Summary
Apresentamos um método automatizado para caracterizar o módulo de elasticidade efetivo de uma lente ocular usando um teste de compressão.
Abstract
As propriedades biomecânicas da lente ocular são essenciais para sua função como elemento óptico de potência variável. Essas propriedades mudam drasticamente com a idade no cristalino humano, resultando em uma perda da visão de perto chamada presbiopia. No entanto, os mecanismos dessas alterações permanecem desconhecidos. A compressão da lente oferece um método relativamente simples para avaliar a rigidez biomecânica da lente em um sentido qualitativo e, quando associada a técnicas analíticas apropriadas, pode ajudar a quantificar as propriedades biomecânicas. Uma variedade de testes de compressão de lentes foi realizada até o momento, incluindo manual e automatizado, mas esses métodos aplicam de forma inconsistente aspectos importantes dos testes biomecânicos, como pré-condicionamento, taxas de carregamento e tempo entre as medições. Este artigo descreve um teste de compressão de lente totalmente automatizado em que um estágio motorizado é sincronizado com uma câmera para capturar a força, o deslocamento e a forma da lente através de um protocolo de carregamento pré-programado. Um módulo elástico característico pode então ser calculado a partir desses dados. Embora demonstrada aqui usando lentes suínas, a abordagem é apropriada para a compressão de lentes de qualquer espécie.
Introduction
A lente é o órgão transparente e flexível encontrado no olho que permite que ele se concentre em diferentes distâncias, alterando seu poder refrativo. Essa habilidade é conhecida como acomodação. A potência refrativa é alterada devido à contração e relaxamento do músculo ciliar. Quando o músculo ciliar se contrai, o cristalino engrossa e avança, aumentando seu poder refrativo 1,2. O aumento do poder de refração permite que a lente se concentre em objetos próximos. À medida que os seres humanos envelhecem, a lente se torna mais rígida e essa capacidade de acomodação é gradualmente perdida; Esta condição é conhecida como presbiopia. O mecanismo de enrijecimento permanece desconhecido, pelo menos em parte devido às dificuldades associadas à caracterização biomecânica do cristalino.
Uma variedade de métodos tem sido empregada para estimar a rigidez e as propriedades biomecânicas do cristalino. Estes incluem fiação do cristalino 3,4,5, métodos acústicos 6,7,8, métodos ópticos como a microscopia de Brillouin 9, indentação10,11 e compressão12,13. A compressão é a técnica experimental mais acessível, pois pode ser realizada com instrumentação simples (por exemplo, lamínulas de vidro 14,15) ou um único estágio motorizado. Mostramos anteriormente como as propriedades biomecânicas da lente podem ser rigorosamente estimadas a partir de um teste de compressão16. Esse processo é tecnicamente desafiador e requer softwares especializados não prontamente acessíveis a pesquisadores de lentes interessados em medidas de rigidez relativa. Portanto, no presente estudo, nos concentramos em métodos acessíveis para estimar o módulo de elasticidade da lente enquanto se leva em conta o tamanho da lente. O módulo de elasticidade é uma propriedade intrínseca do material relacionada à sua deformabilidade: um módulo elástico alto corresponde a um material mais rígido.
O ensaio em si é um ensaio de compressão de placa paralela e, portanto, pode ser realizado em sistemas de ensaio mecânico comerciais adequados. Aqui, um instrumento personalizado foi construído composto por um motor, estágio linear, controlador de movimento, célula de carga e amplificador. Estes foram controlados usando um software personalizado que também registrou o tempo, a posição e a carga em intervalos regulares. As lentes de porco não acomodam, mas são de fácil acesso e baratas17. O seguinte método foi desenvolvido para comprimir incrementalmente a lente ocular e quantificar seu módulo de elasticidade. Este método pode ser facilmente replicado e será útil no estudo da rigidez do cristalino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os olhos de porco foram obtidos de um matadouro local. Não foram necessárias aprovações de comitês de ética.
1. Dissecção do cristalino (Figura 1)
- Remova todo o tecido circundante dos olhos de porco e o excesso de carne da esclera, até que apenas o nervo óptico permaneça. Use pinças curvas e pequenas tesouras de dissecção para completar este processo. Use o nervo como âncora para segurar o olho durante a dissecção.
- Usando um bisturi, faça um corte circunferencial curto no limbo, depois outro no equador.
NOTA: Esta etapa é realizada nesta ordem para evitar danificar a lente e a cápsula. - Insira microtesouras no corte no limbo e remova a córnea levantando a córnea com pinças finas de ponta romba enquanto corta ao redor da circunferência da córnea.
- Remova a íris levantando usando pinças de ponta romba e corte com microtesoura.
- Insira uma tesoura de dissecção no corte equatorial e, em seguida, corte circunferencialmente ao redor de todo o equador até que a esclera seja bissectada.
- Uma vez concluído o corte, remova a porção posterior da esclera. Retire o vítreo suavemente com pinças, deixando o mínimo de resquícios para não danificar a lente. Se necessário, corte o humor vítreo coronalmente para permitir que o posterior se afaste do cristalino e do segmento anterior.
- Faça um corte meridional através da esclera de anterior para posterior usando microtesoura.
- Começando no novo corte meridional através da esclera, use microtesouras para cortar as zônulas longe da lente. Usando o peso da lente ou borda da placa de dissecção, estique suavemente as zônulas ao puxar a lente e a esclera ligeiramente afastadas, permitindo que a microtesoura corte entre a lente e o corpo ciliar, através das zônulas e ao redor da circunferência da lente. Isso isolará a lente sem danificar a cápsula da lente, se feito corretamente.
- Se desejar, remova a cápsula usando pinça para perfurar a cápsula em seu equador e, em seguida, descasque a cápsula usando duas pinças.
- Coloque a lente em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Inspecione visualmente a lente em busca de qualquer dano antes do teste mecânico.
2. Compressão da lente com/sem cápsula da lente (Figura 2)
Observação : todas as etapas aqui, com exceção das etapas 2.1 e 2.4 são controladas por computador.
- Obter ou construir um aparelho de compressão de placa paralela com uma célula de carga com capacidade de força de 50 gramas com capacidade para medir deslocamento da ordem de 1 μm.
- Programe o estágio motorizado e carregue a célula para executar o regime de carregamento descrito abaixo (por exemplo, Arquivo Suplementar 1).
- Quase encha uma caixa quadrada de 1 5/8 polegadas x 1 5/8 polegadas com PBS e coloque-a na plataforma de compressão.
- Abaixe a placa superior em contato com a placa inferior para determinar o limite inferior de movimento e a altura absoluta do vão.
- Eleve a placa superior em ~15 mm.
- Centralize a lente na caixa, tomando cuidado para que o plano equatorial seja horizontal.
- Abaixe a placa superior perto da superfície superior da lente, mas não em contato com ela.
- Inicie o movimento para mover a placa superior em contato com a lente, usando feedback de força com um limiar de contato de 3 mN.
- Iniciar o registro dos dados após a determinação do contato, tempo de registro, posição da placa superior em relação à placa inferior e força a 500 Hz.
- Aplique uma carga de pré-condicionamento onde a lente é comprimida por 2,5% de sua altura inicial três vezes, depois 5% três vezes, depois 7,5% três vezes a uma taxa de 1%/s.
- Mantenha a posição da placa superior constante por 1 min após o pré-condicionamento.
- Aplicar uma compressão de 15% a uma taxa de 1%/s, seguida de descarga na mesma taxa.
- Continue o movimento de descarga até que a placa superior tenha percorrido mais 2% da espessura da lente descarregada para longe da placa inferior para garantir que a lente seja desaderida da placa superior.
3. Estimativa do módulo de lente
- Estimar a espessura da lente com base na folga do instrumento no ponto de contato. Alternativamente, use a análise de imagem para medir a espessura de uma fotografia tirada antes do teste.
- Calcular o módulo elástico E utilizando o modelo de Hertz para compressão de uma esfera entre placas paralelas (equação [1]; Arquivo Suplementar 2).
(1º)
Onde R é o raio de curvatura no ponto de contato (assumido igual à metade da espessura da lente); F é a força de compressão relatada pela célula de carga;
é a razão de Poisson (assumida igual a 0,5 correspondente a um material incompressível); e u é a aproximação descendente do estágio superior a partir do ponto de contato. Note que o módulo elástico e a razão de Poisson são propriedades do material que indicam respectivamente a rigidez intrínseca da lente e a compressibilidade relativa da lente.
NOTA: Este método negligencia qualquer papel da cápsula da lente, mas leva aproximadamente em conta o tamanho da lente, permitindo a comparação entre espécies.
(1º)
é a razão de Poisson (assumida igual a 0,5 correspondente a um material incompressível); e u é a aproximação descendente do estágio superior a partir do ponto de contato. Note que o módulo elástico e a razão de Poisson são propriedades do material que indicam respectivamente a rigidez intrínseca da lente e a compressibilidade relativa da lente.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seis lentes porcinas foram comprimidas, primeiro com a cápsula intacta, depois após a remoção cuidadosa da cápsula. Os valores de espessura foram 7,65 ± 0,43 mm para as lentes encapsuladas e 6,69 ± 0,29 mm para as desencapsuladas (média ± desvio padrão). Um histórico de carregamento típico é mostrado na Figura 3. As curvas de força-deslocamento resultantes foram bem ajustadas pelo modelo de Hertz (i.e., apresentaram uma força proporcional ao deslocamento elevada à potência de 1,5; Gráfico 4). Isso foi verdadeiro tanto para as lentes encapsuladas quanto para as desencapsuladas.
As lentes foram primeiro comprimidas em 15% de sua espessura descarregada com uma cápsula intacta, em seguida, após a remoção da cápsula. Demonstrou-se previamente que a compressão axial de 15% da espessura inicial não causa danos às suturas do cristalino18. A descapsulação resultou em diminuição significativa do módulo elástico efetivo (n = 6; p = 0,0138; Gráfico 5).
Figura 1: Técnica de dissecção. (A) Os tecidos extraoculares são removidos. (B) Um corte circunferencial é feito no limbo. (C) Um corte circunferencial é feito no equador. (D) A córnea é removida. (E) A íris é removida. (F) O olho é bissectado no equador, então (G) o vítreo é removido, deixando (H) um anel anular contendo o cristalino, corpo ciliar e zônulas ainda presos à esclera. (I) Um corte meridional é feito através da esclera para (J) dar acesso às zônulas, (K) que são cortadas deixando (L) a lente encapsulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Aparelho de ensaio de compressão. (A) Esquemático e (B) fotografia do aparelho de compressão da lente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Histórico de carregamento aplicado para uma lente suína encapsulada. Topo: Histórico de deslocamentos. Fundo: História da força. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados típicos de deslocamento de força ajustados ao modelo de Hertz. Esquerda: Dados para uma lente suína encapsulada. Direita: Dados de compressão para a mesma lente após a descapsulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Gráfico de caixa e bigode dos módulos elásticos efetivos da lente suína encapsulada e desencapsulada. O módulo de administração efetivo das lentes encapsuladas foi significativamente maior que o das desencapsuladas (p = 0,013), indicando que a presença da cápsula pode alterar substancialmente a rigidez efetiva da lente. Os dados são para seis lentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Aplicação MATLAB para controlar o aparelho de compressão da lente. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: função MATLAB para estimar o módulo elástico a partir de dados de compressão de força. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A compressão da lente é um método versátil para estimar a rigidez da lente. Os procedimentos descritos acima permitem a comparação entre lentes de diferentes espécies e diferentes tamanhos. Todas as deformações são normalizadas em relação ao tamanho da lente, e o cálculo do módulo elástico leva aproximadamente em conta o tamanho da lente. O módulo efetivo é consideravelmente maior do que o módulo relatado anteriormente para o cristalino porcino 4,7,11,19, pelo menos em parte devido ao uso da espessura em vez do raio de curvatura: os raios polares de curvatura do cristalino porcino são significativamente maiores que a metade da espessura 20.
A análise simples (i.e., uso do modelo de Hertz) aqui apresentada tem várias limitações principais. Primeiro, não explica a presença da cápsula do cristalino. Tem sido demonstrado que a presença da cápsula pode alterar significativamente as propriedades biomecânicas do cristalino16,21. Portanto, este método é melhor aplicado a lentes desencapsuladas. Isto é particularmente importante quando se comparam espécies nos casos em que a cápsula pode ter espessuras ou propriedades biomecânicas significativamente diferentes. Este método também assume que a lente é mecanicamente homogênea; Nós e outros já demonstramos que esse geralmente não é o caso das lentes suínas ou humanas 4,5,6,10,11,22. Assim, é melhor considerar o valor do módulo elástico calculado como um módulo efetivo, que está presumivelmente relacionado com a média volumétrica do módulo espacialmente variável dentro da lente. O modelo de Hertz assume que a lente é linearmente elástica, enquanto que é conhecida por ser viscoelástica; Assim, a simples análise aqui proposta é incapaz de fornecer informações a respeito da viscoelasticidade do cristalino. Trabalhos anteriores também mostraram que o método e a duração do armazenamento da lente antes do teste podem alterar as propriedades da lente4; Todas as lentes suínas foram, portanto, testadas imediatamente após a dissecção, na chegada ao laboratório.
A diferença nas medidas de deslocamento de força é devido ao ruído do amplificador da célula de carga: a remoção da cápsula torna as medições de força consideravelmente menores e, portanto, a relação sinal-ruído é menor. Os pressupostos usados para derivar o modelo de Hertz incluem que a esfera é um material homogêneo; Portanto, o módulo elástico efetivo é, de alguma forma, a média da deformabilidade do cristalino e de sua cápsula quando a cápsula está presente. Isso torna as comparações entre espécies e entre idades particularmente difíceis porque uma lente suína tem uma cápsula de ~60 μm de espessura, enquanto uma lente de camundongo ou humana tem uma cápsula na faixa de 5-15 μm de espessura. O módulo de elasticidade da cápsula também pode variar com a espécie e a idade, embora essas dependências sejam desconhecidas. Assim, embora seja possível obter um ajuste menos ruidoso com a cápsula, a comparação é inerentemente confundida pela presença da cápsula - esta é a razão pela qual recomendamos a realização do teste sem a cápsula.
Finalmente, o módulo efetivo foi calculado assumindo que o raio de curvatura era metade da espessura da lente. Isso é verdade apenas para uma lente esférica; A lente porcina é significativamente asférica e, portanto, os valores efetivos do módulo são consideravelmente maiores do que seriam se o raio de curvatura fosse usado em seu lugar. Esta última suposição pode ser superada medindo-se os raios de curvatura, embora isso possa ser complicado para a superfície inferior, que é sempre plana devido ao contato com a placa inferior. Também é menos importante para lentes mais esféricas, como lentes murinas. Melhor ainda é o uso da análise inversa de elementos finitos para averiguar as propriedades mecânicas da lente16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Apoiado pelo National Institutes of Health grant R01 EY035278 (MR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisherbrand | 16-100-110 | |
| Galil COM Libraries | Galil Motion Control | ||
| High Precision Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-164 | |
| Linear Stage | McMaster-Carr | 6734K4 0.125" | |
| Load Cell | FUTEK | LSB200-FSH03869 | |
| Load Cell Amplifier | FUTEK | IAA300-FSH03931 | |
| MATLAB | The Mathworks, Inc. | ||
| Microprobe | Surgical Design | 22-079-740 | |
| Miniature Self Opening Precision Scissors | Excelta | 63042-004 | |
| Motion Controller | Galil Motion Control | DMC-31012 | |
| Motor | Galil Motion Control | BLM-N23-50-1000-B | |
| Straight Hemastats | Fine Science | NC9247203 | stainless steel, 14cm |
References
- Gullstrand, A. Helmholtz's treatise on physiological optics. translated edn. The Optical Society of America. , Rochester, N.Y. (1924).
- Helmholtz, H. Uber die akkommodation des auges. Arch Ophthalmol. 1, 1-74 (1855).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Reilly, M. A., Martius, P., Kumar, S., Burd, H. J., Stachs, O. The mechanical response of the porcine lens to a spinning test. Z Med Phys. 26 (2), 127-135 (2016).
- Fisher, R. F. The elastic constants of the human lens. J Physiol. 212 (1), 147-180 (1971).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Spatially mapping the elastic properties of the lens using bubble-based acoustic radiation force. IEEE Ultrasonics Symp. 1, 613-616 (2005).
- Erpelding, T. N., Hollman, K. W., O'Donnell, M. Mapping age-related elasticity changes in porcine lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 84 (2), 332-341 (2007).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. A high pulse repetition frequency ultrasound system for the ex vivo measurement of mechanical properties of crystalline lenses with laser-induced microbubbles interrogated by acoustic radiation force. Phys Med Biol. 57 (15), 4871-4884 (2012).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Weeber, H. A., Gabriele, E., Wolfgang, P.
- Reilly, M. A., Ravi, N. Microindentation of the young porcine ocular lens. J Biomech Eng. 131 (4), 044502 (2009).
- Gu, S., et al. Connexin 50 and AQP0 are essential in maintaining organization and integrity of lens fibers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (12), 4021-4032 (2019).
- Sharma, P. K., Busscher, H. J., Terwee, T., Koopmans, S. A., van Kooten, T. G. A comparative study on the viscoelastic properties of human and animal lenses. Exp Eye Res. 93 (5), 681-688 (2011).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Baradia, H., Negin, N., Adrian, G.
- Reilly, M. A., Cleaver, A. Inverse elastographic method for analyzing the ocular lens compression test. J Innov Opt Health Sci. 10 (06), 1742009 (2017).
- Hahn, J., et al. Measurement of ex vivo porcine lens shape during simulated accommodation, before and after fs-laser treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5332-5343 (2015).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Yoon, S., Aglyamov, S., Karpiouk, A., Emelianov, S. The mechanical properties of ex vivo bovine and porcine crystalline lenses: age-related changes and location-dependent variations. Ultrasound Med Biol. 39 (6), 1120-1127 (2013).
- Reilly, M. A., Hamilton, P., Gavin, P., Nathan, R. Comparison of the behavior of natural and refilled porcine lenses in a robotic lens stretcher. Exp Eye Res. 88 (3), 483-494 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Wilde, G. S., Burd, H. J., Judge, S. J. Shear modulus data for the human lens determined from a spinning lens test. Exp Eye Res. 97 (1), 36-48 (2012).
