור הנצפה של NMJ מוגבל לשריר 4 במקטע A3, המוכתם יחד עם נוגדי HRP (ירוק) ופלואידין (מגנטה). הפאנל הימני מציג ייצוג סכמטי של מבנה השרירים המקומי. גודל מסגרת של 1024 פיקסלים x 1024 פיקסלים, זום דיגיטלי של 0.6, ומרווח הדמיה של כ 4 מיקרומטר באמצעות עדשה אובייקטיבית 10x (צמצם מספרי 0.45). (G) האזור הנצפה של תאי השריר מוגבל לשריר 2 במקטעים A3 עד A5, המוכתמים בפלואידין (מגנטה). החלק היחיד נלכד במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תמונות קונפוקליות של מיקרוטובולים בתוך NMJ על ידי אנטי α-טובולין או אנטי פוטש. בעמודה השמאלית מוצגים מסופי NMJ של בקרת w1118 (A), מוטנט Katanin 60 17A (B) וביטוי יתר עצבי של Katanin 60 (C), המוכתמים יחד עם anti-HRP (אדום) ואנטי-α-טובולין (ירוק). התמונות הן הקרנות מערימות z שלמות דרך כל השריר 4 NMJ של קטע הבטן A3. העמודה האמצעית מציגה תמונה ברורה יותר של מיקרוטובולים במסופי NMJ על ידי הסרת המיקרוטובולים מהשריר. העמודה הימנית מתארת את המורפולוגיה של מיקרוטובולים בבוטונים סינפטיים באמצעות תוכנת הניתוח. סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר. מסופי NMJ של גנוטיפים שונים מוכתמים יחד עם אנטי-HRP (אדום) ואנטי-פוטש (ירוק) (D-F). לולאות MT סומנו על ידי חצים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. נתון זה הותאםמ-22. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. צביעת רשת מיקרוטובולים פרי-גרעינית בתאי שריר הזחל דרוזופילה. (א-ג) שרירי הזחל מוכתמים יחד עם אנטי-α-טובולין (ירוק) כדי להראות את רשת המיקרוטובולים ו-T3605 (כחול) כדי להראות את הגרעין עבור בקרת W1118 (A), מוטציה של קטנין 6017A (B) וקטנין 60 של ביטוי יתר במערכת השרירים (C). התמונות הן הקרנות מערימות z שלמות ממראה מיקרוטובולים למרכז הגרעין. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן מתואר פרוטוקול לדיסקציה וצביעה חיסונית של דרוזופילה , זחלים, צמתים עצביים-שריריים ותאי שריר. ישנן מספר נקודות חיוניות שיש לקחת בחשבון. ראשית, הימנעות מפגיעה בשרירים הנצפים היא חיונית במהלך תהליך הדיסקציה. ייתכן שכדאי לתקן את הפילה לפני הסרת איברים פנימיים כדי למנוע מגע ישיר בין המלקחיים לשרירים. כדי למנוע נזק לשרירים או הפרדה מהאפידרמיס של הזחל, חשוב לוודא שמהירות השייקר לא תעלה על 15 סל"ד במהלך השטיפה והדגירה. בנוסף, יש צורך בשליטה מדויקת על הארכת העור כדי להבטיח צילום ברור ומלא של המורפולוגיה של NMJ. מומלץ לבצע ניסויים מקדימים כדי לייעל את ריכוז הנוגדנים, הקיבוע, החסימה וזמני הדגירה. משך הזמן הקבוע מוגבל לכ-40 דקות. קצר מדי או ארוך מדי אינו תורם immunostaining של רשת microtubule.

מיקרוטובולים בתאי עצב צפופים ומאתגרים לדמיין אותם בבירור באמצעות מיקרוסקופיה קונבנציונלית. בהשוואה לנוירונים, תאי השריר של דרוזופילה גדולים במיוחד, כאשר שריר 2 של קטע A3 בגודל של עד 40 מיקרומטר x 150 מיקרומטר, מה שהופך אותו למקובל להדמיה ברזולוציה גבוהה. לכן, שימוש בתאי שריר דרוזופילה לחקר ויסות חלבונים הקשורים לרשת מיקרוטובולים הוא גישה אינטואיטיבית וצלולה שיש לה ערך משמעותי באימות פנוטיפים NMJ20,22,23. בהשוואה לשיטההקודמת 27, שינינו את כיוון הדיסקציה מהגב לבטן על מנת לקבל חפץ ללא הפרעה. חיץ האלוטיון של השריר עם 0.2% PBST הוא עדין יחסית ומסייע בשמירה על שלמות השריר.

יש עדיין כמה מגבלות לגישה זו. כחלבון קושר מיקרוטובול, פוטש מתבטא אך ורק בתאי עצב ויכול לייצג בעקיפין מיקרוטובולים פולימריים. עם זאת, אם רק Futsch משמש כדי לדמיין את רשת microtubule במהלך סינון אינטראקציה, כמה חלבונים מועמדים עלול להחמיץ. α-טובולין או β-טובולין יכולים לייצג ישירות את רשת המיקרוטובולים, אולם שני חלבונים אלה נוכחים הן קדם-סינפטיים והן פוסט-סינפטיים, ולעיתים קשה להבחין ביניהם. יתר על כן, מספר רב של הטרודימרים α/β-טובולין מופצים בציטופלסמה, מה שאומר שתיוג α-טובולין או β-טובולין עשוי שלא להתאים להדמיה חיה, מכיוון שניתן לצפות בו זמנית הן בטובולין פולימרי והן בטובולין לא פולימרי.

התבוננות במיקרוטובולים מנוירונים מוטוריים לתאי שריר יכולה לספק הבנה מקיפה של מנגנוני התנועה מנקודת המבט של מעגלים עצביים, להקל על חקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ופתוגנזה של מחלות נוירולוגיות. הדמיה של רשת המיקרוטובולים במערכות מודל שונות מועילה לאימות תפקוד הגן מנקודות מבט מרובות באמצעות פרוטוקול זה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבחון את קולטנים postsynaptic של NMJ, אשר מועיל לחקר התקשורת בין סינפסות פלסטיות סינפטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר יינג שיונג על הדיונים וההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) ל- C. M. (31500839).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

Tags

צומת נוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה תאי שריר רשת מיקרוטובולים הפרעות נוירו-התפתחותיות מחלות נוירולוגיות חלבון טאו הקשור למיקרוטובול ספסטין חלבון ניתוק מיקרוטובול קטנין 60 שיתוק ספסטי תורשתי אימונוסטיין דרוזופילה מלנוגסטר מיקרוטובולים קדם-סינפטיים מיקרוטובולים פוסט-סינפטיים מוטציה ביטוי יתר תפקיד רגולטורי
שימוש בצומת עצבי-שרירי של <em>זחל דרוזופילה</em> ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin,… More

Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. X. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter