Summary
In diesem Protokoll werden Methoden beschrieben, die für die BAT-optimierte arteriovenöse Metabolomik mittels GC-MS in einem Mausmodell relevant sind. Diese Methoden ermöglichen es, wertvolle Einblicke in den BAT-vermittelten Metabolitenaustausch auf organismischer Ebene zu gewinnen.
Abstract
Braunes Fettgewebe (BAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der metabolischen Homöostase durch einen einzigartigen Energieverbrauchsprozess, der als nicht-zitternde Thermogenese bekannt ist. Um dies zu erreichen, verwendet BAT ein vielfältiges Menü an zirkulierenden Nährstoffen, um seinen hohen Stoffwechselbedarf zu decken. Darüber hinaus sezerniert BAT aus Metaboliten gewonnene bioaktive Faktoren, die entweder als Stoffwechselbrennstoffe oder Signalmoleküle dienen können, was die BAT-vermittelte Kommunikation innerhalb von Geweben und/oder zwischen Geweben erleichtert. Dies deutet darauf hin, dass BAT aktiv am systemischen Metabolitenaustausch beteiligt ist, ein interessantes Merkmal, das allmählich erforscht wird. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vivo optimierte arteriovenöse Metabolomik auf Mausebene vor. Das Protokoll konzentriert sich auf relevante Methoden zur thermogenen Stimulation und eine arteriovenöse Blutentnahmetechnik unter Verwendung der Sulzer-Vene, die selektiv interskapuläres BAT-abgeleitetes venöses Blut und systemisches arterielles Blut ableitet. Als nächstes wird ein auf Gaschromatographie basierendes Metabolomik-Protokoll unter Verwendung dieser Blutproben demonstriert. Der Einsatz dieser Technik sollte das Verständnis des BVT-regulierten Metabolitenaustauschs auf der Ebene der Organe erweitern, indem die Nettoaufnahme und -freisetzung von Metaboliten durch BVT gemessen wird.
Introduction
Braunes Fettgewebe (BAT) besitzt eine einzigartige Eigenschaft des Energieverbrauchs, die als nicht-zitternde Thermogenese (NST) bekannt ist und sowohl mitochondriale Entkopplungsprotein 1 (UCP1)-abhängige als auch UCP1-unabhängige Mechanismen 1,2,3,4,5 umfasst. Diese charakteristischen Merkmale deuten darauf hin, dass BAT an der Regulation des systemischen Stoffwechsels und der Pathogenese von Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Adipositas, Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebskachexie, beteiligt ist 6,7,8. Neuere retrospektive Studien haben einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der BAT-Masse und/oder ihrer Stoffwechselaktivität mit Fettleibigkeit, Hyperglykämie und kardiometabolischer Gesundheit beim Menschen gezeigt 9,10,11.
In jüngster Zeit wurde BAT als metabolische Senke vorgeschlagen, die für die Aufrechterhaltung der NST verantwortlich ist, da sie erhebliche Mengen an zirkulierenden Nährstoffen als thermogenen Brennstoff benötigt 6,7. Darüber hinaus kann BAT bioaktive Faktoren erzeugen und freisetzen, die als braune Adipokine oder BATokine bezeichnet werden und als endokrine und/oder parakrine Signale wirken, was auf seine aktive Beteiligung an der metabolischen Homöostase auf Systemebene hinweist 12,13,14,15. Daher sollte das Verständnis des Nährstoffstoffwechsels von BAT unser Verständnis seiner pathophysiologischen Bedeutung beim Menschen verbessern, die über seine herkömmliche Rolle als thermoregulatorisches Organ hinausgeht.
Metabolomische Studien mit stabilen Isotopen-Tracern in Kombination mit klassischen Nährstoffaufnahmestudien mit nicht metabolisierbaren Radiotracern haben unser Verständnis darüber, welche Nährstoffe bevorzugt von BAT aufgenommen werden und wie sie verwertet werden, erheblich verbessert 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. So haben beispielsweise Studien zu radioaktiven Tracern gezeigt, dass kaltaktivierte BAT Glukose, Lipoprotein-gebundene Fettsäuren und verzweigtkettige Aminosäuren 16,17,18,19,20,21,22,23,27 aufnimmt. Die jüngste Isotopenverfolgung in Kombination mit metabolomischen Studien hat es uns ermöglicht, das metabolische Schicksal und den Fluss dieser Nährstoffe in Geweben und kultivierten Zellen zu messen 24,25,26,28,29,30. Diese Analysen konzentrieren sich jedoch in erster Linie auf die individuelle Verwertung von Nährstoffen, so dass wir nur begrenzte Kenntnisse über die Rolle von BAT auf Systemebene beim Austausch von Organmetaboliten haben. Fragen zu den spezifischen Reihen zirkulierender Nährstoffe, die von BAT verbraucht werden, und zu ihren quantitativen Beiträgen in Bezug auf Kohlenstoff und Stickstoff sind nach wie vor schwer fassbar. Darüber hinaus steht die Untersuchung, ob BAT aus Metaboliten gewonnene BATokine (z. B. Lipokine) unter Verwendung von Nährstoffen erzeugen und freisetzen kann, erst am Anfang 12,13,14,15,31,32.
Die arteriovenöse Blutanalyse ist ein klassischer physiologischer Ansatz, um die spezifische Aufnahme oder Freisetzung von zirkulierenden Molekülen in Organen/Geweben zu beurteilen. Diese Technik wurde zuvor auf die interskapuläre BAT von Ratten angewendet, um Sauerstoff und verschiedene Metaboliten zu messen, wodurch BAT als Hauptort der adaptiven Thermogenese mit seinem katabolen Potenzial etabliertwurde 33,34,35,36,37. Kürzlich wurde eine arteriovenöse Studie mit interscapularer BAT der Ratte mit einem Trans-Omics-Ansatz gekoppelt, was zur Identifizierung unentdeckter BATokine führte, die durch thermogen stimuliertes BAT38 freigesetzt wurden.
Jüngste Fortschritte in der hochempfindlichen Gaschromatographie- und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS und LC-MS)-basierten Metabolomik haben das Interesse an arteriovenösen Studien zur quantitativen Analyse des organspezifischen Metabolitenaustauschs neu entfacht 39,40,41. Diese Techniken mit ihrem hohen Auflösungsvermögen und ihrer Massengenauigkeit ermöglichen die umfassende Analyse eines breiten Spektrums von Metaboliten mit kleinen Probenmengen.
In Übereinstimmung mit diesen Fortschritten wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie die arteriovenöse Metabolomik erfolgreich für die Untersuchung von BAT auf Mausebene angepasst, wodurch die quantitative Analyse der Metabolitenaustauschaktivitäten bei BAT unter verschiedenen Bedingungen ermöglichtwurde 42. In diesem Artikel wird ein BAT-gerichtetes arteriovenöses Metabolomik-Protokoll unter Verwendung von GC-MS in einem C57BL/6J-Mausmodell vorgestellt.
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Protocol
Alle Versuche wurden mit Genehmigung des Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer von der IACUC zugelassenen Tierhaltung untergebracht, die sich in einem Reinraum bei 22 °C und 45 % Luftfeuchtigkeit nach einem täglichen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus befand. Sie wurden in belüfteten Racks gehalten und hatten Zugang zu einer Standard-Chow-Diät ad libitum (bestehend aus 60 % Kohlenhydraten, 16 % Protein und 3 % Fett). Einstreu und Nistmaterial wurden wöchentlich gewechselt. Für diese Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 12 Wochen und einem Gewicht zwischen 25 g und 30 g verwendet. Diese Tiere wurden von einem kommerziellen Lieferanten bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Modulation der Stoffwechselaktivität des braunen Fettgewebes durch Temperaturakklimatisierung und pharmakologische Stimulation
ANMERKUNG: Die Temperaturakklimatisierung über mehrere Tage bis Wochen oder die pharmakologische Stimulation mit β-adrenergen Rezeptoragonisten sind häufig eingesetzte Methoden zur Modulation der BAT-Aktivität1. Daher wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die Methode gegeben, damit die Leser je nach Bedarf den geeigneten Ansatz wählen können. Um metabolisch inaktive (weniger thermogene) BAT zu erhalten, wird für C57BL/6J-Mäuse eine warme Basistemperatur gewählt, die als Thermoneutralität (28-30 °C) bezeichnet wird. Dieser Bereich stellt sicher, dass die Mäuse keine zusätzliche Energie aufwenden müssen, um eine konstante Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Um metabolisch mäßig oder hochaktiv (thermogen) BVT zu erhalten, können milde Kälte (20-22 °C) bzw. starke Kälte (6 °C) gewählt werden. Für die Zwecke dieses Experiments wurden Mäuse unter Standard-Haltungsbedingungen bei 22 °C aufgezogen, die zwar für Mäuse leicht kalt waren, aber keine pharmakologischen Stimulationen beinhalteten.
- Temperaturakklimatisierung
- Trennen Sie die Mäuse mindestens 1 Woche vor Beginn der Temperaturakklimatisierung, um 1 oder 2 Mäuse pro Käfig unterzubringen. Bereiten Sie Nagetier-Inkubatoren, die mit Belüftung, Temperatur- und Feuchtigkeitsregelung ausgestattet sind, mit den gewünschten Bedingungen vor.
- Bringen Sie die Käfige an den für die gewählte Art der Temperaturakklimatisierung geeigneten Tagen in ihre jeweiligen Nagetier-Inkubatoren.
- Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Mäuse gleichmäßig auf alle Gruppen verteilt ist, mit entweder 1 oder 2 Mäusen pro Käfig. Ein einzelnes Gehäuse wird bevorzugt, da es im Vergleich zu Gruppengehäusen43 empfindlicher auf temperaturinduzierte physiologische Veränderungen reagiert. Hier sind die spezifischen Unterbringungsbedingungen für jede Gruppe:
- Thermoneutralitätsgruppe (30 °C): Halten Sie die Mäuse dieser Gruppe bis zu vier Wochen lang kontinuierlich bei einer Temperatur von 30 °C.
- Starke Kältegruppe: In dieser Gruppe werden die Mäuse zunächst bei 18 °C ohne Nistmaterial untergebracht. Sie werden einen allmählichen wöchentlichen Temperaturrückgang erleben, der in der vierten Woche 6 °C erreicht. Der Temperaturverlauf ist wie folgt: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
- Mild kalte Gruppe (20-22 °C): Die Mäuse dieser Gruppe werden in Nagetier-Inkubatoren unter den gleichen Bedingungen wie die zuvor erwähnten Standard-Haltungsbedingungen untergebracht.
- Akute Kälteprobleme: Bei akuten Kälteproblemen setzen Sie 1-2 Mäuse pro Käfig ohne Nistmaterial aus und setzen Sie sie bis zu 8 Stunden lang einem Nagetier-Inkubator aus, der auf 6 °C eingestellt ist.
ANMERKUNG: Diese Gehäusebedingungen und Temperaturschwankungen sind für die Untersuchung der Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturumgebungen auf die BAT-Aktivität und den Stoffwechsel von wesentlicher Bedeutung.
- Wechseln Sie die Käfige und füllen Sie jede Woche Futter und Wasser auf. Akklimatisieren Sie die Käfige mindestens 24 Stunden vor der Supplementierung bei ihrer jeweiligen Temperatur (Nagetier-Inkubator).
HINWEIS: Um die Störung des entsprechenden Temperaturreizes zu verhindern, ist es wichtig, keine Mäuseanreicherungen bereitzustellen, die zum Nestbau führen könnten. Als Reaktion auf starke Kälte verbrauchen Mäuse mehr Energie, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, was zu einer erhöhten Nahrungsaufnahme und höheren Ausscheidungsraten führt. Daher ist es wichtig, die Käfige mindestens zwei- bis dreimal pro Woche zu kontrollieren (gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien), um sicherzustellen, dass die Mäuse ausreichend mit Futter und Wasser versorgt werden und dass die Käfige nicht übermäßig nass sind. Diese Überwachung ist unerlässlich, um das Wohlbefinden und die Gesundheit der Mäuse während der Studie zu erhalten.
- Pharmakologische Stimulation1 mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten CL316,243
- Um die stimulierende Wirkung zu maximieren, sollten die Mäuse vor der Injektion 2-4 Wochen lang bei Thermoneutralität (30 °C) vorgehalten werden.
- Nach der Akklimatisierungsphase 1 mg/kg CL316.243 intraperitoneal injizieren.
HINWEIS: Bei chronischer Stimulation mit dem β3-adrenergen Rezeptoragonisten (z. B. von 3 Tagen bis zur 1,44,45. Woche) sind aufgrund der Arzneimittelstabilität tägliche Injektionen erforderlich. Verdünntes CL316.243 sollte aus Stabilitätsgründen am Tag der Injektion zubereitet werden.
2. Arteriovenöse Blutentnahme
HINWEIS: Mäuse über 12-14 Wochen werden am besten für die arteriovenöse Blutentnahme empfohlen. Jüngere Mäuse haben möglicherweise keine ausreichend dimensionierten Sulzer-Venen, ein ausgeprägtes Blutgefäß, das spezifisch venöses Blut aus dem interscapularen BAT46 ableitet.
- Betäuben Sie sanft mit dem kalibrierten Verdampfer mit 3 % Isofluran für die Induktion (in einer 205 x 265 x 200 mm großen Kammer) und 2 % Isofluran für die Aufrechterhaltung (mit einer Gasanästhesiemaske).
HINWEIS: Die gesamte arteriovenöse Blutentnahme sollte sofort nach der Anästhesie durchgeführt werden. Ein wasserbeheiztes Wärmekissen kann während der Anästhesie verwendet werden, um die Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten.
VORSICHT: Isofluran ist leicht flüchtig und giftig, wenn es eingeatmet wird. Daher muss die Primäranästhesie unter einem Abzug durchgeführt werden. - Überprüfen Sie die Reflexe des Tieres, wie z. B. das Zurückziehen der Pfote, um sicherzustellen, dass die Betäubung eine angemessene Tiefe erreicht hat.
- Entnahme von venösem Blut aus der Sulzer-Vene
- Positionieren Sie die Maus so, dass sie die Rückenhaut freilegt, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkniff direkt vor dem Einschnitt. Befeuchten Sie die Rückenhaut mit reichlich 70%igem Ethanol, um eine Haarablösung zu verhindern, und machen Sie einen Schnitt entlang des Rückens vom unteren Teil des Brustkorbs bis zum Hals.
HINWEIS: Der interskapuläre BAT befindet sich direkt unter der Haut und besteht aus zwei Fettpolstern, die von dünnem weißem Fettgewebe bedeckt sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Maus durch die Gasanästhesiemaske unter Narkose bleibt. - Heben Sie den Interscapular BAT vorsichtig mit einer gebogenen Spitze an und schneiden Sie vorsichtig das anhaftende Gewebe, von dem die meisten Muskeln sind. Heben Sie das Fettpolster in Richtung Kopf an, fahren Sie fort, das anhaftende Gewebe zu schneiden und die Region vorsichtig zu öffnen, bis die Sulzer-Vene (ein großes Y-förmiges dunkelrotes Gefäß, das mit beiden Fettpolstern des interskapulären BAT verbunden ist) freiliegt.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die Kapillargefäße des Muskelgewebes, die mit dem vorderen und seitlichen Bereich des interskapulären BAT verbunden sind, nicht zu durchtrennen, da dies die Menge und Qualität des Blutabflusses aus der Sulzer-Vene erheblich reduziert. - Durchtrennen Sie vorsichtig die Sulzer-Vene und entnehmen Sie ca. 40 μl Blut mit 200-μl-Pipettenspitzen und einer P100-Pipette. Bewahren Sie das Blut in einem Blutentnahmeröhrchen auf und halten Sie das Röhrchen bis zur Serumentnahme auf Eis.
HINWEIS: Es ist wichtig, Blut knapp unterhalb des Y-förmigen Teilungspunkts der Sulzer-Vene zu entnehmen, um eine Kontamination des Blutes aus der oberen Hohlvene47 zu verhindern. Wenn zu viel Blut entnommen wird, werden die Eigenschaften der Sulzer-Vene beeinträchtigt. Stellen Sie daher sicher, dass Sie die minimale Menge Blut aus der Sulzer-Vene entnehmen, die für die Analyse benötigt wird. Seien Sie vorsichtig bei der Auswahl von Blutentnahmeröhrchen, da Serum und Plasma unterschiedliche Metabolitenprofile ergeben 48,49,50. Für die Plasmagewinnung ist es notwendig, heparinbeschichtete Röhrchen zu verwenden. In diesem Experiment wurden mit Gerinnungsaktivatoren beschichtete Röhrchen ausgewählt, um Serum zu erhalten. Auf keinen Fall sollten EDTA-beschichtete Röhrchen verwendet werden, da EDTA die massenspektrometrischen Signale erheblich beeinflusst51,52.
- Positionieren Sie die Maus so, dass sie die Rückenhaut freilegt, und bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Zehenkniff direkt vor dem Einschnitt. Befeuchten Sie die Rückenhaut mit reichlich 70%igem Ethanol, um eine Haarablösung zu verhindern, und machen Sie einen Schnitt entlang des Rückens vom unteren Teil des Brustkorbs bis zum Hals.
- Entnahme von arteriellem Blut aus der linken Herzkammer
- Drehen Sie die Maus um, ohne den Kontakt zum Nasenkonus zu verlieren, um die ventrale Haut freizulegen. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch ein Einklemmen der Zehen, bevor Sie den Schnitt vornehmen. Befeuchten Sie die ventrale Haut mit reichlich 70%igem Ethanol, um eine Haarablösung zu verhindern, und öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig mit einer Schere, um das Herz freizulegen, ohne die innere Struktur zu beschädigen.
- Punktieren Sie den Scheitelpunkt der linken Herzkammer genau mit einer 1-ml-Spritze mit einer 29 G (1/2") Nadel. Führen Sie zwei Drittel einer 1/2-Zoll-Nadel 3-5 mm rechts horizontal von der Herzspitze ein (Abbildung 1B) und ziehen Sie die Spritze zurück, um Blut aus der linken Herzkammer zu entnehmen (50-100 μl). Das Blut aus der linken Herzkammer ist sauerstoffreiches arterielles Blut, das hellrot ist. Bewahren Sie das Blut in einem Blutentnahmeröhrchen auf und halten Sie das Röhrchen bis zur Serumentnahme auf Eis.
HINWEIS: Für den Zugang zum Herzen sollte ein minimaler Schnitt in der Brusthöhle gemacht werden. Ein übermäßiger Schnitt kann zu lokalen Blutungen führen, die in der Folge zu niedrigem Blutdruck führen können. Dies könnte die Qualität des arteriellen Blutes, das aus der linken Herzkammer entnommen wird, beeinträchtigen. Vermeiden Sie es, das Herz zu drehen oder umzudrehen, da es dadurch schwierig wird, die genaue Position der linken Herzkammer zu bestimmen. - Euthanasie durchführen und mit einer geeigneten Methode nach den Richtlinien der lokalen Institutionen sicherstellen. Zum Beispiel kann die Euthanasie durch eine Luxation des Gebärmutterhalses durchgeführt und durch das Aufhören des Herzschlags bestätigt werden.
- Blutproben werden bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Der Überstand sollte je nach Art des verwendeten Blutentnahmeröhrchens entweder Serum oder Plasma enthalten. Man kann hier aufhören und die Proben bei -20 °C bis zur Serumverarbeitung für die GC-MS-Analyse lagern.
HINWEIS: Eine Hämolyse kann möglicherweise aufgetreten sein, wenn ein rot gefärbter Überstand beobachtet wird. Um eine Hämolyse zu vermeiden, wird die Probe vorgewirbelt, bevor die Gerinnung abgeschlossen ist. Einige mit roten Blutkörperchen angereicherte Metaboliten, einschließlich Glutamin und Laktat, könnten zu einer Fehlinterpretation der Daten führen, obwohl die meisten Metaboliten möglicherweise nicht signifikant von der Hämolyse betroffen sind. Es wird empfohlen, das Serum/Plasma innerhalb einer Woche zu analysieren.
3. Metabolitenextraktion aus Serum und chemische Derivatisierung
- Vorbereitung für die Extraktion
ANMERKUNG: Alle Methoden, einschließlich Metabolitenextraktion, Derivatisierung und Datenanalyse, sind leicht modifizierte Versionen der zuvor beschriebenen Methoden53,54.- Bereiten Sie den Extraktionspuffer vor, indem Sie 100 μM Lösung von DL-Norvalin, interner Standard (siehe Materialtabelle), zu Methanol in MS-Qualität geben.
- Stellen Sie sicher, dass alle experimentellen Verfahren auf Eis durchgeführt werden.
- 10 μl Mäuseserum, das entweder aus der Sulzer-Vene oder dem linken Ventrikel extrahiert wurde, werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 40 μl Extraktionspuffer überführt.
- Um Zelltrümmer und Proteine zu entfernen, werden die Serumproben kurz vortext, gefolgt von der Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (18.000 x g) für 30 min bei 4 °C.
- Nach der Zentrifugation werden 40 μl Überstand vorsichtig in ein Glasfläschchen überführt, gefolgt von einer 3-stündigen Trocknung in einer Vakuumzentrifuge bei 4 °C.
HINWEIS: Anstelle von Kunststoffröhrchen wird ein Glaseinsatz (siehe Materialtabelle) empfohlen, da während des nachfolgenden Derivatisierungsschritts kunststoffreaktive Chemikalien verwendet werden. - Die getrockneten Proben werden zwei aufeinanderfolgenden Derivatisierungsschritten für die GC-MS-Analyse der Serummetaboliten unterzogen.
HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten aufgrund der Reizgefahr der Lösungsmittel unter einem Abzug durchgeführt werden.- Resuspendieren Sie die getrockneten Serumextrakte in 30 μl 10 mg/ml Methoxyaminhydrochlorid (siehe Materialtabelle), das in Pyridin gelöst ist, und inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 Minuten.
- Derivatisieren Sie Proben für die Silylierung von Metaboliten mit 70 μl N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA, siehe Materialtabelle) bei 70 °C für 1 h.
HINWEIS: Aufgrund der Derivatisierungslösungsmittel, die mit Kunststoff reagieren, wird in den folgenden Schritten die Verwendung einer Glasspritze anstelle einer Kunststoffspitze empfohlen.
4. Metabolomics-Analyse mittels GC-MS
HINWEIS: Eine einzelne vierfache GC-MS (siehe Materialtabelle) wurde verwendet, um die verschiedenen Serummetaboliten, einschließlich Kohlenhydrate, Aminosäuren und TCA-Zyklus-Zwischenprodukte, in derivatisierten Proben aus der Sulzer-Vene und dem linken Ventrikel zu messen. Alternativ können auch andere Säulen verwendet werden, wobei die experimentellen Einstellungen einschließlich des Temperaturprogramms je nach verwendetem Säulentyp variieren können.
- Injizieren Sie 1 μl der derivatisierten Probe im splitless-Modus bei 280 °C (Eintrittstemperatur) unter Verwendung von Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1.500 ml/min (Sollwert) in den GC.
- Stellen Sie den Quadrupol auf 200 °C und die GC-MS-Schnittstelle auf 300 °C ein.
HINWEIS: Das Ofenprogramm für alle Metabolitenanalysen beginnt bei 60 °C, wird 1 Minute lang gehalten und dann mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min erhöht, bis die Temperatur 320 °C erreicht. - Erfassen Sie Daten durch Elektronenionisation (EI) bei 70 eV und erfassen Sie die Probendaten im Scanmodus (50-550 m/z)53. Alle in dieser Studie verwendeten Metaboliten wurden zuvor mit Standards zur Bestätigung von Massenspektren und Retentionszeiten validiert.
- Führen Sie die Peakflächenintegration mit einer handelsüblichen Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).
- Ordnen Sie die Verbindungen der Produktion jedes TBMDS-Derivats zu. Dann erhalten Sie das Extraktions-Ionenchromatogramm (EIC), indem Sie den m/z-Wert des Fragmentions in den entsprechenden Peakbereich integrieren, und exportieren Sie es dann. Die Fragmentionen sind in Tabelle 1 dargestellt.
HINWEIS: Die EIC jeder Verbindung wurde durch die von DL-Norvalin in jeder Probe normalisiert. Die Daten werden durch die Log-2-Sulzer-Vene zum linken Ventrikel (Log2(SV/LV)) unter Verwendung jedes normierten EIC-Wertes dargestellt.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt das experimentelle Schema der BAT-optimierten AV-Metabolomik. Wie im Abschnitt "Protokoll" erwähnt, werden Mäuse zur Gewinnung von differentiell stimuliertem braunem Fettgewebe einer Temperaturakklimatisierung mit Nagetier-Inkubatoren unterzogen oder erhalten eine pharmakologische Verabreichung wie β-adrenerge Rezeptoragonisten. Anschließend werden die Mäuse betäubt und Blutproben für die metabolomische Analyse entnommen (Abbildung 1A). Für die Blutentnahme wird das venöse Blut, das spezifisch aus dem interskapulären BAT abfließt, über die Sulzer-Vene entnommen, während das arterielle Blut direkt aus der linken Herzkammer entnommen wird (Abbildung 1B).
Abbildung 2 zeigt die schematische Darstellung der Serummetabolomik mittels GC-MS (Abbildung 2). Kurz gesagt, die Methanollösung wird zu Serumproben gegeben, gefolgt von einer Zentrifugation, um Serumproteine zu entfernen. Der Überstand, der die Metaboliten enthielt, wurde in einem SpeedVac getrocknet und die getrockneten Proben wurden einer zweistufigen Derivatisierung mit Methoxyamin (MOX) und MTBSTFA (N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid) unterzogen. Der Derivatisierungsschritt zielt auf die Substitution polarer funktioneller Gruppen der Metaboliten durch TBDMS-Ester ab, was eine GC-MS-Detektion von Metaboliten als TBDMS-Derivate ermöglicht. Die derivatisierten Proben wurden mittels einzelner vierfacher GC-MS analysiert. Die Metaboliten werden in der Säule nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften getrennt. Die Elektronenionisation (EI) wird eingesetzt, um die Metaboliten in einzigartige Fragmentionen zu zerlegen, die von einem Massendetektor detektiert werden. Die Identifizierung von Verbindungen erfolgt durch den Nachweis von verbindungsspezifischen Fragmentionen. Der m/z-Wert und die Retentionszeit der verbindungsspezifischen Fragmentionen im Experiment sind in der Tabelle (Tabelle 1) dargestellt. Ein extrahiertes Ionenchromatogramm (EIC) wird verwendet, um das Signal eines verbindungsspezifischen Fragmentions in den Peakbereich des Metaboliten zu integrieren, der die Häufigkeit der Metaboliten definiert.
Um festzustellen, ob BAT eine Reihe von Metaboliten freisetzt oder aufnimmt, könnenLog-2-Verhältnisse der Ionenzählung zwischen der Sulzer-Vene und dem linken Ventrikel (Log2(SV/LV)) berechnet werden (Abbildung 3). Wenn der Log2(SV/LV)-Wert für einen bestimmten Metaboliten >0 beträgt, deutet dies darauf hin, dass der Metabolit im SV häufiger vorkommt als im LV, was darauf hindeutet, dass das interscapulare BAT-Netz den Metaboliten freisetzt. Umgekehrt, wenn der Log2(SV/LV)-Wert für einen bestimmten Metaboliten <0 beträgt, deutet dies darauf hin, dass der Metabolit von der interscapularen BAT aufgenommen wird.
Mit diesem Ansatz wurde festgestellt, dass milde kältestimulierte BAT signifikant Glukose, Laktat, 3-Hydroxybutyrat (3-HB), BCAAs, Aspartat, Lysin und Tryptophan verbraucht, während BAT signifikant Succinat und Palmitat freisetzt (Abbildung 3A). Die meisten dieser Phänomene wurden in unseren früheren Studien zu chronischer Kälte BAT42 beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine milde Kälte BAT metabolisch der chronischen Kälte BAT ähnelt, wenn auch in geringerem Maße. Um einen schnellen visuellen Überblick über die Daten zu geben, wird eine Heatmap dargestellt, die die Werte von Log2 (SV/LV) anzeigt (Abbildung 3B). Es ist wichtig, die Daten mit Vorsicht zu interpretieren, da die Heatmap Z-Werte innerhalb der Gruppe darstellt.
Abbildung 1: Experimentelles Schema der BAT-optimierten arteriovenösen (AV) Metabolomik. (A) Diagramm des Arbeitsablaufs der AV-Metabolomik. (1) Um verschiedene Versionen von metabolisch stimuliertem braunem Fettgewebe (BAT) zu induzieren, werden Mäuse an unterschiedliche Temperaturen gewöhnt oder erhalten pharmakologische Arzneimittelinjektionen. (2) Anschließend werden die arteriellen und venösen Blutproben aus der linken Herzkammer bzw. der Sulzer-Vene der Mäuse entnommen. (3) Die gewonnenen Serumproben werden einer Metabolitenextraktion unterzogen, gefolgt von einer metabolomischen Analyse. (B) Repräsentative Bilder, die als Leitfaden für Blutentnahmeverfahren dienen. Das arterielle Blut wird aus der linken Herzkammer entnommen, während das venöse Blut aus der Sulzer-Vene gewonnen wird, da es speziell das Blut aus BAT ableitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: GC/MS-basierte gezielte Metabolomik. Experimentelles Schema der GC/MS-basierten gezielten Metabolomik. TBDMS: tert-Butyldimethylsilyl, EI: Elektronenionisation, EIC: Extraktions-Ionenchromatogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative AV-Metabolomik-Daten. (A) Aufnahme und anschließende Freisetzung ausgewählter prävalenter und hochaktiver zirkulierender Kraftstoffmetaboliten durch BVT, klassifiziert nach ihren jeweiligen Gruppen. Die Daten zeigen das Verhältnis von Venen zu linken Ventrikel (SV/LV) von Sulzer nach Log2 . Balken, die Metaboliten mit dem Mittelwert von Log2 (SV/LV) <0 anzeigen, sind rot und Log2 (SV/LV) >0 blau eingefärbt. Einzelne Datenpunkte stellen jede Maus dar. n = 11. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; verzweigtkettige Aminosäure; EAA; essentielle Aminosäure; NEAA; nicht-essentielle Aminosäure. (B) Eine Heatmap, die die unterschiedliche Häufigkeit von Metaboliten zwischen Sulzer-Vene (SV) und linkem Ventrikelblut (LV) veranschaulicht. Jede Spalte zeigt einen Z-Score der Durchschnittswerte innerhalb der Gruppe. n = 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Verbindung | m/z der Fragmentionen | Verweildauer | Formular | TBDMS-Ableitungsformel |
| Pyruvat | 174.1 | 8.72 | C3H4O3-KARTON | C15H33O3NSi2 |
| Aspartat | 418.2 | 18.45 | C4H7NO4 | C22H49NO4Si3-KARTON |
| α-Ketoglutarat | 346.2 | 17.27 | C5H6O5-KARTON | C18H37NO5Si2-KARTON |
| C16:0 (Palmitat) | 313.3 | 19.72 | C16H32O2 | C22H46O2Si |
| Lactat | 261.2 | 11.66 | C3H6O3-KARTON | C15H34O3Si2 |
| Leucin | 200.2 | 14 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2-KARTON |
| Isoleucin | 200.2 | 14.34 | C6H13NO2 | C18H41NO2Si2-KARTON |
| Valin | 186.2 | 13.53 | C5H11NO2 | C17H39NO2Si2-KARTON |
| Alanin | 260.2 | 12.17 | C3H7NO2 | C15H35NO2Si2-KARTON |
| Serin | 390.2 | 17.04 | C3H7NO3 | C21H49NO3Si3-KARTON |
| Glycin | 218.1 | 12.43 | C2H5NO2 | C14H33NO2Si2-KARTON |
| Lysin | 300.2 | 20.48 | C6H14N2O2 | C24H56N2O2Si3-KARTON |
| Succinat | 289.1 | 14.65 | C4H6O4-KARTON | C16H34O4Si2 |
| Prolin | 258.2 | 14.73 | C5H9NO2 | C17H37NO2Si2-KARTON |
| Phenylalanin | 336.2 | 18 | C9H11NO2 | C21H39NO2Si2-KARTON |
| Methionin | 320.2 | 16.84 | C5H11NO2S | C17H39NO2SSi2-KARTON |
| Cystein | 406.2 | 19 | C3H7NO2S | C21H49NO2SSi3-KARTON |
| Asparagin | 417.2 | 19.86 | C4H8N2O3 | C22H50N2O3Si3-KARTON |
| 3-Hydroxybutyrat (3HB) | 275.2 | 12.81 | C4H8O3-KARTON | C16H36O3Si2 |
| Tryptophan | 375.2 | 22.97 | C11H12N2O2 | C23H40N2O2Si2-KARTON |
| Malat | 419.2 | 18.19 | C4H6O5-KARTON | C22H48O5Si3 |
| Glutamat | 432.3 | 19.59 | C5H9NO4 | C23H51NO4Si3-KARTON |
| Glutamin | 431.3 | 20.85 | C5H10N2O3 | C23H52N2O3Si3 |
| Citrat | 459.2 | 22.38 | C6H8O7-KARTON | C30H64O7Si4 |
| Traubenzucker | 476.3 | 22.7 | C6H12O6 | C30H68O6Si4 |
Tabelle 1: GC/MS-Verbindungsfragmentionen, die für die Integration verwendet werden. Diese Tabelle enthält eine Liste von 25 Serummetaboliten, die in der vorliegenden Methode identifiziert wurden, wobei die Retentionszeit und die Fragmentionen jeder Verbindung entsprechen.
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Discussion
Ein entscheidender Schritt zum Verständnis des metabolischen Potenzials von BAT im Energiehaushalt des gesamten Körpers besteht darin, zu definieren, welche Nährstoffe es verbraucht, wie sie metabolisch verarbeitet werden und welche Metaboliten in den Kreislauf freigesetzt werden. Dieses Protokoll führt eine spezielle arteriovenöse Probenahmetechnik ein, die den Zugang zum venösen Gefäßsystem von interscapularer BAT und systemischen arteriellen Gefäßen bei C57BL/6J-Mäusen ermöglicht, die kürzlich von Park et al. entwickelt und validiert wurde42. Im Folgenden finden Sie die wichtigsten Punkte, die Sie bei der Befolgung des Protokolls kritisch berücksichtigen sollten.
Bei der thermogenen Stimulation ist es wichtig, die am besten geeignete Art der thermogenen Stimulation für Ihre Versuchsumgebung zu wählen. Wenn Sie beispielsweise eine Versuchsgruppe (vs. Kontrolle) verwenden und darauf abzielen, Unterschiede in der metabolischen Anpassungsfähigkeit (entscheidend für das maximale nicht-zitternde thermogene Potenzial) von BAT zu beobachten, ist eine chronische Kälteakklimatisierung oder eine β-adrenerge Rezeptorstimulation (länger als 3 Tage bis 4 Wochen) geeignet 1,45. Wenn BAT akuter Kälteexposition ausgesetzt ist (einige Stunden weniger als 24 Stunden), verstoffwechselt BAT seine intrinsisch gespeicherten Brennstoffe und kommuniziert metabolisch mit zitternden Muskeln, um eine optimale Thermogenese zu erreichen1. Ein β-adrenerger Rezeptoragonist stellt eine neuronale Reaktion dar, um die BAT-Thermogenese auszulösen 1,14, und es gibt andere endokrine Faktoren, die das thermogene Programm verstärken 55,56,57,58,59,60. Bei der Durchführung einer thermogenen Stimulation wie oben erwähnt sollte eine Ausgangskontrolle bei Thermoneutralität (30 °C) nützlich sein, um zu bestätigen, ob die Stimulation angemessen funktioniert hat.
Wie im Abschnitt über das Protokoll erwähnt, ist die Gewinnung von arteriovenösem Blut von höchster Qualität der Schlüssel zur erfolgreichen Durchführung des Experiments. Um dies zu erreichen, ist es wichtig, eine Hämolyse zu verhindern (siehe Schritt 2.5) und eine gleichbleibende Menge Blut zu entnehmen, um eine Verdünnung der unterschiedlichen Eigenschaften des venösen Blutes aus der Sulzer-Vene (weniger als 40 μl aus der Sulzer-Vene) zu vermeiden. Zu diesem Zweck empfehlen die Autoren dringend, während des anfänglichen Aufbaus ein Pilotexperiment zur Messung von Metaboliten durchzuführen, bei dem nicht nur Blut aus der Sulzer-Vene, sondern auch Blut aus nicht-BAT-drainierendem venösem Blut (z. B. Vena cava inferior) verwendet wird. Dies wird dazu beitragen, zu bestätigen, ob das Serum der Sulzer-Vene im Vergleich zu den nicht BAT-Venengefäßen ein unterschiedliches Metabolitenprofil aufweist. In Bezug auf die arterielle Blutentnahme aus dem linken Ventrikel ist es wichtig, den gleichen Bereich des linken Ventrikels konsequent zu punktieren, um Schwankungen des Kardiokinspiegels zu minimieren61,62. Solche Variationen könnten zu verwirrenden Ergebnissen in der arteriovenösen Metabolomik oder -proteomik führen.
Die Chromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie ist eines der leistungsfähigsten Werkzeuge für die Metabolomik, eine Methode ist die GC-MS63. In der Tat wurde die Messung biologisch relevanter Metaboliten mittels GC-MS aufgrund des Abdeckungsproblems als schwierig angesehen; Die GC-MS-Anwendung beschränkt sich in der Regel auf die Analyse von Metaboliten mit leicht flüchtigen und unpolaren Eigenschaften im Gegensatz zu den zahlreichen polaren Metaboliten in Geweben und biologischen Flüssigkeiten. Die Entwicklung verschiedener Extraktions- und Derivatisierungsmethoden sowie die Vorteile der GC-MS, einschließlich hervorragender Peakauflösung, Reproduzierbarkeit und umfangreicher Massenspektrenbibliotheken, die eine praktische Peak-Identifizierung ermöglichen, haben jedoch dazu geführt, dass eine solche Plattform eine attraktive Option für die Analyse biologisch relevanter Metaboliten darstellt64,65.
In diesem Protokoll wird die GC-MS-Plattform für die Analyse von 25 Metaboliten in Serum eingesetzt, die mit der oben genannten Technik gesammelt wurden. Zu diesem Zweck wurde eine Metabolitenextraktion mit 80%iger Methanollösung durchgeführt. Zu beachten ist, dass in diesem Schritt die Verwendung bestimmter Arten von Röhrchen, einschließlich Eppendorf-Röhrchen, empfohlen wird, um die geringste Kontamination mit organischen Substanzen in den Proben zu erreichen. Eine sorgfältige Trennung des Überstandes von den Pellets nach der Extraktion ist auch erforderlich, um Proteinreste aus dem Serum zu entfernen, was für die Aufrechterhaltung der Leistung der MS-Ionenquelle entscheidend ist.
Der Derivatisierungsschritt kann basierend auf den Arten von Derivatisierungen, einschließlich Arylderivaten, Silylierung und Acylierung,diversifiziert werden 66. Die Autoren verwendeten die zweistufige Derivatisierung mit N-Methyl-N-tert-Butyldimethylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA) für die Metaboliten-Sialylierung, eine häufig verwendete Methode mit dem Vorteil eines stabilen Nachweises biologisch relevanter polarer Metaboliten, einschließlich Zuckern, jedoch mit einem Nachteil hinsichtlich des gelegentlichen Verlusts der N-Trimethylsilylgruppe von Aminen und Aminosäuren während des Analyseschritts64. Zu beachten ist, dass die Proben aufgrund der Feuchtigkeitsempfindlichkeit der Reagenzien und Derivate vor dem Derivatisierungsschritt vollständig getrocknet werden sollten.
Eine der Haupteinschränkungen der GC-Analyse im Allgemeinen liegt immer noch im Bereich der nachweisbaren Metaboliten, trotz der oben genannten Derivatisierungsschritte, die die GC-MS-Kapazität in Bezug auf den Nachweis polarer Metaboliten verbessern, insbesondere im Vergleich zur LC-MS-basierten Analyse. Die quantitative Metabolomik mittels LC-MS kann wesentlich dazu beitragen, einen besseren Einblick in das metabolische Spektrum von BATs in Bezug auf den systemischen Metabolitenaustausch zu erhalten24,42.
Obwohl die Berechnung, die bei der Protokollmessung des Metaboliten-Konzentrationsgradienten zwischen der arteriellen vs. venöses Blut; Log2(SV/LV)-quantifiziert die fraktionelle Absorptions- und Freisetzungsänderung durch BAT, bei der Interpretation der Daten ist Vorsicht geboten. Insbesondere bei Metaboliten, deren fraktioneller Nettoaustauschwert "0" ist (z. B. Citrat, αKG, Malat, Methionin, Alanin, Glutamin), könnte das Ergebnis entweder auf keine Aufnahme/Freisetzung oder auf einen ebenso aktiven Katabolismus und eine Synthese (bei der sowohl die Aufnahme als auch die Freisetzung hoch sind) zurückgeführt werden. Um zu überprüfen, welche der beiden Möglichkeiten richtig ist, sind zusätzliche Stoffwechselflussexperimente mittels Isotopenverfolgung in vivo mit dem aufgenommenen Metaboliten und/oder seinem Substrat erforderlich39.
Die Einschränkung der fraktionierten Berechnung besteht darin, dass sie nicht die quantitative Landschaft der Aufnahme und Freisetzung für diese Metaboliten liefert42,67. Obwohl beispielsweise der Log2(SV/LV)-Wert eine vergleichbare relative Nettoaufnahme zwischen Glukose und 3-Hydroxybutyrat (3HB) anzeigt, sollte der tatsächliche Beitrag von Glukose zu den Kohlenstoffquellen viel höher sein als 3-HB, da die Blutkonzentration von Glukose viel höher ist als die von 3HB und weil Glukose vier weitere Kohlenstoffe enthält (Glukose hat sechs Kohlenstoffe; 3HB hat zwei Kohlenstoffe). Falls erforderlich, sollte eine umfassende Analyse, die zusätzliche Parameter wie die Blutflussrate, die tatsächlichen Blutkonzentrationen jedes Metaboliten und ihre chemischen Gleichungen enthält, uns über die quantitativen Beiträge der aufgenommenen/freigesetzten Metaboliten und ihren Beitrag zum Gesamtkohlenstoff- oder Stickstofffluss informieren42,67.
Ein großer Vorteil dieser miniaturisierten Methodik für die arteriovenöse Blutentnahme und metabolomische Analyse auf Mausebene ist die synergistische Kombination mit verschiedenen genetischen Modellen zur Untersuchung des Stoffwechsels und der Physiologie des braunen Fettgewebes (z. B. UCP1-ko, UCP1-Cre-gesteuerte BAT-spezifische BAT-spezifische Loss-of-Function-Modelle, transgene Modelle). Neuere metabolomische Analysen, die nur Spuren von Serum für die Erstellung von metabolomischen Profilen benötigen, machen diesen Ansatz bei kleineren Organismen praktikabler (siehe Protokoll 3)39. Die Proteomanalyse, die zusammen mit der Metabolomik bessere Erkenntnisse liefern kann, kann jedoch größere Mengen an Proben erfordern. In dieser Hinsicht könnte eine konventionelle arteriovenöse Probenahme mit Ratten besser geeignet sein. Wir verweisen die Leser auf das neueste Protokoll für die arteriovenöse Blutentnahme auf BAT bei Ratten, das von Mestres-Arenas und Kollegen verfasst wurde47.
Obwohl das derzeitige Protokoll das Anästhesieverfahren mit Isofluran anwendet, wie es in Park et al.42 beschrieben ist, kann sich dieser Ansatz negativ auf den thermogenen Metabolismus von braunen Adipozyten und/oder braunem Fettgewebe in vivo auswirken 68,69,70,71. Daher ist eine zukünftige arteriovenöse Metabolomik mit Pentobarbital eine Untersuchung erforderlich.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine grundlegende Methodik zur Messung der BVT-spezifischen Netto-Stoffwechselaktivität (Verbrauch vs. Produktion) bei verschiedenen thermogenen Stimulationen bietet. Dies sollte uns wertvolle Einblicke in die Rolle von BAT als systemische Nährstoffsenke sowie als Lieferant geben, indem wichtige Stoffwechselbrennstoffe sowie sezernierte Metaboliten quantitativ aufgelistet werden. Darüber hinaus kann dies auch nützlich sein, um bisher ununtersuchte braune Adipokine aus Metaboliten zu identifizieren, insbesondere wenn sie mit entdeckungsbasierten Metabolom-Plattformen betrieben werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte zu melden haben.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern der Choi- und Jung-Laboratorien für die methodische Diskussion. Wir danken C. Jang und D. Guertin für Ratschläge und Rückmeldungen. Wir danken M.S. Choi für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von NRF-2022R1C1C1012034 an S.M.J. finanziert; NRF-2022R1C1C1007023 bis D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 an S.M.J. und D.W.C. Diese Arbeit wurde von der Chungnam National University für W.T.K. unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender (http://biorender.com/) erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-20 µL Filter Tips | Axygen | AX.TF-20-R-S | |
| 1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" | BD Biosciences | 309597 | |
| Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) | Agilent | G7077B | |
| Agilent 7693A Autosampler | Agilent | G4513A | |
| Agilent 8890 GC System | Agilent | G3542A | |
| Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI | Agilent | 19091S-433UI | |
| Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) | Agilent | G3335-90240 | |
| C57BL/6J mouse | DBL | C57BL/6JBomTac | |
| CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) | LABCONCO | 7811041 | |
| DL-Norvaline | Sigma-Aldrich | N7502-25G | |
| Eppendorf centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000210 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Glass insert 250 μL | Agilent | 5181-1270 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | Q34966-1L | |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904-5G | |
| Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base | Sarstedt | 20.1290.100 | |
| MTBSTFA | Sigma-Aldrich | 394882-100ML | |
| Pyridine(anhydrous, 99.8%) | Sigma-Aldrich | 270970-100ML | |
| Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators | LABCONCO | 7310041 | |
| Rodent diet | SAFE | SAFE R+40-10 | |
| Rodent incubator | Power scientific | RIT33SD | |
| Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" | BD Biosciences | 328203 | |
| Vial Cap 9 mm | Agilent | 5190-9067 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL | Agilent | 5190-9063 | |
| Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 | Axygen | PCR-02-C |
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