Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Arteriovenös metabolomik för att mäta in vivo metabolitutbyte i brun fettvävnad

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/66012
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 3, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University (SKKU), 2Department of Biochemistry, College of Natural Sciences, Chungnam National University, 3Department of Biotechnology, College of Life Sciences and Biotechnology, Korea University
* These authors contributed equally

Summary

I detta protokoll beskrivs metoder som är relevanta för BAT-optimerad arteriovenös metabolomik med GC-MS i en musmodell. Dessa metoder gör det möjligt att få värdefulla insikter om BAT-medierat metabolitutbyte på organismnivå.

Abstract

Brun fettvävnad (BAT) spelar en avgörande roll för att reglera metabolisk homeostas genom en unik energiförbrukningsprocess som kallas icke-skakande termogenes. För att uppnå detta använder BAT en varierad meny av cirkulerande näringsämnen för att stödja sitt höga metaboliska behov. BAT utsöndrar dessutom bioaktiva faktorer som härrör från metaboliter och som kan fungera som antingen metaboliska bränslen eller signalmolekyler, vilket underlättar BAT-medierad kommunikation inom och/eller mellan vävnader. Detta tyder på att BAT aktivt deltar i det systemiska metabolitutbytet, en intressant egenskap som börjar utforskas. Här introducerar vi ett protokoll för in vivo optimerad BAT arteriovenös metabolomik på musnivå. Protokollet fokuserar på relevanta metoder för termogena stimuleringar och en arteriovenös blodprovstagningsteknik med hjälp av Sulzers ven, som selektivt dränerar interscapular BAT-härlett venöst blod och systemiskt arteriellt blod. Därefter demonstreras ett gaskromatografibaserat metabolomikprotokoll med hjälp av dessa blodprover. Användningen av denna teknik bör öka förståelsen av BAT-reglerat metabolitutbyte mellan organ genom att mäta nettoupptag och frisättning av metaboliter genom BAT.

Introduction

Brun fettvävnad (BAT) har en unik energiförbrukningsegenskap som kallas icke-skakande termogenes (NST), som involverar både mitokondriellt frikopplingsprotein 1 (UCP1)-beroende och UCP1-oberoende mekanismer 1,2,3,4,5. Dessa särdrag innebär att BAT är inblandad i regleringen av systemisk metabolism och patogenesen av metabola sjukdomar, inklusive fetma, typ 2-diabetes, hjärt-kärlsjukdom och cancerkakexi 6,7,8. Nyligen genomförda retrospektiva studier har visat ett omvänt samband mellan BAT-massa och/eller dess metaboliska aktivitet med fetma, hyperglykemi och kardiometabol hälsa hos människor 9,10,11.

På senare tid har BAT föreslagits som en metabolisk sänka som ansvarar för att upprätthålla NST, eftersom den kräver betydande mängder cirkulerande näringsämnen som termogen bränsle6,7. BAT kan dessutom generera och frigöra bioaktiva faktorer, så kallade bruna adipokiner eller BATokiner, som fungerar som endokrina och/eller parakrina signaler, vilket indikerar dess aktiva inblandning i metabolisk homeostas på systemnivå 12,13,14,15. Att förstå BAT:s näringsmetabolism bör därför öka vår förståelse för dess patofysiologiska betydelse hos människor, utöver dess konventionella roll som ett termoreglerande organ.

Metabolomikstudier med stabila isotopspårämnen, i kombination med klassiska studier av näringsupptag med icke-metaboliserbara radioaktiva spårämnen, har avsevärt förbättrat vår förståelse av vilka näringsämnen som företrädesvis tas upp av BAT och hur de utnyttjas 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Studier av radioaktiva spårämnen har till exempel visat att köldaktiverad BAT tar upp glukos, lipoproteinbundna fettsyror och grenade aminosyror 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Nyligen genomförd isotopspårning i kombination med metabolomiska studier har gjort det möjligt för oss att mäta det metaboliska ödet och flödet av dessa näringsämnen i vävnader och odlade celler 24,25,26,28,29,30. Dessa analyser fokuserar dock främst på det individuella utnyttjandet av näringsämnen, vilket ger oss begränsad kunskap om BAT:s roll på systemnivå i organmetabolitutbytet. Frågor om den specifika serie av cirkulerande näringsämnen som förbrukas av bästa tillgängliga teknik och deras kvantitativa bidrag i form av kol och kväve är fortfarande svårfångade. Dessutom har undersökningen av huruvida BAT kan generera och frisätta metabolithärledda BATokiner (t.ex. lipokiner) med hjälp av näringsämnen precis börjat 12,13,14,15,31,32.

Arteriovenös blodanalys är en klassisk fysiologisk metod som används för att bedöma det specifika upptaget eller frisättningen av cirkulerande molekyler i organ/vävnader. Denna teknik har tidigare tillämpats på den interscapulära BAT hos råttor för att mäta syre och flera metaboliter, och därigenom etablera BAT som den viktigaste platsen för adaptiv termogenes med dess katabola potential 33,34,35,36,37. Nyligen kombinerades en arteriovenös studie med interscapulär BAT på råtta med en trans-omics-metod, vilket ledde till identifiering av oupptäckta BATokiner som frigörs av termogent stimulerad BAT38.

De senaste framstegen inom högkänslig gaskromatografi- och vätskekromatografi-masspektrometri (GC-MS och LC-MS)-baserad metabolomik har återuppväckt intresset för arteriovenösa studier för kvantitativ analys av organspecifikt metabolitutbyte 39,40,41. Dessa tekniker, med sin höga upplösningsförmåga och massnoggrannhet, möjliggör omfattande analys av ett brett spektrum av metaboliter med hjälp av små provmängder.

I linje med dessa framsteg har man i en nyligen genomförd studie framgångsrikt anpassat arteriovenös metabolomik för att studera BAT på musnivå, vilket möjliggör kvantitativ analys av metabolitutbytesaktiviteter i BAT under olika förhållanden42. Den här artikeln presenterar ett BAT-riktat arteriovenöst metabolomikprotokoll med GC-MS i en C57BL/6J-musmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes med godkännande av Sungkyunkwan University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Mössen inhystes i en IACUC-godkänd djuranläggning i ett renrum med en luftfuktighet på 22 °C och 45 % luftfuktighet, efter en daglig 12 timmars ljus/mörker-cykel. De hölls i ventilerade ställningar och hade tillgång till en standarddiet ad libitum (bestående av 60 % kolhydrater, 16 % protein och 3 % fett). Strö och bomaterial byttes ut varje vecka. För denna studie användes manliga C57BL/6J-möss i åldern 12 veckor och som vägde mellan 25 g och 30 g. Dessa djur köptes in från en kommersiell leverantör (se materialförteckning).

1. Modulering av den bruna fettvävnadens metaboliska aktivitet genom temperaturacklimatisering och farmakologisk stimulering

OBS: Temperaturacklimatisering under flera dagar till veckor eller farmakologisk stimulering med β-adrenerga receptoragonister är vanliga metoder för att modulera BAT-aktivitet1. Därför ges en kortfattad översikt över metoden nedan för att göra det möjligt för läsarna att välja lämpligt tillvägagångssätt efter behov. För att erhålla metaboliskt inaktiv (mindre termogen) BAT väljs en varm baslinjetemperatur, kallad termoneutralitet (28-30 °C), för C57BL/6J-möss. Detta intervall säkerställer att mössen inte behöver använda extra energi för att hålla en konstant kroppstemperatur. För att uppnå metaboliskt måttlig eller högaktiv (termogen) BAT kan mild kyla (20-22 °C) respektive sträng kyla (6 °C) temperaturer väljas. I detta experiment föddes möss upp under normala inhysningsförhållanden vid 22 °C, vilket, även om det var milt kallt för möss, inte involverade några farmakologiska stimuleringar.

  1. Acklimatisering av temperatur
    1. Separera mössen för att hysa 1 eller 2 möss per bur minst 1 vecka före start av temperaturacklimatisering. Förbered gnagarinkubatorer utrustade med luftventilation, temperatur- och luftfuktighetskontroll med önskade förhållanden.
    2. Flytta burarna till sina respektive gnagarkuvöser på lämpliga dagar för den valda typen av temperaturacklimatisering.
    3. Se till att antalet möss är jämnt fördelat över alla grupper, med antingen 1 eller 2 möss per bur. Enkelboende är att föredra eftersom det är känsligare för temperaturinducerade fysiologiska förändringar jämfört med gruppboende43. Här är de specifika boendeförhållandena för varje grupp:
      1. Termoneutralitet (30 °C): Förvara mössen i denna grupp kontinuerligt vid en temperatur på 30 °C i upp till fyra veckor.
      2. Sträng kyla: Till en början hålls mössen i denna grupp vid 18 °C utan bomaterial. De kommer att uppleva en gradvis temperatursänkning varje vecka och nå 6 °C under den fjärde veckan. Temperaturutvecklingen är som följer: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.
      3. Grupp med mild kyla (20–22 °C): Inhyser mössen i denna grupp i gnagarkuvöser under samma förhållanden som tidigare nämnts i standardstall.
      4. Utmaningar med akut kyla: För utmaningar med akut kyla, placera 1-2 möss per bur utan bomaterial och utsätt dem för en gnagarkuvös inställd på 6 °C i upp till 8 timmar.
        ANMÄRKNING: Dessa inhysningsförhållanden och temperaturvariationer är väsentliga för att studera effekterna av olika temperaturmiljöer på BAT-aktivitet och ämnesomsättning.
    4. Byt burar och fyll på mat och vatten varje vecka. Föracklimatisera burarna minst 24 timmar före tillskottet, vid deras respektive temperatur (gnagarinkubator).
      OBS: För att förhindra störning av lämplig temperaturstimulans är det viktigt att inte tillhandahålla musberikningar som kan leda till bobyggande. Som svar på sträng kyla förbrukar möss mer energi för att upprätthålla kroppstemperaturen, vilket resulterar i ökat födointag och högre utsöndringshastighet. Därför är det viktigt att kontrollera burarna minst två till tre gånger i veckan (enligt lokala institutionella riktlinjer) för att säkerställa att mössen har tillräcklig tillgång till mat och vatten och att burarna inte är alltför blöta. Denna övervakning är viktig för att upprätthålla mössens välbefinnande och hälsa under studien.
  2. Farmakologisk stimulering1 med β3-adrenerg receptoragonist CL316,243
    1. För att maximera den stimulerande effekten, förinhysa mössen vid termoneutralitet (30 °C) i 2-4 veckor före injektioner.
    2. Efter acklimatiseringsperioden injiceras 1 mg/kg CL316,243 intraperitonealt.
      OBS: För kronisk stimulering med β3-adrenerg receptoragonist (t.ex. från 3 dagar upp till vecka 1,44,45) krävs dagliga injektioner på grund av läkemedelsstabilitet. Utspädd CL316,243 bör beredas på injektionsdagen på grund av stabiliteten.

2. Arteriovenös blodprovstagning

OBS: Möss över 12-14 veckor rekommenderas bäst för arteriovenös blodprovstagning. Yngre möss kanske inte har tillräckligt stora Sulzers vener, ett distinkt blodkärl som specifikt dränerar venöst blod från det interscapulära BAT46.

  1. Bedöva försiktigt med den kalibrerade förångaren med 3 % isofluran för induktion (i en kammare med måtten 205 x 265 x 200 mm) och 2 % isofluran för underhåll (med en gasanestesimal).
    OBS: Hela arteriovenös blodprovstagning bör utföras omedelbart efter anestesi. En vattenuppvärmd värmedyna kan användas under anestesi för att bibehålla kroppstemperaturen.
    VARNING: Isofluran är mycket flyktigt och giftigt vid inandning. Därför måste primär bedövning utföras under dragskåp.
  2. Verifiera djurets reflexer, t.ex. indragning av tassen, för att bekräfta att bedövningen har nått ett lämpligt djup.
  3. Uppsamling av venöst blod från Sulzers ven
    1. Placera musen för att exponera rygghuden, bekräfta anestesidjupet via ett tånyp precis innan du gör snittet. Fukta rygghuden med rikligt med 70 % etanol för att förhindra håravlossning, och gör ett snitt längs ryggen från nedre delen av bröstkorgen hela vägen upp till nacken.
      OBS: Den interskapulära BAT är placerad precis under huden och består av två fettkuddar täckta av tunn vit fettvävnad. Det är viktigt att se till att musen förblir under narkos genom gasanestesimaren.
    2. Lyft försiktigt den interskapulära BAT-tekniken med en böjd pincett och skär försiktigt av de fastsittande vävnaderna, varav de flesta är muskler. Lyft upp fettkudden mot huvudet, fortsätt att skära av de anslutna vävnaderna och öppna försiktigt området tills Sulzers ven (ett stort "Y"-format mörkrött kärl som är anslutet till båda fettkuddarna i interskapulärt BAT) är exponerat.
      OBS: Var försiktig så att du inte skär av kapillärkärlen i muskelvävnad som är förbundna med den främre och sidoregionen av interscapulär BAT, eftersom detta avsevärt kommer att minska mängden och kvaliteten på blodet som dräneras från Sulzers ven.
    3. Skär försiktigt av Sulzers ven och samla upp cirka 40 μL blod med hjälp av 200 μL pipettspetsar och en P100-pipett. Förvara blodet i ett bloduppsamlingsrör och håll röret på is tills serumuppsamlingsprocessen.
      OBS: Det är viktigt att samla upp blod strax under den Y-formade delningspunkten i Sulzers ven för att förhindra blodkontaminering från den övre hålvenen47. Att samla för mycket blod kommer att försämra egenskaperna hos Sulzers ven. Se därför till att samla in den minsta mängd blod som behövs från Sulzers ven för analys. Var eftertänksam när du väljer blodprovsrör, eftersom serum och plasma ger olika metabolitprofiler 48,49,50. För plasmauppsamling är det nödvändigt att använda heparinbelagda rör. I detta experiment valdes koagulationsaktivatorbelagda rör för att erhålla serum. Under inga omständigheter bör EDTA-belagda rör användas, eftersom EDTA har en betydande inverkan på masspektrometrisignalerna51,52.
  4. Uppsamling av arteriellt blod från vänster kammare
    1. Vänd musen utan att tappa kontakten med näskonen för att exponera ventral hud. Bekräfta anestesidjupet med ett tånyp innan snittet görs. Fukta den ventrala huden med riklig mängd 70 % etanol för att förhindra håravlossning, och öppna försiktigt brösthålan med en sax för att exponera hjärtat utan att skada någon inre struktur.
    2. Punktera försiktigt det övre området av vänster kammare med en 1 ml spruta med en 29 G (1/2") nål. Stick in två tredjedelar av en 1/2'' nål till 3-5 mm till höger horisontellt om hjärtats spets (Figur 1B) och dra tillbaka sprutan för att samla upp blod från vänster kammare (50-100 μL). Blodet från vänster kammare är syresatt arteriellt blod som är klarrött. Förvara blodet i ett bloduppsamlingsrör och håll röret på is tills serumuppsamlingsprocessen.
      OBS: Ett minimalt snitt bör göras i brösthålan för åtkomst till hjärtat. Överdrivet snitt kan leda till lokal blödning, vilket senare kan resultera i lågt blodtryck. Detta kan påverka kvaliteten på arteriellt blod som samlas in från vänster kammare. Undvik att rotera eller vända hjärtat, eftersom det gör det svårt att bestämma den exakta positionen för vänster kammare.
    3. Utför dödshjälp och säkerställ den med en lämplig metod enligt de lokala institutionernas riktlinjer. Till exempel kan eutanasi utföras genom livmoderhalsluxation och bekräftas genom att hjärtslagen upphör.
  5. Centrifugera blodproverna vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Samla försiktigt upp supernatanten med hjälp av en pipett. Supernatanten ska innehålla antingen serum eller plasma beroende på vilken typ av blodprovsrör som används. Man kan stanna här och förvara proverna vid -20 °C fram till serumbearbetning för GC-MS-analys.
    OBS: Hemolys kan eventuellt ha inträffat om rödfärgad supernatant observeras. För att undvika hemolys, virvla provet innan koaguleringen är klar. Vissa metaboliter berikade med röda blodkroppar, inklusive glutamin och laktat, kan leda till feltolkning av data, även om de flesta metaboliter kanske inte påverkas nämnvärt av hemolys. Analys av serum/plasma inom en vecka rekommenderas.

3. Metabolitextraktion från serum och kemisk derivatisering

  1. Förberedelse för extraktionen
    OBS: Alla metoder inklusive metabolitextraktion, derivatisering och dataanalys är något modifierade versioner av tidigare beskrivna metoder53,54.
    1. Bered extraktionsbufferten genom att tillsätta 100 μM lösning av DL-norvalin, intern standard (se materialtabell), till metanol av MS-kvalitet.
    2. Se till att alla försöksprocedurer utförs på is.
  2. Överför 10 μl musserum extraherat från antingen Sulzers ven eller vänster kammare till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 40 μL extraktionsbuffert.
  3. För att avlägsna cellrester och protein, virvla serumproverna kort, följt av centrifugering med maximal hastighet (18 000 x g) i 30 minuter vid 4 °C.
  4. Efter centrifugeringen överförs försiktigt 40 μl supernatanten till en injektionsflaska av glas följt av 3 timmars torkning i en vakuumcentrifug vid 4 °C.
    OBS: En glasinsats (se materialförteckning) rekommenderas istället för plaströr på grund av plastreaktiva kemikalier som används under hela det efterföljande derivatiseringssteget.
  5. Utsätt de torkade proverna för två på varandra följande derivatiseringssteg för GC-MS-analys av serummetaboliterna.
    OBS: Följande steg bör utföras under ett dragskåp på grund av irritationsrisker med lösningsmedlen.
    1. Återsuspendera de torkade serumextrakten i 30 μl 10 mg/ml metoxiaminhydroklorid (se materialförteckning) upplösta i pyridin och inkubera det vid 37 °C i 30 minuter.
    2. Derivatisera prover för silylering av metaboliter med 70 μl N-metyl-N-tert-butyldimetylsilylrifluoracetamid (MTBSTFA, se materialtabell) vid 70 °C i 1 timme.
      OBS: Användning av en glasspruta rekommenderas i stället för en plastspets i följande steg på grund av derivatiseringslösningsmedlen som reagerar med plast.

4. Metabolomikanalys med GC-MS

OBS: En fyrdubbel GC-MS (se materialtabell) användes för att mäta de olika serummetaboliterna inklusive kolhydrater, aminosyror och TCA-cykelintermediärer i derivatiserade prover från Sulzers ven och vänster kammare. Andra kolonner kan alternativt användas, även om de experimentella inställningarna inklusive temperaturprogrammet kan variera beroende på vilka typer av kolonner som används.

  1. Injicera 1 μl av det derivatiserade provet i GC i splitless-läge vid 280 °C (inloppstemperatur), med helium som bärgas med en flödeshastighet på 1.500 ml/min (börvärde).
  2. Ställ in kvadrupolen på 200 °C med GC-MS-gränssnittet på 300 °C.
    OBS: Ugnsprogrammet för alla metabolitanalyser börjar vid 60 °C, hålls i 1 minut och ökas sedan med en hastighet av 10 °C/min tills temperaturen når 320 °C.
  3. Samla in data genom elektronjonisering (EI) inställd på 70 eV och samla in provdata i skanningsläge (50-550 m/z)53. Alla metaboliter som användes i denna studie har tidigare validerats med standarder för att bekräfta masspektra och retentionstider.
  4. Utför toppområdesintegration med hjälp av en kommersiellt tillgänglig analysprogramvara (se materialförteckning).
  5. Matcha föreningarna med produktjonen av varje TBMDS-derivat. Erhåll sedan extraktionsjonkromatogrammet (EIC) genom att integrera fragmentjonens m/z-värde i motsvarande toppområde och exportera det sedan. Fragmentjoner visas i tabell 1.
    OBS: EIC för varje förening normaliserades av DL-norvalin i varje sample. Data representeras av Log2 Sulzers ven till vänster kammare (Log2(SV/LV)) med hjälp av varje normaliserat EIC-värde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerar det experimentella schemat för BAT-optimerad AV-metabolomik. Som nämnts i protokollavsnittet, för att erhålla differentiellt stimulerad brun fettvävnad, genomgår möss temperaturacklimatisering med hjälp av gnagarinkubatorer eller får farmakologisk administrering såsom β-adrenerga receptoragonister. Därefter sövs möss och blodprover samlas in för metabolomisk analys (Figur 1A). Vid blodprovstagning samlas venöst blod som dräneras specifikt från interskapulärt BAT via Sulzers ven, medan arteriellt blod samlas in direkt från hjärtats vänstra kammare (Figur 1B).

Figur 2 visar schemat för serummetabolomik med GC-MS (figur 2). I korthet tillsätts metanollösningen till serumprover följt av centrifugering för att avlägsna serumproteiner. Supernatanten som innehöll metaboliterna torkades i en SpeedVac och de torkade proverna utsattes för tvåstegsderivatisering med metoxiamin (MOX) och MTBSTFA (N-tert-butyldimetylsilyl-N-metyltrifluoracetamid). Derivatiseringssteget syftar till att ersätta polära funktionella grupper av metaboliterna med TBDMS-ester, vilket möjliggör GC-MS-detektion av metaboliter som TBDMS-derivat. De derivatiserade proverna analyserades med hjälp av enkel-kvadrupel GC-MS. Metaboliter separeras i kolonnen efter deras fysiokemiska egenskaper. Elektronjonisering (EI) används för att bryta ner metaboliterna till unika fragmentjoner som detekteras av en massdetektor. Identifiering av föreningar utförs genom detektion av föreningsspecifika fragmentjoner. m/z-värdet och retentionstiden för de föreningsspecifika fragmentjonerna i experimentet visas i tabellen (tabell 1). Ett extraherat jonkromatogram (EIC) används för att integrera signalen från en föreningsspecifik fragmentjon i metabolitens toppområde, vilket definierar mängden metaboliter.

För att avgöra om BAT frisätter eller tar upp en serie metaboliterkan logariternas 2-kvoter för jonantalet mellan Sulzers ven och vänster kammare (Log2(SV/LV)) beräknas (figur 3). Om Log2(SV/LV)-värdet för en viss metabolit är >0 indikerar det att metaboliten är rikligare i SV än LV, vilket tyder på att interskapulärt BAT-netto frisätter metaboliten. Omvänt, om Log2(SV/LV)-värdet för en viss metabolit är <0, tyder det på att metaboliten tas upp av den interskapulära BAT.

Med hjälp av detta tillvägagångssätt fann man att mild köldstimulerad BAT signifikant förbrukar glukos, laktat, 3-hydroxibutyrat (3-HB), BCAA, aspartat, lysin och tryptofan, medan BAT signifikant frigör succinat och palmitat (figur 3A). De flesta av dessa fenomen observerades i våra tidigare studier av kronisk förkylning BAT42, vilket tyder på att mild förkylnings-BAT metaboliskt liknar kronisk kall BAT, om än i mindre utsträckning. För att ge en snabb visuell översikt över data visas en värmekarta som visar Log2-värden (SV/LV) (figur 3B). Det är viktigt att tolka data med försiktighet, eftersom värmekartan representerar Z-poäng inom gruppen.

Figure 1
Figur 1: Experimentellt schema för BAT-optimerad arteriovenös (AV) metabolomik. (A) Diagram som visar arbetsflödet för AV-metabolomik. (1) För att inducera olika versioner av metaboliskt stimulerad brun fettvävnad (BAT) acklimatiseras möss till olika temperaturer eller får farmakologiska läkemedelsinjektioner. (2) Därefter tas arteriella och venösa blodprover från vänster kammare respektive Sulzers ven hos mössen. (3) De erhållna serumproverna extraheras med metaboliter, följt av metabolomisk analys. B) Representativa bilder som ger vägledning för blodprovstagningsförfaranden. Arteriellblod samlas in från vänster kammare, medan venöst blod erhålls från Sulzers ven eftersom det specifikt dränerar blod från BAT. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: GC/MS-baserad riktad metabolomik. Experimentellt schema för GC/MS-baserad riktad metabolomik. TBDMS: tert-butyldimetylsilyl, EI: elektronjonisering, EIC: extraktjonkromatogram. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa data för AV-metabolomik. A) Upptag och efterföljande frisättning av utvalda vanliga och mycket aktiva metaboliter av cirkulerande bränslen med hjälp av BAT klassificerade efter respektive grupp. Data visar Log2 Sulzers ven till vänster kammare (SV/LV) kvoter. Staplar som indikerar metaboliter med medelvärde för Log2 (SV/LV) <0 är rödfärgade och Log2 (SV/LV) >0 är färgade blå. Enskilda datapunkter representerar varje mus. n = 11. Data är medelvärdet ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. BCAA; grenad aminosyra; EAA. essentiell aminosyra; NEAA; icke-essentiell aminosyra. (B) En värmekarta som illustrerar den differentierade förekomsten av metaboliter mellan Sulzers ven (SV) och vänster kammare (LV) blod. Varje kolumn visar en Z-poäng för medelvärden inom gruppen. n = 11. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Förening m/z av fragmentjoner Lagringstid Formulan TBDMS derivat formulerare
Pyruvat 174.1 8.72 C3H4O3 C15H33O3NSi2
Aspartat 418.2 18.45 C4H7NO4 C22H49NO4Si3
α-ketoglutarat 346.2 17.27 C5H6O5 C18H37NO5Si2
C16:0(Palmitat) 313.3 19.72 C16H32O2 C22H46O2Si
Laktat 261.2 11.66 C3H6O3 C15H34O3Si2
Leucin 200.2 14 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Isoleucin 200.2 14.34 C6H13NO2 C18H41NO2Si2
Valin 186.2 13.53 C5H11NO2 C17H39NO2Si2
Alanin 260.2 12.17 C3H7NO2 C15H35NO2Si2
Serin 390.2 17.04 C3H7NO3 C21H49NO3Si3
Glycin 218.1 12.43 C2H5NO2 C14H33NO2Si2
Lysin 300.2 20.48 C6H14N2O2 C24H56N2O2Si3
Succinate 289.1 14.65 C4H6O4 C16H34O4Si2
Prolin 258.2 14.73 C5H9NO2 C17H37NO2Si2
Fenylalanin 336.2 18 C9H11NO2 C21H39NO2Si2
Metionin 320.2 16.84 C5H11NO2S C17H39NO2SSi2
Cystein 406.2 19 C3H7NO2S C21H49NO2SSi3
Sparargin 417.2 19.86 C4H8N2O3 C22H50N2O3Si3
3-hydroxibutyrat (3HB) 275.2 12.81 C4H8O3 C16H36O3Si2
Tryptofan 375.2 22.97 C11H12N2O2 C23H40N2O2Si2
Malate 419.2 18.19 C4H6O5 C22H48O5Si3
Glutamat 432.3 19.59 C5H9NO4 C23H51NO4Si3
Glutamin 431.3 20.85 C5H10N2O3 C23H52N2O3Si3
Citrat 459.2 22.38 C6H8O7 C30H64O7Si4
Glukos 476.3 22.7 C6H12O6 C30H68O6Si4

Tabell 1: GC/MS-sammansatta fragmentjoner som används för integration. Denna tabell innehåller en förteckning över 25 serummetaboliter som identifierats med denna metod, med retentionstid och fragmentjoner som motsvarar varje förening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett viktigt steg för att förstå BAT:s metaboliska potential i hela kroppens energibalans är att definiera vilka näringsämnen den konsumerar, hur de metaboliskt bearbetas och vilka metaboliter som släpps ut i cirkulationen. Detta protokoll introducerar en specialiserad arteriovenös provtagningsteknik som möjliggör tillgång till den venösa vaskulaturen av interscapular BAT och systemisk arteriell vaskulatur i C57BL/6J-möss, som nyligen utvecklades och validerades av Park et al42. Nedan följer viktiga punkter som du bör tänka på när du följer protokollet.

För termogen stimulering är det viktigt att välja den lämpligaste typen av termogen stimulering för din experimentella miljö. Till exempel, när man använder en experimentell grupp (jämfört med kontroll) och syftar till att observera skillnader i den metaboliska anpassningsförmågan (avgörande för dess maximala icke-skakande termogena potential) av BAT, är kronisk köldacklimatisering eller β-adrenerg receptorstimulering (som varar mer än 3 dagar till 4 veckor) lämplig 1,45. När BAT utsätts för akut exponering för kyla (några timmar mindre än 24 timmar) metaboliserar BAT sina inneboende lagrade bränslen i stället för att anpassa sig metaboliskt och kommunicerar metaboliskt med huttrande muskler för optimal termogenes1. En β-adrenerg receptoragonist representerar ett neuronalt svar för att utlösa BAT-termogenes 1,14, och det finns andra endokrina faktorer som förstärker det termogena programmet 55,56,57,58,59,60. När termogen stimulering utförs enligt ovan bör det vara användbart att ha en baslinjekontroll vid termoneutralitet (30 °C) för att bekräfta om stimuleringen fungerade korrekt.

Som nämnts i protokollavsnittet är det viktigt att få arteriovenöst blod av högsta kvalitet för att avgöra om experimentet ska lyckas etableras. För att uppnå detta är det viktigt att förhindra hemolys (se steg 2.5) och samla in en jämn mängd blod för att undvika utspädning av de distinkta egenskaperna hos venöst blod från Sulzers ven (mindre än 40 μL från Sulzers ven). För detta ändamål rekommenderar författarna starkt att man under den inledande installationen utför ett pilotexperiment för metabolitmätning med inte bara blod från Sulzers ven, utan även blod från icke-BAT-dränerande venöst blod (t.ex. nedre vena cava). Detta kommer att bidra till att bekräfta om serumet i Sulzers ven uppvisar en distinkt metabolitprofilering jämfört med de venösa kärlen som inte ingår i BAT. När det gäller arteriell bloduppsamling från vänster kammare är det viktigt att konsekvent punktera samma område på vänster kammare för att minimera variationer i kardiokinnivåer61,62. Sådana variationer kan ge förvirrande resultat inom arteriovenös metabolomik eller -proteomik.

Kromatografi i kombination med masspektrometri är ett av de mest kraftfulla verktygen för metabolomik, en metod är GC-MS63. Mätningen av biologiskt relevanta metaboliter med GC-MS ansågs vara en utmaning på grund av täckningsproblemet. GC-MS-applikationen är vanligtvis begränsad till analys av metaboliter med mycket flyktiga och icke-polära egenskaper i motsats till de många polära metaboliterna i vävnader och biologiska vätskor. Utvecklingen av olika extraktions- och derivatiseringsmetoder, tillsammans med fördelarna med GC-MS, inklusive utmärkt toppupplösning, reproducerbarhet och omfattande masspektralbibliotek som möjliggör praktisk toppidentifiering, har dock lett till en sådan plattform som ett attraktivt alternativ för att analysera biologiskt relevanta metaboliter64,65.

I detta protokoll används GC-MS-plattformen för analys av 25 metaboliter i serum som samlats in med ovannämnda teknik. För detta ändamål utfördes metabolitextraktion med 80 % metanollösning. Observera att under detta steg rekommenderas användning av vissa typer av rör, inklusive Eppendorf-rör, för att uppnå de lägsta nivåerna av kontaminering av organiska ämnen i proverna. Noggrann separering av supernatanten från pellets efter extraktion behövs också för att avlägsna proteinrester från serumet, vilket är avgörande för att upprätthålla MS-jonkällans prestanda.

Derivatiseringssteget kan diversifieras baserat på typerna av derivatiseringar inklusive arylderivat, silylering och acylering66. Författarna använde tvåstegsderivatisering med N-metyl-N-tert-butyldimetylsilylrifluoroacetamid (MTBSTFA) för metabolitsialylering, vilket är en vanligt använd metod med fördelen av stabil detektion av biologiskt relevanta polära metaboliter inklusive sockerarter, men med en nackdel när det gäller tillfällig förlust av N-trimetylsilylgruppen av aminer och aminosyror under analyssteget64. Observera att proverna bör torkas helt före derivatiseringssteget, på grund av reagensernas och derivatens fuktkänslighet.

En av de största begränsningarna med GC-analysen kommer i allmänhet fortfarande ner till intervallet av detekterbara metaboliter trots de tidigare nämnda derivatiseringsstegen som förbättrar GC-MS-kapaciteten när det gäller detektion av polära metaboliter, särskilt jämfört med LC-MS-baserad analys. Kvantitativ metabolomik med LC-MS kan i hög grad bidra till att få bättre insikt i det metaboliska spektrumet av BAT med avseende på systemiskt metabolitutbyte24,42.

Även om den beräkning som används i protokollmätningen av metabolitkoncentrationsgradienten mellan artären vs. venöst blod; Log2(SV/LV)-kvantifierar fraktionerad absorption och frisättningsförändring med BAT, försiktighet krävs för tolkning av data. Särskilt för de metaboliter vars fraktionella nettobytesvärde är "0" (t.ex. citrat, αkg, malat, metionin, alanin, glutamin) kan resultatet tillskrivas antingen inget upptag/ingen frisättning eller lika aktiv katabolism och syntes (där både upptag och frisättning är hög). För att verifiera vilken av de två möjligheterna som är korrekt krävs ytterligare metaboliska flödesexperiment med isotopspårning in vivo med den upptagna metaboliten och/eller dess substrat39.

Begränsningen med den fraktionerade beräkningen är att den inte ger det kvantitativa landskapet för upptag och frisättning av dessa metaboliter42,67. Till exempel, även om Log2(SV/LV)-värdet indikerar ett jämförbart relativt nettoupptag mellan glukos och 3-hydroxibutyrat (3HB), bör det faktiska bidraget av glukos till kolkällorna vara mycket högre än 3-HB på grund av det faktum att blodkoncentrationen av glukos är mycket högre än för 3HB, och eftersom glukos innehåller ytterligare fyra kolatomer (glukos har sex kolatomer; 3HB har två kolatomer). Om så krävs bör en omfattande analys som omfattar ytterligare parametrar, t.ex. blodflödeshastighet, faktiska blodkoncentrationer av varje metabolit och deras kemiska ekvationer, ge oss information om de kvantitativa bidragen från de metaboliter som tas upp/släpps ut och deras bidrag till det totala kol- eller kväveflödet42,67.

En stor fördel med denna miniatyriserade metodik för arteriovenös blodprovstagning och metabolomisk analys på musnivå är dess synergistiska kombination med olika genetiska modeller för att studera brun fettvävsmetabolism och fysiologi (t.ex. UCP1-KO, UCP1-Cre-drivna BAT-specifika funktionsförlustmodeller, transgena modeller). Nyligen genomförda metabolomiska analyser, som endast kräver spårmängder av serum för metabolomisk profilering, gör detta tillvägagångssätt mer genomförbart med mindre organismer (se protokoll 3)39. Proteomikanalys, som kan ge bättre insikter när den beaktas tillsammans med metabolomik, kan dock kräva större mängder prover. I detta avseende kan konventionell arteriovenös provtagning på råttor vara lämpligare. Vi hänvisar läsarna till det senaste protokollet för arteriovenös blodprovstagning för BAT hos råttor, skrivet av Mestres-Arenas och kollegor47.

Även om det nuvarande protokollet använder anestesiproceduren med isofluran som beskrivs i Park et al.42, kan detta tillvägagångssätt negativt påverka den termogena metabolismen av bruna adipocyter och/eller brun fettvävnad in vivo 68,69,70,71. Därför motiverar framtida arteriovenös metabolomik med pentobarbital undersökning.

Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll en grundläggande metod för att mäta BAT-specifik nettometabolisk aktivitet (konsumtion kontra produktion) vid olika termogena stimuleringar. Detta bör ge oss värdefulla insikter om BAT:s roll som systemisk näringssänka och leverantör genom att kvantitativt förteckna viktiga metaboliska bränslen samt utsöndrade metaboliter. Dessutom kan detta också vara användbart för att identifiera tidigare ostuderade metabolit-härledda bruna adipokiner, särskilt när de används med upptäcktsbaserade metabolomiska plattformar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter att rapportera.

Acknowledgments

Vi tackar alla medlemmar i Choi- och Jung-laboratorierna för metodologiska diskussioner. Vi tackar C. Jang och D. Guertin för råd och feedback. Vi tackar M.S. Choi för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete finansierades av NRF-2022R1C1C1012034 till S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 till D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 till S.M.J. och D.W.C. Detta arbete stöddes av Chungnam National University för W.T.K. Figur 1 och Figur 2 skapades med hjälp av BioRender (http://biorender.com/).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 200 Brun fettvävnad BAT icke-skakande termogenes metabolisk homeostas cirkulerande näringsämnen energiförbrukningsprocess bioaktiva faktorer metaboliska bränslen signalmolekyler kommunikation inom vävnad kommunikation mellan vävnader optimerad BAT på musnivå Arteriovenös metabolomik termogena stimuleringar arteriovenös blodprovstagningsteknik Sulzers ven gaskromatografibaserat metabolomikprotokoll metabolitutbyte mellan organ
Arteriovenös metabolomik för att mäta <em>in vivo</em> metabolitutbyte i brun fettvävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H.,… More

Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter