Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV

Die Pandemie der anhaltenden Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wird durch das neuartige Coronavirus verursacht, das als schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)¹ bekannt ist. Aufgrund der starken Ansteckungsfähigkeit und der Fähigkeit von SAR-CoV-2 zur schnellen Übertragung entstand die COVID-19-Pandemie in der Stadt Wuhan, China, und breitete sich schnell auf der ganzen Welt aus. Dies führte schließlich zum Auftreten von Atemnotsymptomen und sogar zum Tod ^2,3,4. COVID-19 wurde in mehr als 213 Ländern zur Pandemie erklärt, wobei ein steiler Anstieg der Zahl der bestätigten Fälle erwartet wird, wie aus den in verschiedenen Forschungsstudien veröffentlichten Studien hervorgeht ^3,5. COVID-19 wird hauptsächlich durch kleine Tröpfchen übertragen, die infizierte Personen in die Umwelt abgeben und dann durch Einatmen oder engen Kontakt mit kontaminierten Oberflächen gefährdeten Personen ausgesetzt werden. Wenn diese Tröpfchen mit der Schleimhaut von Augen, Mund oder Nase in Kontakt kommen, kann sich eine Person infizieren⁶. Statistiken der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zeigen, dass es weltweit mehr als 76 Millionen bestätigte Fälle der Pandemie gibt, mit erschütternden 7 Millionen Todesfällen⁷. So stuften die Vereinten Nationen die durch die COVID-19-Krankheit verursachte Pandemie als Katastrophe ein, da sie sich direkt auf das Leben von Milliarden von Menschen auf der ganzen Welt auswirkt und weitreichende wirtschaftliche, ökologische und soziale Auswirkungen hat.

Initiativen im Bereich der öffentlichen Gesundheit, einschließlich gründlicher Tests, Früherkennung, Kontaktverfolgung und Fallisolierung, haben sich als entscheidend erwiesen, um diese Pandemie unter Kontrolle zu halten 8,9,10,11. In den Wintermonaten wird die Zirkulation anderer Atemwegsviren wie Influenza A und B mit COVID-19-ähnlichen Symptomen zunehmen, was es schwierig macht, COVID-19-Fälle frühzeitig zu identifizieren, aufzuspüren und zu isolieren. Jedes Jahr beginnt der Ausbruch der Influenza A und B im Spätherbst oder Anfang Januar mit einer vorhersehbaren Saisonalität¹². SARS-CoV-2 und Influenzaviren haben zahlreiche epidemiologische Merkmale gemeinsam. Außerdem gibt es Ähnlichkeiten in den anfälligen Bevölkerungsgruppen, zu denen Kinder, ältere Menschen, immungeschwächte Menschen und Personen mit chronischen Komorbiditäten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Herz- und Nierenversagen oder Diabetes gehören^12,13. Diese Viren teilen nicht nur gefährdete Bevölkerungsgruppen, sondern auch Übertragungswege und Atemtröpfchen¹⁴. Es wird erwartet, dass sich Patienten mit mehr als einem dieser Atemwegsviren infizieren können, wenn sich die Grippesaison dem¹⁴. nähert. Dazu muss das Screening auf SARS-CoV-2 und die Influenzaviren bei symptomatischen Patienten durchgeführt werden, bevor sie isoliert werden. Getrennte Tests für die drei Viren (SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B) sind aufgrund des weltweiten Mangels an Ressourcen für die Nukleinsäureextraktion und -diagnostik nicht möglich. Um sie alle in einer Reaktion zu screenen, muss eine Methode oder ein Test entwickelt werden.

Das Middle East Respiratory Syndrome (MERS)-CoV ist ein Familienmitglied des humanen Coronavirus (CoV). Die ersten MERS-CoV-Virusisolate stammten von einem Krankenhauspatienten in Saudi-Arabien, der im September 2012 an akuten Atemwegserkrankungen gestorben war¹⁵. Es gibt Hinweise, die darauf hindeuten, dass ein prominenter Reservoirwirt für MERS-CoV das Dromedar ist. Es ist erwiesen, dass Viren von infizierten Dromedaren zoonotisch sind und somit den Menschen infizieren können^16,17. Menschen, die mit diesem Virus infiziert sind, können es durch engen Kontakt auf andere übertragen¹⁸. Bis zum 26^. Januar 2018 gab es weltweit 2143 laborbestätigte Fälle von MERS-CoV-Infektionen, darunter 750 Todesfälle^. Die typischsten MERS-CoV-Symptome sind Husten, Fieber und Kurzatmigkeit. Es wurde auch berichtet, dass MERS-CoV-Infektionen Lungenentzündung, Durchfall und gastrointestinale Krankheitssymptome aufweisen²⁰. Derzeit gibt es keinen kommerziellen Impfstoff oder eine spezifische Behandlung für MERS-CoV. Daher ist eine schnelle und präzise Diagnose unerlässlich, um die weit verbreiteten MERS-CoV-Ausbrüche zu verhindern und MERS-CoV von der SARS-CoV-2-Erkrankung zu unterscheiden.

Bisher wurden viele Ansätze zum Nachweis dieser Viren vorgeschlagen, wie z. B. Multiplex-RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12^26,27, CRISPR/Cas9²⁸ und CRISPR/Cas3²⁹, Lateral-Flow-Immunoassay³⁰, papierbasierte biomolekulare Sensoren³¹, SHERLOCK-Tests in einem Topf³², DNA-Aptamer³³, schleifenvermittelte isotherme Verstärkung (LAMPE)^19,34 usw. Jede der oben genannten Methoden hat einzigartige Vor- und Nachteile in Bezug auf Sensitivität und Spezifität. Unter diesen Methoden ist der auf Nukleinsäureamplifikation basierende Test: Multiplex-qRT-PCR, die gebräuchlichste und gilt als Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und MERS-CoV.

In dieser Studie haben wir verschiedene Primer-Kombinationen und Sonden für den effektiven, genauen und gleichzeitigen Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV unter Verwendung von synthetischen Standard-Twist-Virus-RNAs entwickelt und bewertet. Die Multiplex-Assays, die entweder für MERS-CoV- oder SARS-CoV-2-Zielgene entwickelt wurden, werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfohlen. Diese Gene kodieren im Allgemeinen für Proteine und Komplexe, die zur Bildung eines Replikations-/Transkriptionskomplexes (RTC)³⁵ beitragen, wie z. B. die Region innerhalb des offenen Leserahmens 1a (ORF1a), die für den MERS-CoV-Assay verwendet wird. Darüber hinaus werden Strukturproteine von den Genen kodiert, die in diagnostischen Assays verwendet werden, wie z. B. die Upstream-Region des Hüllgens (upE) und das Nukleokapsid-Gen (N), die für MERS-CoV- bzw. SARS-Cov-2-Assays verwendet werden^35,36. Wir verwendeten das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T, um die RT-qPCR für den Nachweis von Viren zu etablieren³⁷. Der Virusnachweis, die Sensitivität, die Spezifität und der dynamische Bereich unseres einstufigen RT-qPCR-Kits und der Primer-Sets R3T wurden mit 10-fachen seriellen Verdünnungen der synthetischen Standard-Twist-RNAs getestet und bewertet. Die niedrigste praktische Nachweisgrenze lag bei etwa 10 Transkriptkopien pro Reaktion. Dadurch können das hauseigene einstufige RT-qPCR-Kit R3T und die Primer/Sonden-Sets erfolgreich für die routinemäßige gleichzeitige Diagnose von SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV, eingesetzt und implementiert werden.

1. Taq-Polymerase-Expression und -Reinigung

1. Konstruieren Sie ein Plasmid mit einem spaltbaren Hexa-Histidin-Tag am C-Terminus des Enzyms.
2. Transformieren Sie 50 ng des Expressionsvektors in den Stamm E. coli BL21-(DE3) gemäß dem Standardprotokoll³⁸.
3. Die transformierten Zellen werden in vier 6-l-Kolben mit je 2 l 2YT-Medienbrühe bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inokuliert, bis der OD 600 von 0,8 oder die Zellnummer 6,4 x 10⁸ erreicht ist.
4. Die Taq-Polymerase-Expression wird mit 0,5 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und bei 16 °C für 18 h unter Schütteln inkubiert.
5. Ernten Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 7808 x g herunterschleudern. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 ml eines eiskalten Taq-Polymerase-Lysepuffers (Tabelle 1) in 5 ml/g Zellpellet.
6. Die Zellen werden 45 min lang mit Lysozym (2 mg/ml Lysepuffer) und Proteaseinhibitoren inkubiert und dann das Lysat bei 30 kpsi durch einen Zelldisruptor geleitet und bei 22.040 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu trennen.
7. Den Überstand 15 min bei 85 °C erhitzen. Schleudern bei 95.834 x g für 1 h bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn auf Eis mit einem 0,45-μm-Filter.
8. Führen Sie eine Proteinreinigung mit Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) durch, indem Sie die Probe zunächst durch eine Ni-NTA HP 5 mL-Säule mit einer Flussrate von 4 ml/min unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer A führen (Tabelle 2; Abbildung 1A).
9. Waschen Sie mit 10 Säulenvolumina (CV) Taq-Polymerase-Puffer A und 4% Taq-Polymerase-Puffer B (Tabelle 2). Das gebundene Protein wird mit einem linearen Gradienten unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer B über 20 CV in einer 100-ml-Flasche eluiert.
10. Der Eluent in der 100-ml-Flasche wird durch eine 5-ml-Kationenaustauschsäule mit 4 ml/min unter Verwendung von Taq-Polymerase-Puffer C geleitet (Tabelle 2; Abbildung 1A).
11. Mit 20 CV 100 % Taq-Polymerase-Puffer C und 5 % Taq-Polymerase-Puffer D waschen (Tabelle 2).
12. Elute mit einem linearen Gradienten unter Verwendung des Taq-Polymerase-Puffers D (Tabelle 2) von 5 % bis 100 %.
13. Überprüfen Sie die eluierten Fraktionen, indem Sie eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese ³⁹ durchführen, gefolgt von einer Gelfärbung ⁴⁰ , wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, nehmen Sie 10 μl von jeder Fraktion und fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x SDS-Ladefarbstoff hinzu. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 90^°C denaturiert. Laden Sie die Proben auf 10% SDS-PAGE Gel und lassen Sie das Gel 25 Minuten lang bei 200 V laufen. Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue und entfärben Sie es anschließend.
14. Alle Fraktionen, die gereinigte Taq-Polymerase enthalten, werden gesammelt und bei 4 °C gegen den Taq-Polymerase-Speicherpuffer (Tabelle 3) dialysiert. Bereiten Sie kurz 2 l des Speicherpuffers vor und tauchen Sie die Dialysekassette 2 Minuten lang in den Puffer, um sie zu hydratisieren. Die gesammelten Fraktionen werden mit einer Nadel in die Dialysekassette injiziert und über Nacht im Dialysepuffer bei 200 U/min am Rührer belassen.
15. Nach der Dialyse wird die Proteinkonzentration mit einem Spektralphotometer gemessen, 10 μl Aliquots hergestellt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
    HINWEIS: Filtern Sie alle Puffer für die Aufreinigung mit einem 0,45-μm-Filter, bevor Sie sie in das FPLC-System laden.

2. MMLV-RT-Expression im Insektenzellexpressionssystem und Aufreinigung

1. Generierung und Isolierung von Bacmid-DNA
   1. Klonen Sie die Sequenz von MMLV-RT mit einem C-terminus-spaltbaren TEV-8xHis-Streptokokken-Tag, wie zuvor beschrieben⁴¹.
   2. Mischen Sie 100 ng des Expressionsvektors in 50 μl DH10Bac-Zellen und mischen Sie vorsichtig durch Klopfen auf das Röhrchen.
   3. Die Zellen 15 Minuten lang auf Eis inkubieren. Die Zellen werden 1 min lang bei 42 °C einem Hitzeschock unterzogen.
   4. Sofort auf Eis umfüllen und 400 μl S.O.C.-Medium hinzufügen. Bei 37 °C unter Schütteln 4 h inkubieren.
   5. Platte 10 μl und 15 μl der Mischung auf LB-Agar-Platten, die drei Antibiotika enthalten; 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamicin zusammen mit 40 μg/ml IPTG und 100 μg/ml X-Gal für die blau-weiße Selektion.
   6. Die Platten 48 h bei 37 °C inkubieren. Wählen Sie mehrere weiße Kolonien und eine blaue Kolonie als Kontrolle aus und streifen Sie sie erneut auf frische LB-Agarplatten, die die oben genannten Antibiotika enthalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   7. Nachdem Sie den weißen Phänotyp bestätigt haben, wählen Sie ein paar Kolonien aus und inokulieren Sie sie in 10 ml LB-Medien mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamicin in 50-ml-Röhrchen.
   8. Die Kultur wird über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 22.040 x g herunterdrehen.
   9. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl Resuspensionslösung aus dem Miniprep-Kit (diese Lösung muss gemäß den Anweisungen des Herstellers gehandhabt werden), dann überführen Sie die Lösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   10. 250 μl Lyselösung hinzufügen, vorsichtig mischen und 3 Minuten lang inkubieren. 350 μl Neutralisationslösung zugeben, 2x-3x invertieren und bei 22.040 x g 10 min zentrifugieren.
   11. Den Überstand in ein frisches Röhrchen überführen und ein gleiches Volumen eiskaltes Isopropanol zugeben und 30 min bei -20 °C inkubieren.
   12. Die gefällte DNA wird durch Schleudern bei 22.040 x g für 10 Minuten pelletiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 2x mit 700 μl 70% eiskaltem Ethanol.
   13. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, ohne das Pellet zu berühren. Lassen Sie das Pellet 5-10 Minuten lang in der Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen oder bis keine Flüssigkeit mehr im Rohr zu sehen ist. Lösen Sie das Pellet in 100 μl EB-Puffer auf.
2. Bacmid-Transfektion und Virus-Amplifikation
   1. Vorbereitung des P1-Virus
      1. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte ~ 9 x 10⁵ Zellen/Well in 2 ml Insektenzellkulturmedium aussäen.
      2. Inkubieren Sie die Platte ~30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen anheften können.
      3. Bereiten Sie die Bacmid/Fugene-Mischung wie folgt zu: Mischen Sie 1 μg Bacmid-DNA und 300 μl Insektenzellmedien in einem Röhrchen. Mischen Sie in einem anderen Röhrchen 8 μl Transfektionsreagenz und 300 μl Insektenzellmedien. Mischen Sie beide Mischungen durch vorsichtiges Pipettieren und lassen Sie sie ~30 Minuten bei Raumtemperatur stehen, damit sich der Bacmid/Transfektionsreagenz-Komplex bilden kann.
      4. Geben Sie die Bacmid-Komplexmischung (~210 μl) tropfenweise in jede Vertiefung und verschließen Sie die Platte mit einer transparenten Folie.
      5. Die Platte bei 27 °C für 3-4 Tage inkubieren.
      6. Man nehme das Medium, das das Virus enthält, füge FBS (Endkonzentration 2 %) hinzu, filtere mit einem 0,45-μm-Filter und lagere es bei 4 °C im Dunkeln als P1-Virusbrühe.
   2. Vorbereitung des P2-Virus
      1. Transfektieren Sie 50 ml Insektenzellen bei 2 x 10⁶ Zellen/ml mit 3 ml P1-Virus in einem Nährkolben.
      2. Bei 27 °C mit Schütteln bei 100 U/min für 4-6 Tage inkubieren, bis der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen 25%-30% erreicht.
      3. Bei 300 x g 10 min zentrifugieren und den virushaltigen Überstand auffangen.
      4. FBS bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugeben, durch 0,45 μm Filter filtrieren und jeweils 1 mL aliquotieren und bei -80 °C als P2-Virusbrühe lagern.
   3. Vorbereitung des P3-Virus
      1. 100 ml Insektenzellen bei 2 x 10⁶ Zellen/ml mit den 2 ml P2-Virus in einem Nährkolben transfektiert.
      2. Bei 27 °C unter Schütteln bei 100 U/min für 3-4 Tage inkubieren, bis der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen 15%-20% erreicht.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 Minuten und sammeln Sie den Überstand, der das Virus enthält.
      4. FBS bis zu einer Endkonzentration von 2 % zugeben. Filtern Sie durch einen 0,45-μm-Filter. Es kann im Dunkeln bei 4 °C 1 Monat gelagert werden.
3. Expression und Aufreinigung von MMLV-RT in Insektenzellen
   1. 5 ml P3-Virus werden frischen Insektenzellen mit einer Dichte von 2 x 10⁶ Zellen/ml (700 ml/2-l-Kolben) in insgesamt 6 Kolben gegeben.
   2. Ernten Sie die Zellen nach 55-60 Stunden nach der Transfektion, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 7808 x g schleudern.
   3. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 ml MMLV-RT-Lysepuffer (Tabelle 4). Das Lysat wird bei 15 kpsi durch einen Zelldisruptor geleitet und bei 22.040 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
   4. Den Überstand in neue Röhrchen überführen und bei 95.834 x g bei 4 °C für 1 h wieder herunterschleudern. Sammeln Sie den Überstand und filtern Sie ihn mit einem 0,45-μm-Filter auf Eis.
   5. Beginnen Sie mit der Proteinaufreinigung mit FPLC, indem Sie die Probe zunächst durch die Ni-NTA Excel 5-ml-Säule (Abbildung 1B) mit einer Flussrate von 4 ml/min unter Verwendung von MMLV-RT-Puffer A führen (Tabelle 5).
   6. Waschen Sie die Säule mit 10 CV MMLV-RT-Puffer A und 4 % MMLV-RT-Puffer B (Tabelle 5) und eluieren Sie das Protein mit dem linearen Gradienten von MMLV-RT-Puffer B über 20 CV in einer 100-ml-Flasche.
   7. Führen Sie die eluierte Probe durch die Streptokokken-5-ml-Säule (Abbildung 1B), die mit dem MMLV-RT-Puffer C äquilibriert ist (Tabelle 5).
   8. Waschen Sie die Säule mit 10 CV 100% MMLV-RT Puffer C und eluieren Sie das Protein mit einem linearen Gradienten mit 20 CV Puffer D (Tabelle 5).
   9. Überprüfen Sie die eluierten Fraktionen, indem Sie SDS-PAGE wie in den Schritten 1.13.-1.14 durchgeführt werden. und sammeln Sie die Fraktionen, die gereinigtes MMLV-RT enthalten, das bei 4 °C gegen den MMLV-RT-Speicherpuffer (Tabelle 6) dialysiert werden soll.
   10. Messen Sie die Proteinkonzentration mit Nanodrop, aliquot, schockfrosten Sie es in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C.
       HINWEIS: Filtern Sie alle Puffer für die Aufreinigung mit einem 0,45-μm-Filter, bevor Sie sie in das FPLC-System laden.

3. Herstellung von hauseigenen Multiplex-R3T-Einschritt-RT-qPCR-Kit-Komponenten

1. Vorbereitung der Puffermischung
   1. Bereiten Sie den 2x-Puffer für die RT-qPCR-Reaktion vor, der die zuvor in³⁷ gezeigten Reagenzien enthält. Bereiten Sie alle Reagenzien in DNase/RNase-freiem Wasser vor und lagern Sie die Puffermischung in einem Gefrierschrank bei -20 °C.
2. Primer- und Sondensets und Primer Mischungsvorbereitung
   HINWEIS: Die verwendeten Sonden und Primer sind in Tabelle 7 aufgeführt. Das Influenza- und SARS-CoV-2-Multiplex-Kit enthält 3 Sonden und 4 Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets. Die Sonden werden an den 5′-Enden mit den Reportern 6-Carboxyfluorescein (FAM) für InfA, Texas Red-XN für SARS-CoV-2 (N-Gen) und Yakima Yellow für InfB markiert. Das MERS-CoV- und SARS-CoV-2-Multiplex-Kit enthält 3 Sonden und 3 Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets. Die Sonden werden auch an den 5′-Enden mit den Reportern Texas Red-XN für MERS-CoV (ORF1a-Gen), VIC für MERS-CoV (UpE-Gen) und 6-Carboxyfluorescein (FAM) SARS-CoV-2 (N-Gen) markiert.
   1. Bereiten Sie eine Primermischung mit allen in Tabelle 7 aufgeführten Primern und Sonden mit einer Endkonzentration von 6,7 μM für jeden Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 1,25 μM für jede Sonde in einem 1,5-ml-Röhrchen vor. Lagern Sie die Grundiermischung im Gefrierschrank bei -20 °C. Verwenden Sie Elutionspuffer, um das erforderliche Volumen auszugleichen.
3. Vorbereitung der Enzymmischung
   1. Bereiten Sie die Mischung aus Taq-Polymerase (30 U/μl) und MMLV-RT (60 ng/μl) Enzym im Taq-Polymerase-Speicherpuffer vor, wie in Tabelle 3 gezeigt, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Führen Sie diesen Schritt auf Eis durch und lagern Sie die Enzymmischung bei -20 °C.
4. RNA-Vorlage
   1. Resuspendieren Sie synthetische RNAs von SARS-CoV-2, Influenza A H1N1, Influenza A H3N2, Influenza B und MERS-CoV separat in 100 μl 1x Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tri-Cl und 1 mM EDTA (pH 8,0), um einen Vorrat von 1 x 10⁶ RNA-Kopien/μl herzustellen.
   2. Mischen Sie synthetische RNAs für die RT-qPCR in den folgenden Konfigurationen: 1) SARS-CoV-2, Influenza A und Influenza B durch Zugabe von 5 μl von jedem Virusstamm zu einem Volumen von 50 μl, um 1 x 10⁵ RNA-Kopien/μl herzustellen; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV durch Zugabe von 5 μl von jedem Virusstamm zu einem Volumen von 50 μl, um 1 x 10⁵ RNA-Kopien/μl herzustellen. 10-fache serielle Verdünnungen jeder synthetischen RNA-Mischung im Bereich von 1 x 10⁵ RNA-Kopien/μl bis 10 RNA-Kopien/μl herstellen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie eiskaltes DNase-/RNase-freies Wasser verwenden, um die serielle Verdünnung der Vorlagen vorzubereiten.

4. Hauseigener Multiplex-Test für SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2, MERS-CoV einstufiger RT-qPCR-Test

HINWEIS: Desinfizieren Sie die Oberflächen des Arbeitsplatzes und verwenden Sie eine 96-Well-Plattenschablone, um das PCR-Plattenlayout zu planen.

1. Vorbereitung der 96-Well-Platte
   1. 2x Puffer- und Primermischung auftauen. Halten Sie die Enzymmischung auf Eis.
   2. Geben Sie in jede Vertiefung 10 μl 2x Puffermischung, 1,5 μl der Primermischung, 1 μl Enzymmischung, 6,5 μl DNase/RNase-freies Wasser und 1 μl der entsprechenden RNA-Mischung, die getestet werden muss. Das Endvolumen in jeder Vertiefung beträgt 20 μl. Bitte beachten Sie das vorbereitete Layout, um Hilfe für diesen Schritt zu erhalten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Mastermix basierend auf der Anzahl der Reaktionen herzustellen, die alle Reagenzien mit Ausnahme der RNA-Probe enthalten, um eine Verzerrung beim Pipettieren zu vermeiden. Führen Sie die Reaktionen außerdem doppelt oder dreifach durch, um technische Fehler zu vermeiden.
   3. Versiegeln Sie die Platte mit einem selbstklebenden PCR-Plattensiegel und zentrifugieren Sie sie kurz für 1 Minute, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Platte aufzufangen. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung das gleiche Flüssigkeitsvolumen hat und frei von Blasen ist, bevor Sie die Proben in das qPCR-Gerät überführen.
      HINWEIS: Alle PCR-Reaktionen müssen auf Eis aufgebaut werden.
2. PCR-Programm
   1. Öffnen Sie das Echtzeit-qPCR-Maschinenprogramm und wählen Sie die folgenden experimentellen Eigenschaften aus:
      Der Blocktyp: Schnell 96-Well (0,1 ml)
      Versuchsaufbau: Standardkurve
      Reagenzien: TaqMan-Reagenzien
      Ausführungseigenschaften: Standard.
   2. Definieren Sie alle Genziele und ihren Reporterfarbstoff, wie in Tabelle 7 dargestellt. Definieren Sie außerdem Probennamen für jede zu testende Reaktion, um die Analyse der Amplifikationskurven zu erleichtern.
   3. Weisen Sie dem Plattenlayout des Programms Ziele und Proben basierend auf der 96-Well-Platte zu.
   4. Stellen Sie das folgende Zyklusprogramm im PCR-Gerät wie folgt ein:
      55 °C für 10 min
      40 Zyklen: 94 °C für 1 min
      94 °C für 10 s
      68 °C für 10 s
      68 °C für 20 s; hier Fluoreszenz aufnehmen.
   5. Übertragen Sie die Platte auf das real-time qPCR-Gerät und legen Sie sie in die Halterung, um die richtige Ausrichtung der Platte zu gewährleisten, und starten Sie den Lauf.
   6. Wählen Sie den Speicherort der Datei aus, um die experimentellen Daten zu speichern.
3. Datenanalyse
   1. Es ist wichtig, zunächst die Amplifikationsplots zu untersuchen, die durch das qPCR-Programm erzeugt werden. Analysieren Sie die Nachweisgrenze, um die minimale RNA-Konzentration zu bestimmen, die nachgewiesen werden kann.
   2. Tragen Sie den Logarithmus der RNA-Kopienzahl auf der x-Achse und den entsprechenden durchschnittlichen Ct-Wert auf der y-Achse auf, um die Empfindlichkeit des Assays zu beurteilen. Die Steigung und der R² geben die Zuverlässigkeit und Effizienz der Reaktion an.

In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte im diagnostischen Ansatz zum Nachweis gängiger Atemwegsviren mit PCR-Ansätzen 21,22,23,24,25. Trotz dieser Fortschritte wurde der Multiplex-Ansatz, der den Nachweis mehrerer Viren in einem einzigen Test ermöglicht, jedoch noch nicht weit verbreitet, insbesondere in der RT-qPCR-Plattform. Diese Methode wurde erfolgreich unter Verwendung synthetischer RNA-Viren und der internen Optimierung von Reaktionskomponenten implementiert37. Die Spezifität, Sensitivität und Zuverlässigkeit des diagnostischen Assays wurden durch die Verwendung einer Nachweisgrenzanalyse als hoch bewertet. Der vorgestellte Ansatz könnte die Effizienz und Genauigkeit der Diagnose von Atemwegsviren erheblich verbessern, die Notwendigkeit mehrerer Tests verringern und das Risiko von Fehldiagnosen minimieren, wie in43. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Vorteile dieses Ansatzes anhand von Patientenproben zu untersuchen und seine Anwendung in der klinischen Praxis zu fördern.

Expression und Aufreinigung der Histidin-markierten Taq-DNA-Polymerase
Basierend auf dem etablierten Protokoll der Taq-DNA-Polymerase-Expression und -Reinigung44 wurde das N-terminale Histidin-markierte Taq-DNA-Polymerase-Plasmid unter der Kontrolle eines Kälteschock-Promotors konstruiert, um den Expressions- und Reinigungsprozess zu erleichtern, wie oben erläutert (Abbildungen 1A und Abbildung 2A). Durch einfaches Ändern der IPTG-Konzentration und -Temperatur kann das Expressionsniveau dieses neuartigen Konstrukts leicht kontrolliert werden. Die Inkubation von Zellen, die das Taq-DNA-Polymerase-Plasmid bei 16 °C mit 1 mM IPTG enthielten, zeigte eine erhöhte Expression der His-Taq-DNA-Polymerase. Darüber hinaus erforderte das früher etablierte Protokoll44 zeitaufwändige Fällungsschritte aus Polyethylenimin (PEI), die mit dem hier verwendeten Konstrukt übersprungen werden können, da die Reinheit des Endprodukts nicht beeinträchtigt wurde und mit der kommerziell erhältlichen Taq-Polymerase vergleichbar war (Abbildung 2B). Die gereinigte Taq-Polymerase migrierte langsamer als die kommerzielle, da die Linkerpeptide zwischen dem Enzym und dem Histidin-Tag am N-Terminus vorhanden waren. Die Taq-DNA-Polymerase wurde erfolgreich mit 0,98 mg/L E. coli-Kultur aus reinem Protein hergestellt.

Expression und Aufreinigung der doppelten His- und Streptokokken-markierten MMLV-Reverse-Transkriptase
Das Baculovirus-Expressionssystem wurde verwendet, um MMLV-RT mit einem C-terminalen Doppel-His und Streptokokken-Tag in Insektenzellen (Sf9) zu exprimieren, wie in Abbildung 2A beschrieben. Eine frühere Studie zeigte, dass das C-terminale markierte MMLV-RT eine höhere Aktivität aufweist, wenn sowohl das N-terminale markierte Protein als auch das C-terminale markierte Protein in Seidenraupen unter Verwendung des Seidenraupen-Baculovirus-Expressionsvektorsystems (Seidenraupen-BEVS) synthetisiert wurden41. Um ein homogenes MMLV-RT-Protein herzustellen, wurden die gleichen Strategien und das gleiche Protokoll wie in der oben genannten Studie verwendet. Als Ergebnis wurde eine verbesserte Expression und mehr als 95 % reines Protein mit einer Ausbeute von 7,5 mg/L Insektenzellkultur erreicht, wie das SDS-PAGE-Gelergebnis zeigt (Abbildung 2C).

Optimierung und Standardisierung der gemultiplexten qRT-PCR
Ein optimierter und entwickelter intern entwickelter Multiplex-RT-qPCR-Test wurde nach Runden der Puffer- und Primermischungsoptimierung erfolgreich zusammengestellt und hergestellt, um drei verschiedene gängige Atemwegsviren gleichzeitig zu detektieren (Abbildung 3)37. Das erste Kit wurde entwickelt, um auf das SARS-CoV-2-N-Gen, das Influenza-A-H1N1- und H3N2-Gen sowie das Influenza-B-Gen abzuzielen. und das zweite Kit ist für das SARS-CoV-2-N-Gen, das MERS-ORF1a- und das upE-Gen. Somit können beide Kits alle drei Ziele erfolgreich und gleichzeitig erkennen, wie der hier vorgestellte Workflow (Abbildung 3). Synthetische RNA-Proben von jedem der in diesem Protokoll verwendeten Viren wurden amplifiziert, was auf die Möglichkeit hinweist, z. B. ein Multiplex-Kit für den Nachweis gängiger Atemwegsviren zu verwenden. Die Sensitivität dieses diagnostischen Tests ist vergleichbar mit den zuvor berichteten Ergebnissen in Patientenproben. In Fällen, in denen Patienten grippeähnliche Symptome zeigen, hat die Verwendung einer gemultiplexten Echtzeit-RT-qPCR vergleichbare Ergebnisse mit dem SARS-CoV-2-, Influenza-A- und Influenza-B-Multiplex-Assay gezeigt45.

Sensitivität und Nachweisgrenze des hauseigenen gemultiplexten RT-qPCR-Kits gegenüber gängigen Atemwegsviren
Die Wirksamkeit des hauseigenen Multiplex-Kits wurde anhand von zwei Primer-Mix-Sätzen und der entsprechenden synthetischen RNA für jedes Kit bewertet, wie im Multiplex-RT-qPCR-Workflow dargestellt (Abbildung 3). Unter Verwendung jeder Primermischung mit 10-facher serieller Verdünnung jeder synthetischen RNA-Mischung im Bereich von 10 bis 105 Kopien/μL als Template können die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze der beiden entwickelten gemultiplexten RT-qPCR mit Hilfe der Standardkurvenanalyse bestimmt werden. Dies geschieht in drei unabhängigen Wiederholungen jedes Tests, um die Wirksamkeit und Konsistenz des gemultiplexten RT-qPCR-Kits zu bestätigen. Infolgedessen können die beiden hier entwickelten Kits alle drei Zielgene gleichzeitig mit nur 10 RNA-Kopien/Reaktion erfolgreich amplifizieren, wie die Amplifikationskurve und die Nachweisgrenze (LoD) zeigen (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die Steigung und die R2-Werte jeder Kurve wurden verwendet, um die Effizienz der einzelnen Assays zu bewerten (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die R2-Werte lieferten eine Schätzung der Güte der linearen Anpassung an die Datenpunkte. In einem effizienten qPCR-Assay sollteR2 sehr nahe oder größer als 0,90 liegen. Die Amplifikationseffizienzen von Influenza A, Influenza B und SARS-CoV-2 bzw. MERS-CoV und SARS-CoV-2 Titrationen lagen bei über 99 % für alle Primer-Sets (Abbildung 4 und Abbildung 5). Darüber hinaus belegen die kleinen Fehlerbalken die Reproduzierbarkeit jedes gemultiplexten RT-qPCR-Kits. Es ist wichtig zu beachten, dass beide Multiplex-Kits keine Primer-Dimerbildung zeigten, da es keine Amplifikation mit der Negativkontrolle gibt (Daten nicht gezeigt). Somit hat das Design beider Kits alle Zielgene erfolgreich mit Zuverlässigkeit, Spezifität und Sensitivität amplifiziert.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Zusammenstellung des Multiplex-RT-qPCR-Kits in einem Schritt. Die Zusammenstellung des Kits beginnt mit der Expression und Aufreinigung der benötigten Enzyme, Taq-DNA-Polymerase und MMLV-Reverse-Transkriptase. Beide Enzyme mussten durch zwei Spalten geleitet werden, wie in der Abbildung dargestellt. Zweitens folgte auf die Reinigung die Optimierung der Reaktionsbedingungen und des thermischen Zyklusprogramms, was zu optimalen Bedingungen für das Multiplex-Testkit führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Plasmidkonstrukte und die Aufreinigungsergebnisse von His-Taq Pol und C-His/Streptokokken MMLV-RT. (A) Schematische Darstellung der rekombinanten His-Taq Pol- und C-His/Streptokokken-MMLV-RT-Expressionsplasmide. Abkürzungen: CSPA-Promotor - Kälteschock-Protein-A-Promotor; RBS - Ribosomen-Bindungsstelle; 6x His - His-Tag mit sechs Histidinen; TEE - translationsförderndes Element; Taq ORF - Taq Pol offener Leserahmen; Polh - Polyeder-Promotor; MMLV-RT ORF - MMLV-RT offener Leserahmen; TEV - Ätzvirus-Protease-Zielstelle; 8x His - His-Tag mit acht Histidinen; Streptokokken - Streptokokken-Tag; polyA - SV40 spätes Polyadenylierungssignal. (B) SDS-PAGE-Analyse von His-Taq Pol, exprimiert in BL21(DE3) E. coli-Zellen und Taq-Polymerase. (C) SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem C-His/Streptokokken-MMLV-RT, exprimiert in den Sf9-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der beiden optimierten, standardisierten und entwickelten gemultiplexten einstufigen RT-qPCR-Kits zusammen mit den Reaktionskomponenten. Jede einzelne Multiplex-Reaktion besteht aus dNTPs, einer Puffermischung, einer Enzymmischung, einer gemultiplexten Primermischung und der zu testenden synthetischen RNA-Vorlage. (A) Influenza A/B, SARS-CoV-2-Kit und (B) MERS ORF1a/upE, SARS-CoV-2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Die Amplifikationskurven und die Nachweisgrenze für Influenza A/B und SARS-CoV2 Multiplex-einstufiges RT-qPCR-Kit. Die Amplifikationskurven der gemultiplexten RT-qPCR wurden unter Verwendung einer synthetischen RNA-Mischung mit 10-facher serieller Verdünnung (10 bis 105 Kopien/μL) mit allen Zielen (A) Influenza A, (C) Influenza B und (E) SARS-CoV-2 durchgeführt. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, wobei ein Replikat als Beispiel gezeigt wurde. Die Nachweisgrenze für (B) Influenza A, (D) Influenza B und (F) SARS-CoV-2 wurde bestimmt, indem der Mittelwert von drei repliziertenCt-Werten gegen die logarithmische Kopienzahl aufgetragen wurde. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die Gleichung der linearen Regressionskurve wurden berechnet und in jedem Panel dargestellt. Die Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung zwischen drei Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die Amplifikationskurven und die Nachweisgrenze für MERS ORF1a/upE und SARS-CoV2 Multiplex-einstufiges RT-qPCR-Kit. Die Amplifikationskurven der gemultiplexten RT-qPCR wurden unter Verwendung einer synthetischen RNA-Mischung mit 10-fachen seriellen Verdünnungen (10 bis 105 Kopien/μL) mit allen Zielen (A) MERS ORF1a, (C) MERS upE und (E) SARS-Cov-2 durchgeführt. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, wobei ein Replikat als Beispiel gezeigt wurde. Die Nachweisgrenze für (B) MERS ORF1a, (D) MERS upE und (F) SARS-CoV-2 wurde bestimmt, indem der Mittelwert von drei replizierten Ct-Werten gegen die logarithmische Kopienzahl aufgetragen wurde. Das Bestimmtheitsmaß (R2) und die Gleichung der linearen Regressionskurve wurden berechnet und in jedem Panel dargestellt. Die Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung zwischen drei Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Die Liste der Komponenten für den Taq-Polymerase-Lysepuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Taq-Polymerase-Reinigungspuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Zwei-Säulen-Aufreinigung der Taq-DNA-Polymerase benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Taq-Polymerase-Speicherpuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Dialyse der Taq-DNA-Polymerase nach der Reinigung erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Die Liste der Komponenten für den MMLV-RT-Lysepuffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: MMLV-RT-Aufreinigungspuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Zwei-Säulen-Aufreinigung von MMLV-RT benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: MMLV-RT-Speicherpuffer. Die Liste der Pufferkomponenten, die für die Dialyse von MMLV-RT nach der Reinigung erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: Informationen zu Primern und Sonden. Die Sequenzinformationen der Primer und Sonden, die für jede gemultiplexte Primermischung benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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