Summary
Denne protokollen gir et systematisk rammeverk for etablering av organoider for eggstokkreft fra forskjellige sykdomsstadier og adresserer utfordringene med pasientspesifikk variabilitet for å øke utbyttet og muliggjøre robust langsiktig ekspansjon for påfølgende applikasjoner. Den inneholder detaljerte trinn for vevsbehandling, såing, justering av mediekrav og immunfluorescensfarging.
Abstract
Mens etableringen av en biobank for eggstokkreft fra pasientavledede organoider sammen med deres kliniske bakgrunnsinformasjon lover fremskritt innen forskning og pasientbehandling, er standardisering fortsatt en utfordring på grunn av heterogeniteten til denne dødelige maligniteten, kombinert med den iboende kompleksiteten til organoidteknologi. Denne tilpasningsdyktige protokollen gir et systematisk rammeverk for å realisere det fulle potensialet til eggstokkreftorganoider med tanke på en pasientspesifikk variasjon av forfedre. Ved å implementere en strukturert eksperimentell arbeidsflyt for å velge optimale kulturforhold og såingsmetoder, med parallell testing av direkte 3D-såing kontra en 2D/3D-rute, oppnår vi i de fleste tilfeller robuste langsiktige ekspanderende linjer som passer for et bredt spekter av nedstrømsapplikasjoner.
Spesielt har protokollen blitt testet og vist seg effektiv i et stort antall tilfeller (N = 120) av svært heterogent utgangsmateriale, inkludert høygradig og lavgradig eggstokkreft og stadier av sykdommen med primær debulking, tilbakevendende sykdom og post-neoadjuvant kirurgiske prøver. Innenfor et lavt Wnt, høyt BMP-eksogent signalmiljø observerte vi at forfedre var forskjellig utsatt for aktiveringen av Heregulin 1 ß (HERß-1)-banen, med HERß-1 som fremmer organoiddannelse hos noen mens de hemmer den i andre. For en undergruppe av pasientens prøver nødvendiggjør optimal organoiddannelse og langsiktig vekst tilsetning av fibroblastvekstfaktor 10 og R-Spondin 1 til mediet.
Videre fremhever vi de kritiske trinnene i vevsfordøyelse og stamisolering og peker på eksempler der kort dyrking i 2D på plast er gunstig for etterfølgende organoiddannelse i Basement Membrane Extract type 2-matrisen. Samlet sett krever optimal biobanking systematisk testing av alle hovedforhold parallelt for å identifisere et tilstrekkelig vekstmiljø for individuelle linjer. Protokollen beskriver også håndteringsprosedyren for effektiv innebygging, seksjonering og farging for å oppnå høyoppløselige bilder av organoider, noe som kreves for omfattende fenotyping.
Introduction
Klinisk behandling av pasienter med epitelial eggstokkreft er fortsatt utfordrende på grunn av sin heterogene kliniske presentasjon i avanserte stadier og høye tilbakefallsrater1. Forbedring av vår forståelse av eggstokkreftutvikling og biologisk atferd krever forskningsmetoder som adresserer pasientspesifikk variabilitet i løpet av sykdommen, behandlingsrespons og histopatologiske samt molekylære egenskaper2.
Biobanking, karakterisert ved systematisk innsamling og langtidsbevaring av tumorprøver avledet fra eggstokkreftpasienter sammen med deres kliniske informasjon, gir bevaring av en stor pasientkohort i forskjellige sykdomsstadier, inkludert tumorprøver fra primære debulkingoperasjoner, etter neoadjuvant kjemoterapi og fra tilbakevendende sykdom. Det har verdifullt potensial for å fremme kreftforskning, og tjene som en ressurs for lovende prognostiske biomarkører og terapeutiske mål3. Imidlertid er konvensjonelle biobankmetoder, som formalinfiksering og frysing, ikke egnet til å gjennomføre funksjonelle studier på de opprinnelige tumorprøvene på grunn av tap av levedyktighet og forstyrrelsen av den opprinnelige tredimensjonale vevsarkitekturen 4,5.
Studier av molekylære mekanismer, i onkologi og utover, er avgjørende avhengig av bruk av passende eksperimentelle modeller som trofast reflekterer sykdommens biologi og opprettholder in vitro-egenskapene til vevet observert in vivo. Pasientavledede organoider, basert på bevaring av fornyelsespotensialet, reproduserer i laboratoriet epitelets opprinnelige struktur og funksjon og tillater testing i en pasientspesifikk sammenheng. Derfor har de dukket opp som svært lovende verktøy for kreftforskning og personlig medisin, og bygger bro over gapet mellom klinisk mangfold og laboratorieforskning 6,7,8,9. Skreddersydde terapeutiske strategier basert på individuelle legemiddelresponser av organoide linjer og testing av den funksjonelle relevansen av molekylære profiler, kan potensielt brukes direkte til pasientbehandling10,11. Muligheten for langtidsdyrking, inkludert pasientspesifikke egenskaper og innsamling av relevante prospektive kliniske data over tid, lover godt å identifisere nye prognostiske og prediktive faktorer involvert i sykdomsprogresjon og resistensmekanismer 3,9.
Ikke desto mindre krever bygging av en biobank som inkluderer organoider fra forskjellige tumorprøver en kombinasjon av streng overholdelse av kompleks metodikk og oppsett av protokoller for enkelt vedlikehold12. Prosessstandardisering sikrer at biobanken kan etableres og vedlikeholdes effektivt av utdannet personale selv ved høy omsetning, samtidig som de overholder de høyeste kvalitetsstandarder13. Flere studier rapporterte vellykket generering av stabile organoidlinjer for eggstokkreft som tilsvarer den mutasjons- og fenotypiske profilen til den opprinnelige svulsten med varierende effektivitetshastigheter. Likevel er rutinemessig biobank fortsatt utfordrende i praksis, spesielt for langsiktig stabil vekst av linjer, noe som er en forutsetning for storskala utvidelse eller vellykket genomisk redigering.
Spesielt er spørsmålet om utvidelsesmuligheter vagt definert i feltet, da organoider som viser langsomt og begrenset vekstpotensial av og til regnes som etablerte linjer. Som først demonstrert av Hoffmann et al., en studie hvis hovedfunn ga grunnlaget for denne videreutviklede protokollen, krever optimal håndtering av eggstokkreftvev en unik strategi for å imøtekomme heterogenitet14. Fenotypisk karakterisering av organoider oppnådd ved denne metoden og nær likhet med foreldretumorvev ble bekreftet ved panel-DNA-sekvensering og transkriptomikkanalyse av modne kulturer (4-10 måneders dyrking) som demonstrerte stabiliteten til modellen 8,9,12,14.
I motsetning til det parakrine miljøet som regulerer homeostasen i de sunne egglederne, er epitellaget, som sannsynligvis gir høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC), kreftregenereringspotensial og organoiddannelseskapasitet, mindre avhengig av eksogent Wnt-tilskudd. Videre viste aktiv Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering, karakterisert ved fravær av Noggin i organoid medium, seg å være gunstig for etablering av langsiktige kulturer fra eggstokkreft faste vevsavsetninger14,15. Under systematisk biobanking av faste forekomster av eggstokkreft har vi bekreftet disse funnene og satt opp rørledningen, med detaljer skissert i denne protokollen som sikrer vedvarende langsiktig ekspansjon i de fleste tilfeller. Vi finner at parallell testing av forskjellige mediesammensetninger og såmodaliteter ved arbeid med primærisolater er avgjørende for å forbedre etableringen av langsiktige stabile organoidlinjer og for å øke utbyttet som muliggjør robust forplantning og utvidelse til flerbrønnsformater som kreves for nedstrøms eksperimenter16.
Videre er renheten og kvaliteten på prøvene som samles inn under operasjonen av avgjørende betydning for translasjonspotensialet til eggstokkreftorganoider i grunnforskning og molekylær diagnostikk. Kompleksiteten i den kliniske presentasjonen av HGSOC krever nært samarbeid mellom kirurger, onkologer og forskerne i laboratoriet for å sikre at relevant materiale er korrekt identifisert, transportforholdene holdes konstante og organoidlinjer genereres med høy effektivitet som representerer de viktigste egenskapene til sykdommen til hver pasient. Denne protokollen gir et standardisert, men tilpasningsdyktig rammeverk for å fange det fulle potensialet til eggstokkreftorganoider, med tanke på heterogeniteten som karakteriserer eggstokkreft16,17. Spesielt muliggjør denne protokollen pålitelig biobanking av det brede spekteret av klinisk presentasjon av eggstokkreft, inkludert forskjellige histologiske typer (høygradig og lavgradig eggstokkreft, LGSOC), forskjellige forekomster fra de samme pasientene som viser forskjeller i stamhetsregulering, vev fra operasjoner i post-neoadjuvant setting, biopsimateriale og prøver fra operasjoner i den tilbakevendende fasen av sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumorvevsprøver fra eggstokkreftoperasjoner ble samlet inn og pasientavledede organoider ble generert i samsvar med etikkomiteen ved LMU University (17-471), i samsvar med eksisterende gjeldende EU, nasjonale og lokale forskrifter. Hver pasient som er involvert i studien, har samtykket i skriftlig form. Ved arbeid med ferske vevsprøver kreves Biosafety Level 2 sikkerhetstillatelse og Laminar Flow-skap. Gitt vevsprøvenes potensielt smittsomme karakter, som ikke kan utelukkes på grunn av mangel på rutinemessig testing av relevante smittsomme sykdommer, er det nødvendig å sikre at institusjonelle biosikkerhetsforskrifter overholdes strengt og at tilstrekkelig personlig verneutstyr er tilgjengelig for personellet som utfører forsøkene.
1. Forberedelser
- Middels forberedelse
- Forbered 2D- og 3D-mediene på nytt én gang i uken og oppbevar dem ved 4 °C.
MERK: Den nøyaktige sammensetningen av ingrediensene for hvert medium er oppført i tabell 1. Både eggstokkreft medium 1 (OCM1) og OCM2 kan i tillegg suppleres med HER1ß (endelig konsentrasjon: 50 ng / ml), noe som resulterer i fire forskjellige forhold: OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß. - Lag stamløsninger av vekstfaktorreagensene og hold dem ved 20 °C og A83-01 og nikotinamid (lagring ved +4 °C). På grunn av temperaturfølsomheten til vekstfaktorene, bruk tinte stamløsninger umiddelbart for middels forberedelse og unngå gjentatte tinesykluser ved å lage alikoter.
MERK: Medieforberedelse er et kritisk skritt som må kontrolleres strengt. - Fremstilling av RSPO-1 betinget medium
- Tine HA-R-Spondin1-Fc 293 T-celler (oppbevaring ved -80 °C) raskt ved 37 °C. Vask dem med 10 ml basalkulturmedium, supplert med 10% føtal kalveserum (FCS), heretter kalt basalkulturmedium++.
- Resuspender cellepelleten i 12 ml basalkulturmedium++ og frø den i en T75-kolbe.
- Del cellene i forholdet 1:6 med et dissosiasjonsreagens som inneholder trypsin (4 min ved 37 °C) når cellene når samløp. Frø dem inn i en ny T75-kolbe.
- Neste dag, tilsett phleomycin D1 (1,25 μL / ml) til mediet.
- Del cellene i et forhold på 1:20 med trypsin (4 min ved 37 °C) når cellene når samløp. Frø cellene til flere T75-kolber (antall kolber i henhold til det målrettede endelige volumet) i 30 ml basalkulturmedium++ (inneholdende 10 % FCS) supplert med fleomycin D1.
- Start den kondisjonerte medieproduksjonen når cellene når ca. 50% av samløpet: erstatt mediet med 40 ml basalkulturmedium supplert med 5% FCS uten fleomycin D1.
- Samle den første supernatanten etter 3 dager. For å fjerne rusk, sentrifuge i 10 min ved 1,200 × g. Oppbevar supernatanten i en steril beholder ved 4 °C.
- Legg til nytt basalkulturmedium supplert med 5% FCS til cellene. Samle den andre supernatanten etter 3-4 dager. Sentrifuge i 10 min ved 1,200 × g. Legg den andre supernatanten til den første supernatanten.
- Sil det kondisjonerte mediet ved å bruke et 0,2 μm flasketoppfilter.
- For kvalitetskontroll og RSPO1-kvantifisering, legg det produserte mediet til en 293T-cellelinje (293T WntR, 7xTcf-eGFP)14, stabilt transdusert med GFP-plasmid som bærer Wnt reporter18.
MERK: Avhengig av mengden og intensiteten av GFP-signalet, blir aktiviteten til RSPO1 som en agonist av Wnt-banen testet ved kvantifisering av Wnt-reportercellelinjen. - Oppbevar alikoter på 15 ml til umiddelbar bruk (innen 1 uke) ved 4 °C. For lengre oppbevaring (6 måneder) skal det kondisjonerte mediet holdes ved -20 °C.
- Forbered 2D- og 3D-mediene på nytt én gang i uken og oppbevar dem ved 4 °C.
2. Oppstart av en organoidkultur for eggstokkreft
- Primær vevsisolasjon
- Transporter friskt og levedyktig vev, helst umiddelbart etter operasjonen, og utfør isolasjon innen maksimalt 20 timer etter innsamling. Sørg for forsvarlig transporttilstand i vevets oppsamlingsmedium med en transportboks utstyrt med kjølepakninger ved ca. 4 °C.
- I laboratoriet må du forberede nødvendige reagenser og utstyr for å lette rettidig prøvebehandling:
- Tine kjellermembranekstrakt type II matrise (BME 2 matrise) på is (ca. 2 timer).
- Forbered engangsskalpeller, steriliserte disseksjonsverktøy (saks og pinsett) og filterinnsatser på 400 μm for 50 ml rør.
- Klargjør en beholder med en liten mengde flytende nitrogen for snapfrysing og et forvarmet vannbad ved 37 °C.
MERK: Arbeid i en cellekultur laminær flow hette.
- Vask det ferske vevet i en petriskål grundig i fosfatbufret saltvann (PBS) (uten Ca++ og Mg++). Inne i petriskålen, fragmenter vevet ved hjelp av engangsskalpeller og / eller saks i små, 3-5 mm store biter.
- Separat det oppnådde vevet i tre seksjoner for følgende formål:
- Samle vev i kryogene rør. Overfør kryogene rør til den forberedte beholderen fylt med flytende nitrogen for sjokkfrysing.
- Samle vev (2-3 mm) i en histologisk prøvebeholder fylt med formalin for fiksering (24 timer) og legg dem i parafin for fargingformål 19,20.
- Videre homogeniser vevet før enzymatisk fordøyelse. Maksimer den mekaniske dissosiasjonen med en skalpell og overfør den til et 50 ml vevrør.
MERK: Pass på at vevet alltid er gjennomvåt i PBS under homogenisering for å unngå uttørking av vevet.
- Kombiner det homogeniserte vevet med en fordøyelsesblanding som inneholder PBS (uten Ca++ og Mg++), kollagenase I (stamløsning 5 U/μL, endelig konsentrasjon 1 U/μL) og en selektiv ROCK1- og 2-hemmer (3 μM sluttkonsentrasjon) (komponenter listet opp i tabell 1). Bruk 15 ml fordøyelsesblanding i et 50 ml rør for hver 2 cm3 av svulsten.
MERK: Begrenset materiale (f.eks. Biopsiprøver) krever bare små mengder (ca. 2-3 ml) fordøyelsesblanding for å sikre enzymatisk dissosiasjon. - For enzymatisk dissosiasjon, inkuber røret i 1,5 time i et vannbad ved 37 °C. Utfør sporadisk og kraftig vortexing (omtrent hvert 20. minutt i 10-15 s) for å støtte mekanisk dissosiasjon.
- Etter inkubering, tilsett 15 ml kaldt basalkulturmedium ++ til røret. Sentrifuge 5 min ved 300 × g.
- Etter å ha fjernet supernatanten, tilsett 5 ml nytt basaldyrkningsmedium++. Sil cellesuspensjonen ved å bruke et 400 μm filter til et nytt 50 ml rør.
- Sentrifuge i 5 min ved 300 × g. Fjern supernatanten og behold cellepelleten.
- For fjerning av erytrocytter, tilsett 5 ml Red Blood Blood Lysing (RBC) buffer til cellepelleten. Bløt i vannbad i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 5 ml basalkulturmedium++ for lysisinaktivering. Sentrifuge i 5 min ved 300 × g. Tilsett 3 ml basalkulturmedium++ til cellepelleten.
- Tell levedyktige celler etter 1:1-fortynning med trypanblå flekkløsning (f.eks. 10 μL av prøven + 10 μL trypanblå flekkløsning) i en automatisk celleteller eller manuelt i et Neubauer-kammer.
- Beregn antall celler som trengs for direkte 3D-såing. For hver tumoravsetning, frø i en 48-brønns formatplate minst 2-3 brønner per eggstokkreftmedium, noe som tilsvarer totalt 8-12 brønner i en såmatrise (OCM1, OCM1 + HER1ß, OCM2, OCM2 + HER1ß). Beregn 30.000 celler for hver brønn i en dråpe på 25 μL BME Type 2 matrise. Velg eventuelt et 24-brønnsformat med 50 μL BME 2-matrise og 50 000 sådde celler per brønn.
- Frø de resterende cellene i 2D (se trinn 2.1.13).
- Pipett mengden basalkulturmedium++ suspensjon som inneholder totalt antall nødvendige celler i et nytt rør og sentrifuge i 5 minutter ved 300 × g. Fjern supernatanten og behold cellepelleten.
- På isen, tilsett den totale mengden kald BME 2-matrise (25 μL for hver brønn i en 48-brønnformatplate; dermed 100 μL for 4 brønner) til pelleten og bland godt for å oppnå en jevn fordeling av celler per brønn ved forsiktig å pipetere pelleten opp og ned uten å skape bobler.
- Frø cellene i dråper av BME 2-matrise (25 μL) til den forvarmede, tomme 48-brønnplaten. For å oppnå jevn fordeling mellom brønnene, flytt pipetten forsiktig og sakte opp og ned (3-4x) inne i røret før overføring av BME 2-matriksdråpen til hver brønn for å forhindre celleutfelling under distribusjon.
- Etter å ha inkubert platen ved 37 °C i minst 30 minutter for å konsolidere dråpene i BME 2-matrisen, pipett 250 μL av hvert av de fire eggstokkreftmediene (OCM1, OCM1+HER1ß, OCM2, OCM2+HER1ß) i de tilsvarende brønnene.
- Parallelt med den direkte 3D-såingsprosedyren, bevar du de gjenværende isolerte cellene ved å starte en 2D-kultur.
- Etter sentrifugering i 5 minutter ved 300 × g, tilsett pelleten til 2D-mediet. Velg format (T75-kolbe eller T25-kolbe), avhengig av antall celler som er tilgjengelige etter 3D-såing.
- Inkuber kolben i 3-5 dager ved 37 °C for celleadhesjon. Hold samme medium de første 72 timene.
- Når cellene når samløp, overfør kulturen til BME 2-matrisen. Ikke utvid primærisolater i 2D-kultur ved å splitte, da langsiktig forplantning på 2D er skadelig for stammepotensialet.
- Overgang fra 2D-kultur til 3D-kultur
- I T75- eller T25-kolben vasker du monolaget 2x med 5 ml PBS for å løsne cellene fra bunnoverflaten. Inkuber med 1 ml trypsin i 10 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 5 ml kaldt basalkulturmedium++ for inaktivering av dissosiasjonsreagenset. Sentrifuge i 5 min ved 300 × g.
- Tilsett 3 ml basaldyrkningsmedium++ til pelleten. Tell cellene som beskrevet i trinn 2.1.12-2.1.13. Frø for de ulike mediesammensetningene (se figur 1) som beskrevet i trinn 2.1.16-2.1.18.
- Evaluering av organoid vekst
- Avbilde brønnene minst en gang i uken for å dokumentere organoid vekst. Lag høykvalitets sammenlignbare bilder av 2D / 3D-kultur og direkte såplater ved fasekontrastmikroskop. Ta vare på konsistens i forstørrelse og bruk 4x for oversikt over brønnene (kvantifisering) og 10x og 20x for å dokumentere morfologien til organoider.
- Organiser lagring av bilder i mapper dedikert til individuelle linjer.
- Velg den beste organoidlinjen for langtidsdyrking ved komparativ vurdering av organoiddannelse ved de forskjellige såmodalitetene (2D etterfulgt av 3D-såing versus direkte 3D-såing) og forskjellige mediesammensetninger (OCM1, OCM1+ HER1ß, OCM2 og OCM2+ HER1ß).
- I gjennomsnitt, 14-21 dager etter isolering, evaluere organoiddannende potensial (mengde) samt størrelsen og cellulær fenotype av organoider dyrket under forskjellige forhold. Se etter følgende funksjoner: fravær av vakuoler, membranblebbing eller tap av vedheft og avrunding av celler.
3. Langsiktig organoiddyrking
- Organoid passasje
- Unngå å splitte organoider for ofte og i proliferativ fase. Utfør mekaniske og enzymatiske fordøyelsesprosedyrer med intervaller på mer enn 10 dager.
- For å forstyrre hver BME 2-matriksdråpe, legg til 250 μL (48-brønnformat) eller 500 μL (24-brønnformat) iskaldt basalkulturmedium ++. Sørg for fullstendig oppløsning av dråpen og pipetten periodisk opp og ned og skrap bunnen av platen. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og legg den på is. Tilsett 1 ml iskald basalkultur medium++.
MERK: Fjerningseffektiviteten til BME 2-matrisen avhenger sterkt av middeltemperaturen, siden den beste oppløsningen oppnås under 4 °C. - Basseng 2-3 teknisk replikere brønner for jevn utvidelse. Sentrifuge i 5 min ved 300 × g. Inspiser innholdet i suspensjonen mot lyskilden for å se om BME 2 gel fortsatt er synlig. Fjern supernatanten og gjenta vasken med et iskaldt medium hvis BME 2-matrisen fortsatt er synlig.
- Inkuber med 1 ml trypsin (oppbevares ved 20-25 °C) i vannbad ved 37 °C i 7-10 minutter. Vortex sporadisk i 10 s for å forbedre dissosiasjon. Inspiser røret med jevne mellomrom visuelt for å se om dissosiasjon utvikler seg.
- Trekk cellesuspensjonen opp og ned med en sprøyte gjennom en nål med en størrelse fra 23 G til 27 G. Sjekk om store celleklumper fortsatt er tilstede, og gjenta prosedyren om nødvendig.
MERK: Fragmentering gjennom en sprøyte er valgfritt, og nålstørrelsen avhenger av den nødvendige dissosiasjonseffekten. En homogen cellesuspensjon fører til jevn fordeling mellom brønnene. - Tilsett 1 ml kaldt basalkulturmedium++ for å inaktivere reaksjonen.
- VALGFRITT: Tell cellene som beskrevet i trinn 2.1.12-2.1.13 og bestem delingsforholdet til foreldrepassasjen (f.eks. 1:3-brønner).
- Sentrifuge i 5 min ved 300 × g. Fjern supernatanten.
- Utfør såing som beskrevet i trinn 2.1.16-2.1.18 og bruk det respektive optimale eggstokkreftorganoidmediet i henhold til den allerede etablerte langsiktige kulturen. Bytt eggstokkreft medium hver 3-4 dager.
- Ved forstyrrelse av BME 2-matriksdråpen under middels endring, bør du vurdere reseeding uten enzymatisk fordøyelse. For å unngå forstyrrelse av dråpen, utfør forsiktig mediumendringsprosedyren uten direkte pipettering på BME 2-matriksdråpen. I tillegg bør du unngå å etterlate en overdreven mengde gjenværende basalkulturmedium++ på pelleten før fortynning med BME 2-matriksen i trinn 2.1.16, da det kan påvirke dråpenes skjørhet.
- Kryopreservering av organoider
MERK: Utfør kryopreservering av organoider under proliferasjonsfasen i den første uken etter passering.- Forstyrr BME 2-matriksdråpen med iskaldt basalkulturmedium++ i henhold til trinn 3.1.2. Etter sentrifugering og kassering av supernatanten som beskrevet i trinn 3.1.3., arbeid på is og resuspender cellepelleten i 1 ml iskaldt kryopreserveringsmedium. Overfør cellesuspensjonen til forhåndsmerkede 1,8 ml kryogene rør.
- Oppbevar tubene i en forkjølt isopropylalkoholholdig frysebeholder og plasser dem ved -80 °C over natten.
- Hold stambeholderne ved -80 °C i maksimalt 2 måneder. Overfør til flytende nitrogen for langsiktig stabil lagring.
- Tining av organoide bestander
- Forvarm 9 ml basaldyrkningsmedium++ i et vannbad på 37 °C i et merket 15 ml rør.
- Overfør ønsket hetteglass fra oppbevaring ved -80 °C eller til flytende nitrogen til en transportbeholder fylt med flytende nitrogen.
- Overfør kryorøret til et vannbad ved 37 °C og beveg det forsiktig til det frosne materialet nær rørveggene begynner å tine.
- Fordel organoidsuspensjonen langsomt inn i det merkede røret fylt med 9 ml medium. Rist forsiktig røret. Sentrifuge i 5 minutter ved 300 × g og fjern supernatanten.
- Utfør såing som beskrevet i trinn 2.1.16-2.1.18 og bruk det respektive optimale eggstokkreftorganoidmediet i henhold til de allerede bestemte langsiktige kulturbetingelsene for den enkelte linje.
- Fiksering av organoider
- Utfør organoidinnsamling som beskrevet i trinn 3.1.2-3.1.3.
- Tilsett 3 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (pH 7,4) og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask 2x med 5 ml PBS, sentrifuge i 3 minutter ved 300 × g, og fjern supernatanten. Tilsett 4 ml fersk PBS i pelleten og hold den ved 4 °C til den legges ut.
MERK: Faste organoider er stabile og lagring ved 4 °C er mulig i 1 måned før innebygging. - Varm den histologiske gelen (oppbevart ved -20 °C) ved 65 °C til den er flytende.
- Oppdag de faste organoider avgjort og synlig på bunnen av røret. Fjern supernatanten. I tilfelle av forstyrret cellepellet, utfør sentrifugering i 3 minutter ved 300 × g og kast supernatanten PBS.
- Stopp pelleten i 100 μL varm gel ved å pipettere forsiktig opp og ned. Overfør dråpen til et stykke tetningsfilm og la størkning skje etter ~15 min ved romtemperatur.
- Flytt den faste geldråpen til vevsparafinkassetten. Gjennomfør standard protokoller for innebygging av vev 19,20.
- Skjær 5-10 μm tykke skiver med et mikroseksjonerende skjæreverktøy. Overfør kuttene til histologi lysbilder. Tørk lysbildene i 1 time ved 65 °C; Hold dem på et tørt sted.
- Immunfluorescensfarging av organoidsnitt
- Flytt de forberedte lysbildene gjennom glassbrett med følgende fortynningsserie: 2 x 15 min clearingmiddel for histologi; 15 min 100% etanol; 1 min 100% etanol; 10 min 96% etanol; 5 min 70% etanol; 5 min 50% etanol.
- Legg til PBS og hold 5 min på shakeren ved 100 o / min. Gjenta vaskingen 2x.
- Legg antigen henting løsning (Tris (hydroxymethyl) aminometan-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)-buffer [pH 9,0] eller citrat [pH 6,0]) til lysbildene som er plassert i det termostabile kammeret. I en dampbåt, hold beholderen med lysbildene i 30 minutter, etterfulgt av avkjøl til romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Overfør kammeret som inneholder lysbildene i 15 minutter til 1% permeabiliseringsvaskemiddelløsning (i PBS).
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Kontur plasseringen av organoider på lysbildene med en immunostaining vokspenn for å opprettholde dråpen under følgende trinn.
- Legg på hvert lysbilde 100 μL 10% serum i et fortynningsmedium, avhengig av arten av det sekundære antistoffet.
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Fortynn de primære antistoffene i et medium, noe som fører til et endelig volum på 100 μL. Oppbevares ved 4 °C i minst 16 timer i et inkubasjonsbrett / fuktighetskammer.
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Fortynn de sekundære antistoffene i et medium, noe som fører til 100 μL dråper, og hold i 2 timer ved romtemperatur i en inkubasjonsbrett.
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Legg til kjernefysisk motflekkløsning DAPI (4',6-Diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid) fortynnet i et fortynningsmedium 1:1,000. Oppbevares i 10 min ved romtemperatur for inkubering.
- Gjenta trinn 3.5.2.
- Legg monteringsmedium og deksel med dekselet. Fest lysbildene med gjennomsiktig neglelakk når de er tørre (omtrent etter 8-12 timer).
- Bilde med et konfokalmikroskop eller annet fluorescensmikroskop. Lag oversiktsbilder samt detaljerte bilder av subcellulære strukturer som fanger de viktigste egenskapene til organoid morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter innledende vevsdissosiasjon, filtrering og telling blir celler sådd parallelt direkte i 3D-format, som forklart ovenfor, samt suspensjonen i kolben for kort 2D-utvidelse. I noen tilfeller påvirker den forbigående 2D-ekspansjonen organoiddannelsen positivt, og langtidslinjen er vellykket etablert via denne ruten, mens komparativ parallell 3D-såing kan resultere i vekstarrest (figur 1). For hvert donorvev som behandles, testes cellene i henhold til mediematrisen. Etter denne strategien inneholder vår biobank nå linjer som er representative for hver standard veksttilstand som vist i figur 2. Ved streng implementering av denne miniscreeningplattformen for testing av forskjellige medier og såmoduser, har vi vellykket generert organoidlinjer fra forskjellige histologiske typer og stadier av sykdomsutvikling av eggstokkreft (figur 3) av primære høygradige serøse, postneoadjuvante intervalloperasjoner og fra tilbakevendende sykdom. Fenotypisk karakterisering av organoidlinjene ved immunfluorescensfarging av hovedmarkører sammenlignet med foreldrevev viser på en overbevisende måte at kjennetegn ved epiteltumorrom er bevart i organoidmodellen: epitelarkitektur og adhesjon markert med (EpCAM), avstamningsidentitet (PAX8) og typisk TP53-punktmutasjon karakteristisk for HGSOC som fører til akkumulering i kjernen (figur 4).
Noen viktige metodiske punkter må også vurderes for effektiv beslutningstaking under organisk biobanking. Organoid vekstpotensial bestemmes ikke bare av økningen i organoid diameter. I tillegg bestemmer fenotypiske egenskaper ekspansjonspotensialer som farge, mørke og konturintegritet. Dannelsen av cytoplasmatiske stressvakuoler indikerer suboptimale forhold. Innledende problemer med hensyn til vekst og organoiddannende potensial kan oppstå på grunn av uhensiktsmessige transportforhold og forsinkelse av vevsprosesjon. Siden en høy interindividuell variasjon i ekspansjonspotensial observeres innenfor tumorlinjene, anbefaler vi å vente minst 14 dager før du tar en endelig beslutning om vekstpotensialet. Hvis lignende vekstmønstre innledningsvis observeres i forskjellige medier, bør flere forhold utvides. Fra vår erfaring er et klart skille mellom langsiktig stabilt vekstpotensial ofte bare mulig etter dyrking på flere uker eller måneder.
Figur 1: Fordeler med kortvarig såing i 2D av primærisolater for etterfølgende organoidgenerering. (A) Skjema for eksperimentell layout som viser toveis, parallell såingsstrategi: 2D / 3D, og direkte 3D-såing i fire forskjellige medier. (B) Bilde av adherente primærisolater før trypsinisering og 3D-overføring. (C) Et eksempel på den primære forekomsten der parallellsåing avslørte den klare fordelen med 2D / 3D-ruten da langsiktig organoidutvidelse bare var mulig fra forfedre som opprinnelig var isolert på plast. Bildet øverst til venstre viser en 3D-kultur 7 dager etter isolasjon ved passasje 0 (referert til som P0) med utilstrekkelig organoiddannelse etter første passasje (referert til som P1) på bildet nederst til venstre. Etter 2D-såing på plast (se figur 1B) etterfulgt av overføring til en 3D-kultur, er en bedre organoidforming allerede tydelig ved P0, mens langsiktig ekspansjonspotensial er bekreftet ved passasje 4 (P4). Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Pasientspesifikt mediumbehov. Eksempler på fire forskjellige langsiktige stabile utvidede linjer som hver vokser i et annet medium. Skala bar = 500 μm. Forkortelser: OCM = eggstokkreft medium; her = heregulin 1β; HGSO = høygradig serøs eggstokkreft. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Organoid generering fra alle stadier av sykdommen. Bilder av langvarige stabile ekspanderende linjer, fra høygradig serøs og lavgradig serøs eggstokkreft i primær sykdomspresentasjon, fra intervallkirurgi (post neoadjuvant kjemoterapi) og fra residiverende kreftvev. Skala bar = 500 μm. Forkortelser: HGSOC = høyverdig serøs eggstokkreft; LGSOC = lavgradig serøs eggstokkreft; NACT = neoadjuvant kjemoterapi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Nærmatch av fenotype av organoider og foreldrekreftvev. Konfokale bilder av immunfluorescensfarging av (A) kreftvev og (B) paret organoidlinje viser svært høy likhet i fargemønster og ekspresjonsnivå for alle markører, EpCAM (grønn), PAX8 (rød), TP53 (magenta). Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av mediet og fordøyelsesblandingen brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den designede protokollen adresserer tidligere utfordringer med ovariecancer organoid biobanking med hensyn til organoiddannelse og langsiktig passasjepotensial og sikrer generering av fullt utvidbare linjer fra flertallet av faste tumoravsetninger. Den kirurgiske innsamlingsprosessen av tumorprøver som skal brukes til organoidgenerering, påvirker utbyttet og ekspansjonspotensialet betydelig. Tumorvevsprøver kan oppnås under ulike prosedyrer, inkludert multivisceral kirurgi, diagnostisk laparoskopi eller biopsi. Den erfarne gyneko-onkologiske kirurgen bør prioritere å skaffe rene tumorprøver fra peritoneale steder. Spesielt har det blitt observert at makroskopisk nekrotiske områder i store tumoravsetninger er mindre egnet for vellykket generering av organoidkulturer. Siden prøverenhet er avgjørende for å reflektere molekylære og fenotypiske egenskaper for nedstrøms applikasjoner, er synkronisert innsats fra både kliniske og laboratorieteam nødvendig for optimal biobanking, slik at linjene opprettes fra de mest relevante områdene av svulsten.
Selv om denne protokollen dekker variasjoner i vekstfaktoravhengigheter som vi har observert i løpet av 2 år med biobanking, er det klart at ytterligere forbedring er berettiget til å øke effekten ytterligere, da vi fortsatt ikke observerte noen organoid vekst i 20% av tilfellene, og antall linjer som viste begrenset ekspansjonspotensial antydet suboptimal vedlikehold av stammen. Selv om vår organoidbiobank for tiden bare inneholder eggstokkreftprøver av serøs histologi (HGSOC og LGSOC), viste vår erfaring med prøver fra forskjellige epitelial eggstokkrefthistologier før det strukturerte biobankprogrammet sammenlignbare suksessrater uten spesifikke forskjeller. Spesielt deler flertallet av epitelial eggstokkreft subtyper en lignende kolonne pseudostratifisert morfologi med vev som utviklet seg fra Mullerian-kanalen (eggleder, livmor, livmoderhals), mens i kontrast stammer selve eggstokkepitelet utviklingsmessig fra kjønnsryggen og mesonephros, som er dekket med et enkelt lag kuboidalt epitel. Siden utviklingsveier som regulerer epitelial homeostase har en sentral rolle i kontrollen av potensialet til voksne stamceller, bør forskjellene i embryonal opprinnelse tas i betraktning ved utvikling av protokoller for biobank av organoider. Dermed tror vi at forfedre fra overflaten av eggstokken sannsynligvis krever organspesifikke kulturforhold for å opprettholde langsiktig stabil vekst.
Spesielt i vårt laboratorium har protokollen vist seg å være vellykket også for post-neoadjuvant eggstokkreftprøver, selv om neoadjuvant kjemoterapi påvirker cellens levedyktighet og vevsfenotype. Disse prøvene viser mer rusk og ekstracellulære vevsaggregater sammenlignet med prøver som stammer fra kjemoterapi-naivt vev av primære debulkingoperasjoner som kan påvirke organoiddannelsespotensialet. I disse tilfellene erfarte vi at passende mengde operasjonsvev og streng etterlevelse av anbefalte transportbetingelser er avgjørende for vellykket organoidgenerering, da de postneoadjuvante prøvene kunne være mer sensitive.
Et veldig interessant fenomen av den gunstige effekten av kort ekspansjon på plast i 2D av ferskt isolerte forfedre på etterfølgende organoidvekst, som vi gjentatte ganger har observert og derfor inkludert i den standardiserte eksperimentelle prosedyren, er et viktig tillegg til metodikken til kreftorganoider forskningsfelt, som i stor grad er avhengig av direkte såingsstrategier. Det er fristende å spekulere på om sensitiviteten til forfedrene etter enzymatisk fordøyelse og vekstfaktorenes evne til å prime dem tilstrekkelig kan være de underliggende mekanismene bak denne forskjellen, som i noen tilfeller er en avgjørende faktor hvis linjen kan etableres. Imidlertid er det behov for mer forskning for å etablere klare avhengigheter.
For å møte utfordringene med høy celleadhesjon og funksjonelle kryss i 3D-eggstokkreftorganoider, som er vanskelige å fordøye, kan en kombinasjon av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon med nål og sprøyte hjelpe når store klumper forblir etter trypsinisering. Eksperimentering med forskjellige enzymatiske forhold kan føre til ytterligere forbedringer.
Etter langvarig lagring kan organoide linjer tines og bringes inn i kultur i henhold til eksperimentell design og brukes til etterfølgende applikasjoner. Dette gir når som helst tilgang til allerede genererte organoidlinjer for spesifikke forskningsformål og er spesielt interessant for å undersøke den langsiktige oppførselen til visse linjer i lys av pasientens sykdomsprogresjon. Imidlertid er kryopreservering av eggstokkreftorganoider fortsatt en utfordring. Temperaturvariasjoner under fryse- og tinesykluser kan påvirke organoidens levedyktighet, funksjonalitet og ekspansjonspotensial negativt. Langtidslagring er mer stabil i flytende nitrogen, hvor svært lave temperaturer minimerer risikoen for nedbrytning slik at organoidernes integritet kan opprettholdes. Imidlertid er kontinuerlig optimalisering berettiget til å etablere konsistente prosedyrer for frysing, lagring og tining, for å forbedre disse prosessene ytterligere.
Til tross for de nevnte utestående problemene, demonstrerer denne protokollen kapasiteten til konsekvent å generere stabile organoidlinjer fra solide tumorprøver av pasienter med eggstokkreft. I vårt laboratorium behandlet vi hittil 120 primære eggstokkreftvevsprøver som oppnådde suksess i omtrent 50% av tilfellene, inkludert et bredt spekter av histologiske subtyper og stadier av sykdommen med primær debulking, tilbakevendende sykdom og postneoadjuvant kirurgiske prøver. Ved å gi et strukturert rammeverk for generering av organoider avledet fra ulike pasientprøver, parallellsåing i forskjellige medier og implementering av forskjellige såingsstrategier, gir denne protokollen en mulighet til å vurdere individuelle forskjeller i stammepotensial, og dermed gi ytterligere informasjon om tumorbiologi. Så vidt vi vet, følger de aller fleste studier vanligvis omvendt tilnærming til å teste mediumkomponentene på et lite antall prøver og velge for enkelhets skyld stort sett ett optimalt medium. Vår systematiske testing av effekten av HER1ß, effekten av RSPO1 og FGF10 tilskudd, og 2D / 3D såing demonstrerer definitivt at eggstokkreftvev har en grad av interpatient variabilitet i stemness egenskaper, og det optimale mediet er faktisk pasientspesifikt. Derfor er systematisk parallell testing av forskjellige mediesammensetninger som gir forskjellige eksogene parakrine signalmiljøer avgjørende.
Etablering av en levende biobank med et omfattende panel av organoider avledet fra ulike eggstokkreftpasienter sammen med deres prospektivt innsamlede kliniske informasjon, fungerer som en verdifull ressurs for et bredt spekter av forskningsapplikasjoner og gjenspeiler det heterogene kliniske landskapet som potensielt kan gjelde for en større pasientpopulasjon17. Langsiktig dyrking og kryopreservering muliggjør eksperimentell konsistens og gjentatt tilgjengelighet av samme organoidlinje over tid, og tjener som base for langsgående eksperimentelle design med uendrede tumorlinjecellulære egenskaper.
Ved å beholde epitelarkitektur og polarisering er organoidlinjene en tilstrekkelig modell for å studere celle-celle-kommunikasjon og kontekstavhengig celleskjebnebeslutningstaking mediert av parakrine signalveier. Innebygging av organoider i histologisk gel er et praktisk og effektivt mellomtrinn for å unngå tap av materiale etter fiksering og sikrer at nedstrøms prosessering (innebygging i parafin og snitting) kan utføres parallelt med vevsprøver. Tapet av organoider under fikseringsprosedyren er et kritisk problem når antall organoider er svært begrenset. Dette tapet kan imidlertid motvirkes ved grundig fjerning av organoider fra den ekstracellulære matriksen ved vasking i et kaldt basalkulturmedium og ved å samle minst to fullvoksne brønner av en 24-brønns formatplate før fiksering. Immunfluorescensfargeprotokollen tillater høyoppløselig konfokal avbildning å korrespondere molekylære og fenotypiske egenskaper av eggstokkreftorganoider med foreldrenes tumorvev, men er også et verdifullt verktøy for å studere den cellulære responsen på kjemiske forbindelser eller karakterisering av genetisk modifiserte linjer. Metoden er også egnet for histologisk farging uten spesifikke modifikasjoner. Avhengig av formålet med studien, bør tynnere seksjoner kuttet med en mikrotom (2-3 μm) vurderes.
Det er viktig at stabil langsiktig kultur er en forutsetning for genredigeringseksperimenter og funksjonelle analyser om legemiddelrespons og resistens mot nye og standardterapier17,21. Spesielt organoider generert fra rebiopsier som utføres under sykdomsprogresjon og residiv, gir mulighet for direkte komparative analyser mellom den terapinaive opprinnelige svulsten og de nyervervede egenskapene observert under tilbakefall. Identifisering av pasientspesifikke behandlingsresponser og dannelse av terapiresistens in vitro fremmer feltet presisjonsmedisin i forskning på eggstokkreft21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MK er oppført som oppfinner på et patent relatert til et medium for eggstokkreft organoider. F.T. mottok forskningsmidler, rådgivende styre, honorarer og reiseutgifter fra AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA diagnostics og Tesaro/GSK. SM mottok forskningsmidler, rådgivende styre, æres- eller reiseutgifter: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.
Acknowledgments
Studien er finansiert av det tyske kreftforskningssenteret DKTK, Partner site München, et partnerskap mellom DKFZ og universitetssykehuset LMU München. Studien støttes også av German Cancer Aid-tilskuddet (#70113426 og #70113433). Parafininnebygging av vev og organoider er utført ved kjernefasiliteten ved Institutt for anatomi, Det medisinske fakultet, LMU München, München. Konfokal avbildning er utført ved kjerneanlegget Bioimaging ved Biomedical Center (BMC). Forfatterne ønsker å takke Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink og Martina Rahmeh, for teknisk hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Sterican 26 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657683 | |
| 100 Sterican 27 G | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 293T HA Rspo1-Fc | R&D systems, Minneapolis, USA | 3710-001-01 | Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111 |
| A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV) | Merck, Darmstadt, Germany | 616454 | |
| Advanced DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12634028 | |
| Anti-p53 antibody (DO1) | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-126 | |
| Anti-PAX8 antibody | Proteintech, Manchester, UK | 10336-1-AP | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17504-044 | |
| Bottle-top vacuum filter 0.2 µm | Corning, Berlin, Germany | 430049 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 661175 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 690160 | |
| CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2 | Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria | 658175 | |
| Collagenase I | Thermo Scientific, Waltham, USA | 17018029 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated | Corning, Berlin, Germany | 3548 | |
| Cryo SFM | PromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, Germany | C-29912 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D systems, Minneapolis, USA | 3533-005-02 | Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix Corning, 356231 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson Immuno | 715-175-151 | |
| DAKO Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen Retriever | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | C9999-1000ML | |
| DAPI | Thermo Scientific, Waltham, USA | 62248 | |
| Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32794 | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific, Waltham, USA | A32814 | |
| Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 14190-094 | |
| Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel | Thermo Scientific, Waltham, USA | Epredia HG-4000-012 | |
| Falcon 24-well Polystyrene | Corning, Berlin, Germany | 351447 | |
| Feather scalpel | Pfm medical, Cologne, Germany | 200130010 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 10270106 | |
| Formalin 37% acid free, stabilized | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1019205000 | |
| GlutaMAX | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 35050038 | |
| HEPES (1 M) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 156630080 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D systems, Minneapolis, USA | AF960 | |
| Human FGF10 | Peprotech, NJ, USA | 100-26 | |
| Human recombinant BMP2 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHC7146 | |
| Human recombinant EGF | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | PHG0311L | |
| Human recombinant Heregulin beta-1 | Peprotech, NJ, USA | 100-03 | |
| LAS X core Software | Leica Microsystems | https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/ | |
| Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal Microscope | Leica Microsystems | ||
| N-2 Supplement (100x) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 17502-048 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | N0636 | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Melsungen, Germany | 3570519 | |
| Paraffin | |||
| Parafilm | Omnilab, Munich, Germany | 5170002 | |
| Paraformaldehyd | Morphisto, Offenbach am Main, Germany | 1176201000 | |
| Pen Strep | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 15140-122 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P4333-100 | |
| PluriStrainer 400 µm | PluriSelect, Leipzig, Germany | 43-50400-01 | |
| Primocin | InvivoGen, Toulouse, France | ant-pm-05 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | 11814389001 | |
| Roticlear | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | A538.5 | |
| Surgipath Paraplast | Leica, Wetzlar, Germany | 39602012 | |
| Thermo Scientific Nunc Cryovials | Thermo Scientific, Waltham, USA | 375418PK | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8787 | |
| Trypan Blue Stain | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA | 12604-013 | |
| Tween-20 | PanReac AppliChem, Darmstadt, Germany | A4974-0100 | |
| Y-27632 | TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany | 1254 | |
| Zeocin | Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell. 33 (4), 690-705 (2018).
- Watson, R. W. G., Kay, E. W., Smith, D. Integrating biobanks: addressing the practical and ethical issues to deliver a valuable tool for cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (9), 646-651 (2010).
- Coppola, L., et al. Biobanking in health care: evolution and future directions. J Transl Med. 17 (1), 172 (2019).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discov. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Larsen, B. M., et al. A pan-cancer organoid platform for precision medicine. Cell Rep. 36 (4), 109429 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med (Berl). 95 (7), 729-738 (2017).
- Larsen, B. M., Cancino, A., Shaxted, J. M., Salahudeen, A. A. Protocol for drug screening of patient-derived tumor organoids using high-content fluorescent imaging. STAR Protoc. 3 (2), 101407 (2022).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Dev Cell. 58 (12), 1106-1121 (2023).
- LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C.
- Hoffmann, K., et al. Stable expansion of high-grade serous ovarian cancer organoids requires a low-Wnt environment. EMBO J. 39 (6), e104013 (2020).
- Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6, 8989 (2015).
- Trillsch, F., et al. Protocol to optimize the biobanking of ovarian cancer organoids by accommodating patient-specific differences in stemness potential. STAR Protoc. 4 (3), 102484 (2023).
- Maenhoudt, N., et al. Developing organoids from ovarian cancer as experimental and preclinical models. Stem Cell Reports. 14 (4), 717-729 (2020).
- Fuerer, C., Nusse, R. Lentiviral vectors to probe and manipulate the Wnt signaling pathway. PLoS One. 5 (2), e9370 (2010).
- Leica Biosystems. Leica ASP300S - Advanced smart processor vacuum tissue processor, instructions for use, V 2.1. , Available from: https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2022-01/Leica_ASP300S_IFU_2v1N_en.pdf (2021).
- Thermo Scientific. Microm EC350 Modular tissue embedding center Instruction manual. , (2009).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Sci Rep. 10 (1), 12581 (2020).
