Summary
यहां, हम न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका-गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
सूक्ष्मनलिका नेटवर्क तंत्रिका तंत्र का एक आवश्यक घटक है। कई सूक्ष्मनलिकाएं नियामक प्रोटीन में उत्परिवर्तन न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों और न्यूरोलॉजिकल रोगों से जुड़े होते हैं, जैसे कि सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन ताऊ से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, सूक्ष्मनलिका सेवरिंग प्रोटीन स्पास्टिन और कैटानिन 60 क्रमशः वंशानुगत स्पास्टिक पैरापलेजिया और न्यूरोडेवलपमेंटल असामान्यताएं पैदा करते हैं। न्यूरॉन्स में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाना न्यूरोलॉजिकल विकारों के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए फायदेमंद है। हालांकि, न्यूरॉन्स का छोटा आकार और अक्षीय सूक्ष्मनलिका बंडलों की घनी व्यवस्था सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को चुनौतीपूर्ण बनाती है। इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन के साथ-साथ α-ट्यूबुलिन और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन फुटश के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन हमें प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक सूक्ष्मनलिकाएं दोनों का निरीक्षण करने की अनुमति देता है, और ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यहां, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में कैटनिन 60 को उत्परिवर्तित और अतिरंजित करके, और फिर न्यूरोमस्कुलर जंक्शन और मांसपेशियों की कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच करके, हम न्यूरोडेवलपमेंट में कैटनिन 60 की नियामक भूमिका को सटीक रूप से प्रकट करते हैं। इसलिए, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी), साइटोस्केलेटन के संरचनात्मक घटकों में से एक के रूप में, कोशिका विभाजन, कोशिका विकास और गतिशीलता, इंट्रासेल्युलर परिवहन और सेल आकार के रखरखाव सहित विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सूक्ष्मनलिका की गतिशीलता और कार्य को अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जैसे कि एमएपी 1, एमएपी 2, ताऊ, कैटानिन और काइन्सिन 1,2,3,4,5।
न्यूरॉन्स में, सूक्ष्मनलिकाएं अक्षतंतु और डेंड्राइट के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक हैं। सूक्ष्मनलिकाएं में असामान्यताएं शिथिलता और यहां तक कि न्यूरॉन्स की मृत्यु का कारण बनती हैं। उदाहरण के लिए, अल्जाइमर के रोगियों के मस्तिष्क में, ताऊ प्रोटीन हाइपरफॉस्फोराइलेशन सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिरता को कम करता है, जिससे न्यूरोलॉजिकल अनियमितताएंहोती हैं। इस प्रकार, सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की जांच न्यूरोडेवलपमेंट और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनन की समझ में योगदान देगी।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक मोटर न्यूरॉन एक्सॉन टर्मिनल और एक मांसपेशी फाइबर के बीच गठित परिधीय सिनैप्स है, जो सिनैप्टिक संरचना और कार्योंका अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट और शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। फ्यूच ड्रोसोफिला में एक प्रोटीन है जो स्तनधारियों में पाए जाने वाले सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन एमएपी 1 बी के समरूपहै। यह केवल न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और एनएमजे के सिनैप्टिक बटन 8,9 के विकास में भूमिका निभाता है। जंगली-प्रकार में, एनएमजे प्रक्रियाओं के केंद्र के साथ चलने वाले फिलामेंटस बंडलों को एंटी-फुटश के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कल्पना की जाती है। एनएमजे के अंत तक पहुंचने पर, इस बंडल में या तो सूक्ष्मनलिकाएं युक्त एक लूप बनाने या इसकी फिलामेंटस संरचना को खोने की क्षमता होती है, जिसके परिणामस्वरूप एक फैलाव और तीक्ष्ण उपस्थिति10 होती है। माइक्रोट्यूबुल्स लूप रुके हुए विकास शंकु से जुड़े होते हैं, जिससे पता चलता है कि सूक्ष्मनलिका सरणी स्थिर है11. इसलिए, हम अप्रत्यक्ष रूप से फुटश स्टेनिंग द्वारा एनएमजे में स्थिर सूक्ष्मनलिका विकास निर्धारित कर सकते हैं। ड्रोसोफिला लार्वा में मांसपेशियों की कोशिकाओं का बड़ा आकार सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। सूक्ष्मनलिकाएं नेटवर्क की स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारक सूक्ष्मनलिकाएं के घनत्व और आकार का विश्लेषण करके पाए जा सकते हैं। इसके साथ ही, मांसपेशियों की कोशिकाओं की सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की स्थिति को अधिक व्यापक निष्कर्ष प्राप्त करने के लिए एनएमजे के परिणाम के साथ क्रॉस-सत्यापित किया जा सकता है।
सूक्ष्मनलिकाएं के नेटवर्क और गतिशीलता की जांच के लिए कई प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं। हालांकि, इन शोधों ने अक्सर इन विट्रो अध्ययनों 12,13,14,15,16 पर ध्यान केंद्रित किया है। वैकल्पिक रूप से, विवो प्रयोगों में कुछ ने साइटोस्केलेटन17 का पता लगाने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है। प्रोटीन या डीएनए के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी या रासायनिक रंगों के विशिष्ट बंधन के अनुसार, यहां प्रस्तुत विधियां विवो में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर पर एनएमजे में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का पता लगाने की अनुमति देती हैं, जिसके परिणाम मांसपेशियों की कोशिकाओं में टिप्पणियों द्वारा पुष्टि की जाती है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में उपलब्ध शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त होने पर यह प्रोटोकॉल सरल, स्थिर और दोहराने योग्य है, जो विवो में तंत्रिका तंत्र में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क नियामक प्रोटीन की भूमिका के लिए फेनोटाइपिक परीक्षाओं और आनुवंशिक स्क्रीनिंग की एक विविध श्रृंखला को सक्षम करता है।
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Protocol
1. लार्वा का विच्छेदन
नोट: विच्छेदन समाधान हेमोलिम्फ जैसी खारा (एचएल 3.1)18 और फिक्सिंग समाधान 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 19,20 का उपयोग कमरे के तापमान पर किया जाता है क्योंकि तापमान बहुत कम होने पर सूक्ष्मनलिकाएं डिपॉलीमराइज्ड होती हैं।
- लंबे कुंद बल के साथ एक भटकने वाले तीसरेइनस्टार लार्वा को चुनें। इसे एचएल 3.1 के साथ धोएं और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन डिश पर रखें।
नोट: भटकने वाले 3वें इनस्टार लार्वा को शाखित पूर्ववर्ती स्पाइराकल द्वारा पहचाना जाता है और लगभग 96 घंटे (25 डिग्री सेल्सियस) 21 पर ट्यूब के चारों ओर रेंगता है। - लार्वा को पृष्ठीय या उदर पक्ष के साथ ऊपर रखें। दो लंबी श्वासनली द्वारा पृष्ठीय पक्ष और पेट के डेंटिकल बेल्ट द्वारा उदर की पहचान करें।
- निरीक्षण करने के लिए ऊतक के आधार पर, पृष्ठीय या उदर विच्छेदन का विकल्प चुनें। यह रुचि के विशिष्ट क्षेत्र के अधिक सटीक और विस्तृत दृश्य की अनुमति देगा। एनएमजे और मांसपेशी कोशिका अवलोकन के लिए, क्रमशः लार्वा पृष्ठीय और उदर क्षेत्रों को काट लें।
- मुंह के हुक और पूंछ को पिन करें। लार्वा को विस्तारित अवस्था में रखने के लिए पिन समायोजित करें। लार्वा को सूखने से बचाने के लिए उसमें एचएल 3.1 की एक बूंद डालें।
नोट: सीए2 + -मुक्त एचएल 3.1 का उपयोग विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों के संकुचन को कम करने के लिए किया जा सकता है। - पीछे के छोर के करीब एक छोटा अनुप्रस्थ कट बनाने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, लेकिन पीछे के छोर को न काटें। फिर पूर्ववर्ती छोर की ओर उदर मध्य रेखा के साथ काटें।
- लार्वा के चार कोनों पर चार कीट पिन डालें। रीजस्ट कीट पिन इस तरह से कि लार्वा सभी दिशाओं में अधिकतम रूप से फैला हुआ है।
- मांसपेशियों को नुकसान न पहुंचाते हुए आंतरिक अंगों को हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
2. निर्धारण
- 40 मिनट के लिए शवों को विसर्जित करने के लिए पीएफए (4%) के 100 μL जोड़ें, जबकि शवों को अभी भी विच्छेदन पकवान पर पिन किया गया है।
सावधानी: त्वचा या साँस लेने के सीधे संपर्क से बचने के लिए प्रभावी सुरक्षा उपाय किए जाते हैं, क्योंकि पीएफए एक खतरा है। - पिन को डिस्माउंट करें और नमूने को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन के साथ पीएफए को धोएं जिसमें 0.2% ट्राइटन एक्स -100 (0.2% पीबीएसटी) होता है ताकि 15 आरपीएम पर डीकलरिंग शेकर पर 10 मिनट के लिए 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को भरा जा सके। धोने की प्रक्रिया को 5 x दोहराएं।
3. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री
- शवों को ब्लॉकिंग एजेंट (0.2% पीबीएसटी में 5% बकरी सीरम) में डुबोएं और कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए ब्लॉक करें।
- ब्लॉकिंग एजेंट को हटा दें और इसे प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL (जैसे, एंटी-α-ट्यूबुलिन, 1: 1000; एंटी-फुटश, 1: 50) के साथ बदलें जो रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2% PBST के साथ पतला होता है। मोनोक्लोनल एंटी-α-ट्यूबुलिन के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा मांसपेशियों की सूक्ष्मनलिकाएं विज़ुअलाइज़ करें। एंटी-फुटश अप्रत्यक्ष रूप से एनएमजे में सूक्ष्मनलिका आकृति विज्ञान को प्रतिबिंबित कर सकता है।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन के बाद, लार्वा को 10 मिनट के लिए 0.2% पीबीएसटी के साथ धोएं।
- लार्वा को 200 μL द्वितीयक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी एंटी-माउस -488, 1: 1000) के साथ अंधेरे में 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 0.2% PBST के साथ पतला किया जाता है।
- इसके बाद, 20,22 के अंधेरे में सूक्ष्मनलिकाएं धुंधला करते समय 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग ट्यूब में 1: 1000 की एकाग्रता पर टीओ-प्रो (आर) 3 आयोडाइड (टी 3605) जैसे परमाणु डाई जोड़ें।
- द्वितीयक एंटीबॉडी और परमाणु डाई को 10 मिनट के लिए 0.2% पीबीएसटी के साथ धो लें। अंधेरे में 5x दोहराएं।
4. माउंटिंग
- लार्वा शव को एक ग्लास स्लाइड पर 0.2% पीबीएसटी में रखें और इसे स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि लार्वा शव की आंतरिक सतह ऊपर की ओर है और सभी लार्वा शवों को इच्छानुसार व्यवस्थित किया गया है।
- एक पोंछे के साथ अतिरिक्त पीबीएसटी समाधान को अवशोषित करें और धीरे से एंटीफैड माउंटिंग माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
- बुलबुले से बचने के लिए विच्छेदित लार्वा को धीरे-धीरे और धीरे से कवर करने के लिए स्लाइड पर एक कवरस्लिप रखें।
- कवरस्लिप के चारों ओर नाखून पॉलिश लगाएं। फ्लोरोसेंट क्षीणन को कम करने के लिए स्लाइड को अंधेरे स्थान में रखें।
5. छवि अधिग्रहण
- छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, 60x तेल विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर 1.42) या इसी तरह का चयन करें, और प्रयोग के आधार पर लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य को समायोजित करें।
- एनएमजे की पहचान करने के लिए, सेगमेंट ए 3 में मांसपेशी 4 में छवियों को कैप्चर करें (जैसा कि चित्रा 1 एफ में स्थान में दिखाया गया है)। α-ट्यूबुलिन या फुटश को सक्रिय करने के लिए 488 एनएम लेजर का चयन करें और एचआरपी इमेजिंग ट्रैक को सक्रिय करने के लिए 543 एनएम। पैरामीटर को 800 पिक्सेल x 800 पिक्सेल के फ्रेम आकार, 2.0 का डिजिटल ज़ूम और NMJ में 0.8 μm के इमेजिंग अंतराल में समायोजित करें (चित्रा 2)।
- मांसपेशियों में सूक्ष्मनलिकाएं की पहचान करने के लिए, खंड ए 3-ए 5 में मांसपेशी 2 की छवियों को कैप्चर करें (जैसा कि चित्रा 1 जी में स्थान में दिखाया गया है) क्योंकि इसमें कम श्वासनली शाखाएं हैं। α-ट्यूबुलिन को सक्रिय करने के लिए 488 एनएम लेजर और टी 3605 इमेजिंग ट्रैक को सक्रिय करने के लिए 635 एनएम लेजर चुनें। पैरामीटर को 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल के फ्रेम आकार, 3.0 का डिजिटल ज़ूम और मांसपेशी कोशिकाओं में 0.4 μm के इमेजिंग अंतराल में समायोजित करें (चित्रा 3)।
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Representative Results
हमने न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों (एनएमजे) और मांसपेशी कोशिकाओं दोनों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया का प्रदर्शन किया। योजनाबद्ध आरेख (चित्रा 1 ए-ई) के अनुसार विच्छेदन के बाद, इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन किया जाता है, और छवियों को बाद में लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या स्टीरियोस्कोपिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 एफ, जी) के तहत देखा और एकत्र किया जाता है।
एनएमजे के प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक माइक्रोट्यूबुल्स संगठन दोनों को एंटी-α-ट्यूबुलिन के साथ लेबल किया जा सकता है, और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की परत मोटाई का चयन करके, विभिन्न स्लाइस की सूक्ष्मनलिका आकृति विज्ञान प्रदर्शित किया जाएगा (चित्रा 2 ए-सी)। न्यूरॉन्स के अक्षतंतु में सूक्ष्मनलिका संगठन को प्रकट करके तंत्रिका अनुरेखण के लिए भी फुटश का उपयोग किया गया है। एंटी-एचआरपी का उपयोग न्यूरोनल झिल्ली10,23,24 को लेबल करने के लिए किया जाता है। न्यूरॉन्स के अक्षतंतु में सूक्ष्मनलिका की स्थिति का पता लगाने के लिए एंटी-फुटश और एंटी-एचआरपी एंटीबॉडी के साथ सह-धुंधला पन किया जाता है। फुटश धुंधला एनएमजे9 के प्रीसिनेप्टिक न्यूरॉन्स में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं की प्रचुरता को प्रतिबिंबित कर सकता है। ट्यूबुलिन-विशिष्ट चैपरोन ई (टीबीसीई) एमटी साइटोस्केलेटन के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जब टीबीसीई को प्रीसिनेप्टिक न्यूरॉन्स में गिरा दिया जाता है, तो एंटी-फुटश का संकेत कमजोर और पतला हो जाता है, और टर्मिनल बाउटन में धुंधलापन या तो अस्पष्ट या अनुपस्थित होताहै। ताऊ एक सूक्ष्मनलिका से जुड़ा प्रोटीन है जिसकी सूक्ष्मनलिका विधानसभा और स्थिरीकरण25,26 में महत्वपूर्ण भूमिका है। ड्रोसोफिला में मानव जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती मानव ताऊ प्रोटीन की अस्थानिक अभिव्यक्ति के साथ, एनएमजे टर्मिनलों पर फुटश सिग्नल की तीव्रता मेंकमी का पता चला है। फुटश स्टेनिंग के परिणामों के अनुसार, अक्षतंतु ट्रंक की धुंधला तीव्रता शाखाओं की तुलना में अधिक मजबूत थी (चित्रा 2 डी-एफ)। शाखाओं के अंत में सूक्ष्मनलिकाएं कम स्थिर होती हैं और रूपात्मक परिवर्तनों के लिए अधिक प्रवण होती हैं, इसलिए सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता को टर्मिनल सूक्ष्मनलिकाएं धुंधला करके परिलक्षित किया जा सकता है।
सूक्ष्मनलिकाएं के रूपात्मक परिवर्तन भी आसानी से देखे जा सकते हैं22. माइक्रोट्यूबुल्स लूप को एंटी-फुटश और एंटी-α-ट्यूबुलिन से दाग दिया जा सकता है। इसके अलावा, एक एकल लूप का आकार स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है, जो मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, कैटानिन एक सूक्ष्मनलिका-विच्छेदन प्रोटीन है जो सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। उत्प्रेरक सबयूनिट कैटानिन 60 को सूक्ष्मनलिकाएं22 की आकृति विज्ञान पर प्रभाव पड़ने की सूचना मिली है। माओ ने 51 डी पर दूसरे क्रोमोसोम में पीयूएएसटी-एटीबी-कैटनिन 60 डालकर पी-एलिमेंट-मध्यस्थता एक्सिशन द्वारा कैटनिन 60 म्यूटेंट और यूएएस-कैटनिन 60 का निर्माण किया है। कैटनिन 6017 ए उत्परिवर्तन के कारण सूक्ष्मनलिका लूप में वृद्धि स्पष्ट रूप से प्रदर्शित की गई थी (चित्रा 2 ए, बी, डी, ई)। इसके अलावा, कैटानिन 60 के ओवरएक्प्रेशन में, टर्मिनल बाउटन (चित्रा 2 सी) के भीतर छोटे एमटी टुकड़े भी महत्वपूर्ण रूप से देखे जा सकते हैं।
मांसपेशियों की कोशिकाओं में α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी के साथ धुंधला करके सूक्ष्मनलिका नेटवर्क देखा जा सकता है। नाभिक के चारों ओर फैले सूक्ष्मनलिकाएं का एक नेटवर्क स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था (चित्रा 3 ए)। सूक्ष्मनलिका सेवरिंग प्रोटीन कैटानिन सूक्ष्मनलिका नेटवर्क22 के वितरण को नियंत्रित करता है। कैटानिन 6017 ए उत्परिवर्ती में, मांसपेशियों की कोशिकाओं में पेरिन्यूक्लियर एमटी तीव्रता में काफी वृद्धि हुई थी और जंगली प्रकार की तुलना में मजबूत बंडल प्रदर्शित किए गए थे (चित्रा 3 बी)। कैटानिन 60 के अतिवृद्धि के कारण सूक्ष्मनलिका तंतुओं के विखंडन का प्रतिनिधित्व किया गया था (चित्रा 3 सी)। इस प्रकार, प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स और मांसपेशी कोशिकाओं दोनों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।
चित्र 1. ड्रोसोफिला लार्वा की पृष्ठीय विच्छेदन प्रक्रिया। (A-E) लार्वा शव तैयार करने की प्रक्रिया (21 से संशोधित)। (ए) लार्वा के मुंह के हुक और पूंछ में प्रत्येक में दो पिन डालें। (बी) पीछे के छोर के करीब एक छोटा अनुप्रस्थ कट बनाने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। (सी) पूर्ववर्ती छोर की ओर उदर मध्य रेखा के साथ काटें। (डी) लार्वा के चार कोनों पर चार कीट पिन डालें। (E) आंतरिक अंगों को हटाने के लिए बल का उपयोग करें और लार्वा को फोटोग्राफी के लिए उपयुक्त स्थिति में रखने के लिए पिन की स्थिति को बदलें। (एफ) फेलोइडिन का उपयोग मांसपेशियों की कल्पना करने के लिए साइटोस्केलेटन को लेबल करने के लिए किया जाता है, और एचआरपी का उपयोग न्यूरॉन्स की कोशिका झिल्ली को लेबल करने के लिए किया जाता है। एनएमजे का देखा गया क्षेत्र खंड ए 3 में मांसपेशी 4 तक सीमित है, जो एंटी-एचआरपी (हरा) और फैलोइडिन (मैजेंटा) के साथ सह-सना हुआ है। दाहिना पैनल स्थानीय मांसपेशियों की संरचना का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। फ्रेम आकार 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल, 0.6 का डिजिटल ज़ूम, और 10x उद्देश्य लेंस (संख्यात्मक अपर्चर 0.45) का उपयोग करके लगभग 4 μm का इमेजिंग अंतराल। (जी) मांसपेशियों की कोशिकाओं का देखा गया क्षेत्र ए 3 से ए 5 खंडों में मांसपेशी 2 तक सीमित है, जो फेलोइडिन (मैजेंटा) से सना हुआ है। एकल खंड को स्टीरियोस्कोपिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर किया जाता है। स्केल बार: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2. "एंटी-α-ट्यूबुलिन या एंटी-फुटश द्वारा एनएमजे के भीतर सूक्ष्मनलिकाएं की कॉन्फोकल छवियां"। डब्ल्यू1118 नियंत्रण (ए), कैटानिन 6017 ए उत्परिवर्ती (बी) और कैटानिन 60 (सी) के न्यूरोनल ओवरएक्प्रेशन के एनएमजे टर्मिनल, एंटी-एचआरपी (लाल) और एंटी-α-ट्यूबुलिन (हरे) के साथ सह-सना हुआ बाएं कॉलम में दिखाया गया है। ये चित्र पेट खंड ए 3 के पूरे मांसपेशी 4 एनएमजे के माध्यम से पूर्ण जेड-स्टैक्स से अनुमान हैं। मध्य स्तंभ मांसपेशियों से सूक्ष्मनलिकाएं हटाकर एनएमजे टर्मिनलों में सूक्ष्मनलिकाएं की एक स्पष्ट छवि दिखाता है। दाहिना स्तंभ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सिनैप्टिक बाउटन में सूक्ष्मनलिकाएं की आकृति विज्ञान को दर्शाता है। विभिन्न जीनोटाइप के एनएमजे टर्मिनल एंटी-एचआरपी (लाल) और एंटी-फुटश (हरे) (डी-एफ) के साथ सह-दाग वाले हैं। एमटी लूप तीर द्वारा इंगित किए गए थे। स्केल बार: 5 μm. इस आंकड़े को22 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3. ड्रोसोफिला लार्वा मांसपेशी कोशिकाओं में पेरिन्यूक्लियर माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क धुंधला हो जाता है। (A-C) लार्वा की मांसपेशियों को सूक्ष्मनलिका नेटवर्क दिखाने के लिए एंटी-α-ट्यूबुलिन (हरे) के साथ सह-दाग दिया जाता है और टी 3605 (नीला) मांसपेशियों की प्रणाली (सी) में डब्ल्यू1118 नियंत्रण (ए), कैटनिन 60 17 ए उत्परिवर्ती (बी) और कैटनिन 60 ओवरएक्प्रेशन के लिए नाभिक दिखाने के लिए। छवियां सूक्ष्मनलिकाएं की उपस्थिति से परमाणु के केंद्र तक पूर्ण जेड-स्टैक से अनुमान हैं। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां ड्रोसोफिला लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों और मांसपेशियों की कोशिकाओं के विच्छेदन और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विचार करने के लिए कई आवश्यक बिंदु हैं। सबसे पहले, विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान देखी गई मांसपेशियों को चोट से बचना महत्वपूर्ण है। बल और मांसपेशियों के बीच सीधे संपर्क को रोकने के लिए आंतरिक अंगों को हटाने से पहले फिलेट को ठीक करना उचित हो सकता है। लार्वा एपिडर्मिस से मांसपेशियों की क्षति या अलगाव से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि धोने और इनक्यूबेशन के दौरान शेकर की गति 15 आरपीएम से अधिक न हो। इसके अतिरिक्त, एनएमजे आकृति विज्ञान की स्पष्ट और पूर्ण फोटोग्राफी सुनिश्चित करने के लिए त्वचा विस्तार पर सटीक नियंत्रण आवश्यक है। एंटीबॉडी एकाग्रता, निर्धारण, ब्लॉकिंग और इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग करने की सलाह दी जाती है। निश्चित अवधि लगभग 40 मिनट तक सीमित है। बहुत छोटा या बहुत लंबा सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए अनुकूल नहीं है।
न्यूरॉन्स में सूक्ष्मनलिकाएं घनी और चुनौतीपूर्ण होती हैं जिन्हें पारंपरिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। न्यूरॉन्स की तुलना में, ड्रोसोफिला की मांसपेशी कोशिकाएं विशेष रूप से बड़ी होती हैं, जिसमें खंड ए 3 की मांसपेशी 2 40 μm x 150 μm तक मापती है, जिससे यह उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए उत्तरदायी होती है। इसलिए, सूक्ष्मनलिका नेटवर्क से जुड़े प्रोटीन के विनियमन की जांच के लिए ड्रोसोफिला मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग करना एक सहज और स्पष्ट दृष्टिकोण है जो एनएमजे फेनोटाइप20,22,23 को मान्य करने में महत्वपूर्ण मूल्य रखता है। पिछली विधि27 की तुलना में, हमने एक अबाधित वस्तु प्राप्त करने के लिए पृष्ठीय से पेट तक विच्छेदन दिशा को बदल दिया है। 0.2% पीबीएसटी के साथ मांसपेशियों का क्षालन बफर अपेक्षाकृत कोमल है और मांसपेशियों की अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है।
इस दृष्टिकोण के लिए अभी भी कुछ सीमाएं हैं। सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में, फुटश को विशेष रूप से न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और अप्रत्यक्ष रूप से बहुलकीकृत सूक्ष्मनलिकाएं का प्रतिनिधित्व कर सकता है। हालांकि, यदि इंटरैक्शन स्क्रीनिंग के दौरान सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए केवल फुटश का उपयोग किया जाता है, तो कुछ उम्मीदवार प्रोटीन छूट सकते हैं। α-ट्यूबुलिन या β-ट्यूबुलिन सीधे सूक्ष्मनलिका नेटवर्क का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, हालांकि, ये दो प्रोटीन प्री-सिनैप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक दोनों मौजूद हैं, और कभी-कभी अंतर करना मुश्किल होता है। इसके अलावा, साइटोप्लाज्म में बड़ी संख्या में α/β-ट्यूबुलिन हेटेरोडिमर्स वितरित किए जाते हैं, जिसका अर्थ है कि α-ट्यूबुलिन या β-ट्यूबुलिन को लेबल करना लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, क्योंकि पॉलीमराइज्ड और गैर-पॉलीमराइज्ड ट्यूबुलिन दोनों को एक ही समय में देखा जा सकता है।
मोटर न्यूरॉन्स से मांसपेशियों की कोशिकाओं तक सूक्ष्मनलिकाएं देखना तंत्रिका सर्किट के परिप्रेक्ष्य से आंदोलन तंत्र की व्यापक समझ प्रदान कर सकता है, न्यूरोडेवलपमेंटल प्रक्रियाओं और न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनन के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है। विभिन्न मॉडल प्रणालियों में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करना इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके कई दृष्टिकोणों से जीन फ़ंक्शन को सत्यापित करने के लिए फायदेमंद है। इस विधि का उपयोग एनएमजे के पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स का निरीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है, जो सिनैप्स और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के बीच संचार के अध्ययन के लिए फायदेमंद है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम पांडुलिपि पर चर्चा और टिप्पणियों के लिए डॉ यिंग जियोंग को धन्यवाद देते हैं। यह काम चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) से सीएम (31500839) को अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
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