Quantifizierung des 8-Oxo-dG-Gehalts mittels ELISA-Assay zur Bewertung oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zum quantitativen Nachweis oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen mittels ELISA-Technologie.

Zusammenfassung

Die 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosin-Base (8-oxo-dG) ist die vorherrschende Form der häufig beobachteten oxidativen DNA-Schädigung. DNA-Beeinträchtigungen wirken sich tiefgreifend auf die Genexpression aus und sind ein entscheidender Faktor bei der Stimulierung neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Alterung. Daher ist die präzise Quantifizierung von 8-OxoG von klinischer Bedeutung bei der Untersuchung von Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden. Gegenwärtig stellen die bestehenden Ansätze zum 8-OxoG-Nachweis jedoch Herausforderungen in Bezug auf Komfort, Zweckmäßigkeit, Erschwinglichkeit und erhöhte Empfindlichkeit dar. Wir verwendeten die ELISA-Technik (Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay), eine hocheffiziente und schnelle kolorimetrische Methode, um Variationen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellproben zu erkennen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) stimuliert wurden. Wir bestimmten die Konzentration von H₂O₂ , die oxidative Schäden in MCF-7-Zellen induzierte, indem wir ihren IC_50-Wert in MCF-7-Zellen detektierten. Anschließend behandelten wir MCF-7-Zellen 12 h lang mit 0, 0,25 und 0,75 mM H₂O₂ und extrahierten 8-Oxo-dG aus den Zellen. Abschließend wurden die Proben einem ELISA unterzogen. Nach einer Reihe von Schritten, einschließlich Plattenspreizung, Waschen, Inkubation, Farbentwicklung, Beendigung der Reaktion und Datenerfassung, konnten wir erfolgreich Veränderungen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellen nachweisen, die durch H₂O₂ induziert wurden. Durch diese Bestrebungen wollen wir eine Methode zur Bewertung des Ausmaßes oxidativer DNA-Schäden in Zellproben etablieren und damit die Entwicklung von zweckmäßigeren und bequemeren Ansätzen zur Detektion von DNA-Schäden vorantreiben. Dieses Unterfangen ist bereit, einen bedeutenden Beitrag zur Erforschung assoziativer Analysen zwischen oxidativen DNA-Schäden und verschiedenen Bereichen zu leisten, einschließlich der klinischen Forschung zu Krankheiten und dem Nachweis toxischer Substanzen.

Einleitung

Die oxidative Schädigung der DNA ist die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und dem zellulären antioxidativen Abwehrsystem¹. Es handelt sich hauptsächlich um die Oxidation von DNA, Purin und Pyrimidinbasen, ^2,3. Diese oxidative Modifikation der DNA-Basen beeinträchtigt nicht nur die Integrität des Genoms, sondern umfasst auch ein breites Spektrum pathologischer Probleme, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^4,5. Die Guaninbase in der DNA hat das geringste Reduktionspotenzial und ist am anfälligsten für Oxidation⁶. Daher dient 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosin (8-oxo-dG) als primärer Marker zur Beurteilung des Ausmaßes der oxidativen Schädigung der DNA ^7,8. Die genaue Quantifizierung von 8-Oxo-dG ist zu einem kritischen Thema geworden, wenn es darum geht, verschiedene Aspekte des Auftretens, des Fortschreitens und der Bewertung der multifaktoriellen oxidativen Belastung^{zu behandeln 9}.

Die traditionellen Methoden zum Nachweis von 8-Oxo-dG, wie z. B. die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD), die Massenspektrometrie und verwandte Bindestrichtechniken, weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität auf 10,11,12. Diese Techniken sind jedoch oft mit komplexen betrieblichen Anforderungen und hohen Kosten verbunden, was ihre breite Anwendbarkeit und Praktikabilität in der Hochdurchsatz-Probenanalyse behindert. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung von Wissenschaft und Technologie ist eine Vielzahl neuer, effizienter und genauer Methoden entstanden. Die Anwendung dieser neuen Technologien ermöglicht es uns, den 8-Oxo-dG-Gehalt genauer zu quantifizieren und leistungsfähigere Werkzeuge für eine eingehende Untersuchung des Zusammenhangs zwischen oxidativem Stress und Krankheit bereitzustellen. So haben Forscher beispielsweise die Nanoporentechnologie eingesetzt, um DNA¹³ quantitativ nachzuweisen und zu sequenzieren, DNA-Schadenstypen mit einer Single-Click-Code-Sequenzierungsstrategie¹⁴ zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden zu entwickeln und 8-OxoG-basierte Biosensoren durch Integration von Biotin-Streptavidin in ELISA^{herzustellen 15}. Unter ihnen ist ELISA mit seinen anerkannten Vorteilen in Bezug auf Spezifität, Hochdurchsatz-Screening und Kosten eine der idealen Lösungen für den 8-Oxo-dG-Nachweis. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine hochempfindliche, komfortable und schnelle Methode mit hohem Durchsatz zum Nachweis von 8-Oxo-dG zu entwickeln.

Die 1971¹⁶ entwickelte ELISA-Technik (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) hat sich in den letzten 50 Jahren rasant weiterentwickelt und ist heute eine der am häufigsten verwendeten Nachweismethoden in den Bereichen Biologie und Medizin 17,18,19. Die ELISA-Technologie weist eine hohe Sensitivität und Spezifität auf, verfügt über eine kurze Reaktionszeit und ist einfach zu bedienen, was sie zu einer weithin anerkannten Wahl für groß angelegte Probentests und Hochdurchsatzanalysen macht²⁰. Infolgedessen wurde ELISA in großem Umfang für die quantitative oder semiquantitative Analyse von Verbindungen, Proteinen, Antikörpern oder Molekülen in Zellen verwendet 21,22,23. Zum Beispiel wurde es bei der Detektion von Biomarkern eingesetzt, die mit verschiedenen Krankheiten, Arzneimittelrückständen und Biomolekülen assoziiert sind²⁴. ELISAs können auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der Prinzipien in vier Haupttypen eingeteilt werden²⁵. Zu diesen Methoden gehören der direkte ELISA, der indirekte ELISA, der Sandwich-ELISA und der kompetitive ELISA^26,27. Unter diesen wurde für die Studie in dieser Arbeit der Sandwich-ELISA ausgewählt, der zwei spezifische Antikörper verwendet, einen für das Einfangen des Zielmoleküls und einen für den Nachweis. Das experimentelle Prinzip des Sandwich-ELISA ist wie folgt: Zuerst wird ein spezifischer Antikörper in den Vertiefungen einer Mikroplatte immobilisiert, um den interessierenden Analyten einzufangen. Nachdem der Standard oder die Probe hinzugefügt wurde, bindet der Zielanalyt an den immobilisierten Antikörper. Anschließend wird ein markierter Antikörper hinzugefügt, der ein anderes Epitop auf dem Antigen erkennt, wodurch eine Sandwichstruktur gebildet wird. Nach der Entfernung der ungebundenen Antikörper wird ein Substrat hinzugefügt. Unter der katalytischen Wirkung des Sekundärantikörpers tritt eine Farbreaktion auf, und die Intensität der Farbe korreliert positiv mit der Konzentration des Zielanalyten in der Probe. Abschließend wurde die optische Dichte (OD) gemessen, um die Konzentration der Probe zu bestimmen. Der Sandwich-ELISA hat die Vorteile einer erhöhten Sensitivität und Spezifität für Zielproben, wodurch er für den Nachweis niedriger Konzentrationen von Zielanalyten und komplexen Proben geeignet ist²⁸. Darüber hinaus können die erzielten Ergebnisse für die weitere Analyse quantifiziert werden. Diese Faktoren machen den Sandwich-ELISA zu einer häufig verwendeten Nachweismethode sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in klinischen Laboratorien²⁹.

Ziel dieser Studie war es, 8-Oxo-dG in MCF-7-Zellen quantitativ nachzuweisen, um den Grad der oxidativen DNA-Schädigung in den Zellen zu bestimmen. Diese Studie besteht aus zwei Hauptteilen: der Konstruktion eines MCF-7-Zell-DNA-Modells für oxidative Schäden und dem Nachweis von 8-Oxo-dG mittels ELISA. Zunächst wurden MCF-7-Zellen in vitro kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von H₂O₂ für unterschiedliche Zeiträume behandelt. Die Zellviabilität wurde mit einem CCK-8-Assay untersucht, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀) von H₂O₂ in MCF-7-Zellen zu bestimmen. Basierend auf den IC_50-Werten wurde eine geeignete H₂O₂ -Behandlungszeit und Induktionskonzentration gewählt. Um Proben von MCF-7-Zellen zu extrahieren, die durch Oxidation geschädigt wurden, wurden Zellproben und Überstände entnommen und in enzymverknüpfte Vertiefungen gegeben, die zuvor mit 8-Oxo-dG-Antikörpern beschichtet waren. Das in der Probe vorhandene 8-Oxo-dG bindet an die Antikörper, die an den Festphasenträger gebunden sind. Dann wurden 8-Oxo-dG-Antikörper hinzugefügt, die mit Meerrettichperoxidase markiert waren. Das Reaktionsgemisch wurde bei konstanter Temperatur inkubiert, um eine vollständige Bindung der Probe an den Antikörper zu gewährleisten. Das ungebundene Enzym wurde durch Waschen entfernt, und dann wurde das kolorimetrische Substrat hinzugefügt, das eine blaue Farbe erzeugte. Unter Einwirkung von Säure färbte sich die Lösung. Schließlich wurde der OD-Wert der Reaktionstopfproben bei 450 nm gemessen, und die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe war proportional zum OD-Wert. Durch die Erstellung einer Standardkurve kann die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe berechnet werden.

Protokoll

1. Aufbau eines H₂O₂ -induzierten DNA-oxidativen Schadensmodells in MCF-7-Zellen

1. Rückgewinnung von MCF-7-Zellen
   1. Das Kryoröhrchen für die Zellkultur, das 3,5 x 10⁶ MCF-7-Zellen enthält und in einem -80 °C-Kühlschrank gelagert wird, wird schnell in eine Schaumstoffbox mit flüssigem Stickstoff umgefüllt. Nehmen Sie den Schlauch mit einer Pinzette heraus und legen Sie ihn für ca. 1 min in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C, um die konservierten Zellen aufzutauen.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Zellen während des Auftauvorgangs in einem Wasserbad intermittierend, um eine gleichmäßige Erwärmung des Kryofläschchens zu gewährleisten.
   2. Stellen Sie das Kryofläschchen in eine Zentrifuge und zentrifugieren Sie es bei Raumtemperatur bei 150 x g für 5 min.
   3. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette aus dem kryogenen Lagerröhrchen und fügen Sie 1 ml vollständiges Kulturmedium hinzu. Gut mischen und in eine 10-mm-Kulturschale umfüllen, weitere 7 ml vollständiges Kulturmedium hinzufügen.
   4. Die Kulturschale kreuz und quer schütteln, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten, und in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ kultivieren.
      HINWEIS: Das vollständige Kulturmedium besteht aus DMEM-Kulturmedium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin und Streptomycin ergänzt wird.
2. Bewertung der Zellviabilität
   1. Für das Experiment werden MCF-7-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit gutem zellulären Status ausgewählt. Während der logarithmischen Wachstumsphase weisen Zellen typischerweise einen kürzeren Teilungszyklus und eine hohe Häufigkeit der Zellteilung auf.
      1. Beobachten Sie die Morphologie und Wachstumsrate von MCF-Zellen mit einem Elektronenmikroskop. Wenn die Zellen eine einheitliche und dicht gepackte Monolagenmorphologie aufweisen und eine Zellproliferation erkennbar ist, kann festgestellt werden, dass sich die Zellen im Wesentlichen in der logarithmischen Wachstumsphase befinden.
   2. Zellwäsche: Verwenden Sie eine Pipette, um das Kulturmedium aus der Kulturschale zu nehmen, fügen Sie 1 ml PBS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen, und entsorgen Sie dann das PBS.
   3. Zellablösung: Fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu, um die Zellen zu waschen, und warten Sie etwa 1 Minute, bis Trypsin die Zellen vollständig von der Kulturschale gelöst hat. Klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale; Beobachtung der Zellbewegung
      in Blättern deutet auf eine gründliche Zellablösung hin.
   4. Beendigung der Zellablösung und Zellzählung: Fügen Sie 8 ml vollständiges Kulturmedium hinzu, um die Ablösung zu beenden, pipettieren Sie die Zellen vorsichtig und bestimmen Sie die Konzentration der Zellsuspension mit einem Zellzählgerät.
      HINWEIS: Stellen Sie vor dem Zählen sicher, dass die Zellsuspension homogen ist, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
   5. Zellaussaat: Passen Sie die verdünnte Zellsuspension an, um eine Zelldichte von 5.000 Zellen pro 100 μl zu erreichen. Impfen Sie die Zellsuspension mit einer Pipettenpistole in 21 Vertiefungen einer 96-Well-Platte und geben Sie 100 μl in jede Vertiefung. Geben Sie 100 μl PBS-Puffer in die umgebenden Vertiefungen der ausgesäten Vertiefungen, um eine übermäßige Verdunstung des Kulturmediums zu verhindern.
   6. Aufbereitung von_{H2O2-haltigem} Medium: Wählen Sie 9 Vertiefungen auf der 12-Well-Zellkulturplatte aus und vergeben Sie Markierungen basierend auf dem Gradienten der_H2O_{2-Konzentrationen} (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Geben Sie 720 μl vollständiges Medium in die Vertiefungen, die als 2,0 mM und 1,5 mM gekennzeichnet sind, und fügen Sie 360 μl vollständiges Medium in die verbleibenden Vertiefungen hinzu.
      1. Geben Sie mit einer Pipette 1,63 μl und 1,22 μl 3 % H₂O₂ -Reagenz in die Vertiefungen, die als 2,0 mM bzw. 1,5 mM gekennzeichnet sind. Mischen Sie die Lösung gründlich. Mit einer Pipette 360 μl 2,0 mM H₂O₂ in die mit 1,0 mM markierte Vertiefung geben und mischen; dann 360 μl 1,0 mM H₂O₂ in die mit 0,5 mM gekennzeichnete Vertiefung überführen und mischen; und schließlich 360 μL 0,5 mM H₂O₂ in die Vertiefung mit 0,25 mM übertragen. Pipettieren Sie 360 μl 1,5 mM H₂O₂ in die Vertiefung mit 0,75 mM, um zu verdünnen und die gewünschte Konzentration zu erreichen. (Abbildung 1).
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die H₂O₂ -Stammlösung in der Pipette vollständig in die Vertiefungen überführt wird, um Lösungsreste zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen gründlich gemischt werden, bevor Sie mit der Verdünnung fortfahren.
   7. Inkubation: Nach ca. 24 Stunden Zellaussaat entfernen Sie mit einer Pipette das Kulturmedium von der 96-Well-Platte, sobald die Zellen an den Oberflächen haften. Entsprechend dem Konzentrationsgradienten wird das jeweilige H₂O₂ -haltige Medium in jede Vertiefung gegeben. Stellen Sie die Platte für 12 Stunden wieder in den Inkubator.
   8. Zugabe von CCK-8-Reagenz: Nach Ablauf der vorgesehenen 12-stündigen Behandlungsphase das Kulturmedium mit einer Pipette von der 96-Well-Platte entfernen, 100 μl vollständiges Kulturmedium und 10 μl CCK-8-Reagenz in jede Vertiefung geben und drei leere Kontrollvertiefungen hinzufügen. Die Platte bei 37 °C 2 h inkubieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie während des Hinzufügens von Proben die Bildung von Blasen, um eine Beeinträchtigung des OD-Wert-Messwerts zu vermeiden.
   9. Absorptionsmessung: Nehmen Sie die 96-Well-Platte aus dem Inkubator, messen Sie die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader und zeichnen Sie die Ergebnisse auf.
   10. Gemäß der Berechnungsformel IC₅₀
       Hemmrate (%) = (OD der experimentellen Wirkstoffgruppe - durchschnittliche OD des Operationskontrolllochs)/ (durchschnittliche OD des Zellkontrolllochs - durchschnittliche OD des Wirkstoffkontrolllochs) x 100%
       Berechnen Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Absorption in Kontrollkulturen.
   11. Importieren Sie die verarbeiteten experimentellen Daten in eine statistische Analysesoftware, wählen Sie den Analysetyp Nichtlineare Regression aus, konstruieren Sie das logistische Modell mit vier Parametern, und klicken Sie auf die Schaltfläche Kurve anpassen für die Kurvenanpassung. Nach dem Anpassungsprozess berechnet die Software automatisch den IC_50-Wert .
3. H₂O_{2-induziertes} MCF-7-Zelloxidationsexperiment
   1. Entnahme von MCF-7-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit gutem Zellstatus für Experimente.
   2. Waschen, Zellablösung durchführen, Ablösung beenden und Zellen zählen (siehe Schritt 1.2 für spezifische Methoden).
   3. Zellaussaat: Stellen Sie die Dichte der Zellsuspension auf 1 x 10⁶ Zellen pro Schale ein, wobei 4 ml der Suspension pro Schale mit einem Durchmesser von 6 cm vorhanden sind.
   4. Markieren Sie zwei 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,25 mM und 0,75 mM 3 % H₂O₂. Geben Sie 4 ml vollständiges Medium in jedes Röhrchen und fügen Sie dann 1,13 μl bzw. 3,40 μl 3 % H₂O₂ hinzu. Schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Ersetzen Sie das Nährmedium in den drei Schalen durch ein vollständiges Medium mit H₂O₂ -Konzentrationen von 0, 0,25 und 0,75 mM.
   5. Inkubieren Sie die Kulturen: Stellen Sie die Schalen für 12 Stunden in den Inkubator zurück.

2. Vorbereitung von zellulären Proben und Vorbereitung von ELISA-Reagenzien

1. Entnahme von Zellextraktproben
   1. Probenentnahme: MCF-7-Zellkulturüberstand entsorgen, spülen, Zellablösung durchführen, Ablösung beenden und Zellen entnehmen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Zentrifugation: Zentrifugieren Sie 5 min lang bei 800 x g , um das Zellpellet zu sammeln. Fügen Sie 200 μl PBS hinzu, um jede Zellprobe zu resuspendieren und die Zellen durch wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu zerstören. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 1.500 x g für 10 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand für die Analyse zu sammeln.
      HINWEIS: Wenn die Zellmenge niedrig ist, reduzieren Sie das Volumen von PBS, das für die Resuspension verwendet wird. Die Proben können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, wenn eine sofortige Analyse nicht möglich ist. Für die Langzeitlagerung aliquotieren Sie die Proben auf der Grundlage von Einwegmengen und lagern Sie sie bei -80 °C, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.
2. Vorbereitung von ELISA-Reagenzien
   1. Auftauen der Reagenzien: Lassen Sie die ELISA-Reagenzien, einschließlich Versiegelungsfilme, vorbeschichtete Platten, Standards, Probenverdünnungsmittel, Nachweis-Antikörper-HRP, Chromogensubstrat, Stopplösung, konzentrierten Waschpuffer (20x) und die Testproben 20 Minuten lang auf Raumtemperatur (18-25 °C) bringen, bevor Sie mit dem Assay beginnen. Öffnen Sie den ELISA-Reader 15 Minuten vor dem Gebrauch.
   2. Vorbereitung des Waschpuffers: Berechnen Sie das erforderliche Volumen des verdünnten Waschpuffers und verdünnen Sie dann den 20-fach konzentrierten Waschpuffer mit destilliertem oder entionisiertem Wasser zu 1x Arbeitslösung. Stellen Sie unbenutztes konzentriertes Waschpuffer wieder in den 4 °C Kühlschrank.
      HINWEIS: Der Waschpuffer sollte vor Gebrauch frisch zubereitet werden. Wenn sich Kristalle in dem im Kühlschrank gelagerten konzentrierten Waschpuffer befinden, lassen Sie ihn auf Raumtemperatur kommen und schütteln Sie ihn vorsichtig, bis sich die Kristalle vor der Verwendung vollständig aufgelöst haben.
   3. Erstellung der Norm
      1. Bereiten Sie Arbeitslösungen von Standardproben mit Konzentrationen von 1,25, 2,5, 5, 10, 20 bzw. 40 ng/ml vor. Um die Genauigkeit der Versuchsergebnisse zu gewährleisten, mischen Sie die Standardproben vor der Verwendung vorsichtig auf und ab, um die Bildung von Blasen während des Auflösungsprozesses zu vermeiden.

3. ELISA-Versuch

1. Plattenbeschichtung: Entwerfen Sie im Voraus die Gesamtzahl der Wells für Standards, Proben und Blind-/Kontrolldateien und nehmen Sie die erforderlichen Plattenstreifen heraus. Geben Sie 50 μl Standardarbeitslösung und Nachweisproben mit unterschiedlichen Konzentrationen in die Reaktionsvertiefungen. Die Standards sind in dreifacher Ausführung durchzuführen und keine Proben in die Blind-/Kontrollvertiefungen²⁵ zu geben.
   HINWEIS: Die experimentellen Schritte des ELISA-Assays sind in Abbildung 2 schematisch dargestellt. Wenn die Probenkonzentration den Nachweisbereich überschreitet, sollte die Probe vor der Probenahme mit Probenverdünnungsmittel verdünnt werden. Wenn Sie Proben hinzufügen, geben Sie sie auf den Boden der Platte, vermeiden Sie es, die Well-Wände zu berühren, schütteln Sie sie vorsichtig, um sich zu mischen, und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Um die Genauigkeit des Experiments zu gewährleisten, sollte jede Probenzugabe innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen sein.
2. Inkubation: Mit Ausnahme der Blank-Wells 100 μl Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Nachweisantikörper in jede Reaktionsvertiefung geben, die Wells mit einer Plattendichtung verschließen und 60 Minuten lang bei 37 °C in einem Inkubator mit konstanter Temperatur inkubieren.
3. Waschen: Entsorgen Sie die Flüssigkeit, schütteln Sie die Flüssigkeit in den Plattenvertiefungen ab, tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken, geben Sie 350 μl Waschpuffer in jede Reaktionsvertiefung, lassen Sie ihn 1-2 Minuten stehen, dann entsorgen Sie den Waschpuffer. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.
   HINWEIS: Gründliches Waschen ist von entscheidender Bedeutung, da es sich direkt auf die Genauigkeit der Versuchsergebnisse auswirkt. Achten Sie darauf, dass der Waschpuffer nach jedem Waschen vollständig abgeschüttelt wird. Wischen Sie nach dem Waschen vorsichtig alle Rückstände auf der Unterseite der Platte ab, um eine Beeinträchtigung der Absorptionsmessung zu vermeiden.
4. Farbreaktion: 50 μl Substrat A und 50 μl Substrat B in jede Reaktionsvertiefung geben, die Platte verschließen und bei 37 °C im Dunkeln 15 min inkubieren.
   HINWEIS: Beobachten Sie nach der Zugabe des Farbreagenzes die Farbänderung in den Reaktionsvertiefungen sofort. Wenn die Farbe zu dunkel ist, fügen Sie die Stopplösung hinzu, um die Reaktion früher zu beenden.
5. Beenden Sie die Reaktion und messen Sie die Absorption: Geben Sie 50 μl Stopplösung in jede Reaktionsvertiefung und messen Sie sofort den OD-Wert bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem ELISA-Reader (innerhalb von 15 Minuten).
6. Datenanalyse: Importieren Sie die verarbeiteten experimentellen Daten in die statistische Analysesoftware, wählen Sie den Analysetyp Lineare Regression aus. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve, indem Sie die Konzentration der Standards auf der X-Achse mit den Werten der optischen Dichte (OD) auf der Y-Achse vergleichen. Verwenden Sie die etablierte Kalibrierkurve, um die Konzentration von 8-Oxo-dG in den Proben zu bestimmen. Konstruieren Sie ein logistisches mathematisches Modell, und klicken Sie auf die Schaltfläche Kurve anpassen für die Kurvenanpassung. Im Anschluss an den Anpassungsprozess berechnet die Software automatisch die Normkurve und den p-Wert.
   HINWEIS: Die Standardkurve kann nicht wiederverwendet werden und muss für jedes Experiment neu bestimmt werden.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigt die X-Achse die Konzentration von H₂O₂ an, die auf MCF-7-Zellen aufgebracht wird, während die Y-Achse die Lebensfähigkeit der Zellen anzeigt. Die Behandlung mit 0,75 mM für 12 h reduzierte die Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen auf 67%. Gleichzeitig mit dem Konzentrationsanstieg kam es zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen, insbesondere bei einer Konzentration von 1,5 mM, wo die Lebensfähigkeit auf unter 3% sank (Tabelle 1). Die experimentellen Ergebnisse deuteten auf einen IC₅₀ von 0,7655 mM für die MCF-7-Zellen hin.

In dieser Versuchsreihe haben wir eine verbesserte ELISA-Technik zur Quantifizierung von 8-Oxo-dG-Gehalten eingesetzt. Durch die Datenanalyse lautet die Regressionsgleichung der Standardkurve:

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Wie in Abbildung 4A dargestellt, zeigte die Kalibrierkurve eine hohe Linearität (R²=0,978), und Abbildung 4B zeigt, dass die Beziehungen zwischen den gemessenen Konzentrationen von 8-Oxo-dG in den Proben und den entsprechenden zugesetzten Mengen stark korreliert waren, was auf eine gute Genauigkeit hinweist (der Variationskoeffizient betrug weniger als 5%). Darüber hinaus zeigt die Konsistenz der erhaltenen Ergebnisse über mehrere Replikate hinweg die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der experimentellen Methode an.

Zusammenfassend deuten die experimentellen Daten darauf hin, dass unsere optimierte ELISA-Methode in der Lage ist, Schwankungen des 8-Oxo-dG-Spiegels unter gut kontrollierten Bedingungen erfolgreich zu erkennen. Dies hat erhebliche Auswirkungen auf zukünftige Anwendungen dieser Technik in einem breiteren Spektrum von Probentypen zur Überwachung von DNA-Schäden, die durch oxidativen Stress verursacht werden. Trotz gewisser Einschränkungen erscheinen die Anwendungsaussichten der Methode vielversprechend, wenn die experimentellen Bedingungen optimiert werden.

Abbildung 1: Vorbereitung von H₂O₂ -Verdünnungen. Das schematische Diagramm beschreibt das Verfahren zur Herstellung von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) -Verdünnungen, das die sorgfältige Kombination von Lösungen und die präzise Übertragung unterschiedlicher H₂O₂ -Konzentrationen in Röhrchen umfasst, die entsprechend als 1,0 mM, 0,5 mM und 0,25 mM gekennzeichnet sind. Die Zielkonzentration wird erreicht, indem 1,5 mM H₂O₂ in das als 0,75 mM bezeichnete Röhrchen überführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) für den Antigennachweis. Diese schematische Darstellung zeigt die aufeinanderfolgenden Schritte eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) für den Antigennachweis: Probenzugabe und Blindpräparation; Inkubation von HRP-markiertem Antigen; Waschen und Tellervorbereitung; Substratzugabe und Inkubation; Messung der Reaktionsbeendigung und der optischen Dichte (OD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: H₂O₂ hemmte die MCF-7-Zellproliferation. Die Zellviabilität wurde mittels CCK-8-Assay bewertet, der mit verschiedenen Konzentrationen von H₂O₂ (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 oder 2,0 mM) für 12 h behandelt wurde, und IC₅₀ wurde für die angegebene Bedingung berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Quantitative Analyse von 8-Oxo-dG in MCF-7-Zellen nach H₂O₂ -Behandlung. (A) ELISA-Standardkurve für 8-Oxo-dG. Stellt die Beziehung zwischen den bekannten Konzentrationen von 8-Oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 ng/ml) und den jeweiligen Absorptionswerten dar. Die Regressionsgleichung der Standardkurve lautet Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R²=0,978). (B) 8-Oxo-dG-Konzentration in_H2O_{2-behandelten} MCF-7-Zellen. Das Diagramm zeigt die 8-Oxo-dG-Spiegel in MCF-7-Zellen, die unterschiedlichen Konzentrationen von H₂O₂ (0, 0,25 und 0,75 mM) ausgesetzt waren. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert ± SE (Standardfehler) aus drei unabhängigen Experimenten (n=3) dar, der den Einfluss von oxidativem Stress auf die DNA-Schädigung veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Parameter
H2O2 Konzentration, mM	0	0.25	0.5	0.75	1	2
Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen, %	100	82.8	81.37	61.07	13.4	2.77

Tabelle 1: Zellviabilität von MCF-7-Zellen, die mit H₂O₂ behandelt wurden.

Diskussion

Die Entwicklung von ELISA-Methoden ist sowohl für bestehende als auch für neue Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden von großer Bedeutung. Im Vergleich zu herkömmlichen HPLC- und Massenspektrometrie-Techniken ist dieser Ansatz nicht nur benutzerfreundlich, sondern weist auch eine hohe Sensitivität auf und erfüllt die Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings³⁰. Dies ermöglicht das Monitoring von 8-Oxo-dG in groß angelegten Krankheitsscreening-Studien und ermöglicht ein tieferes Verständnis des Zusammenhangs zwischen diesem Biomarker und verschiedenen Krankheiten.

Während der experimentellen Verfahren sind mehrere kritische Schritte unerlässlich, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst bewertete das Experiment die Sensitivität von MCF-7-Zellen gegenüber H₂O₂ mit einem IC_50-Wert von 0,7655 mM nach 12 Stunden, was die Toleranz von MCF-7-Zellen unterstreicht. Dieses Ergebnis ist von großer wissenschaftlicher Bedeutung für das Verständnis der antioxidativen Abwehrmechanismen von MCF-7-Zellen und ihres Überlebens unter oxidativem Stress und stellt gleichzeitig einen wichtigen Referenzindikator für das zukünftige Screening von antioxidativen Arzneimitteln oder verwandten Behandlungsmechanismen dar³¹. Darüber hinaus ist die Auswahl und Paarung von 8-Oxo-dG-Antikörpern für den ELISA-Nachweis von entscheidender Bedeutung und wirkt sich direkt auf die Spezifität und Sensitivität des ELISA-Nachweissystems aus. Darüber hinaus sind die Optimierung der Signalverstärkungsstrategie und der Probenverarbeitungsschritte wichtige Faktoren, die sich auf die Detektionsgenauigkeit auswirken. Wir fanden heraus, dass die Verwendung eines stabilen Substratreaktionssystems Hintergrundfehler reduzieren und den Empfindlichkeitsbereich der Detektion erhöhen kann.

Während des experimentellen Prozesses können technische Probleme wie instabile Antikörper, Signalschwankungen und Kreuzreaktivität von Reaktanten auftreten. Um diese Probleme anzugehen, haben wir ein stabileres experimentelles Protokoll eingeführt, das die Verwendung stabiler Antikörperlösungsmittel zur Verbesserung der Antikörperstabilität und die Optimierung und Anpassung der Versuchsbedingungen beinhaltete. Um den durch Signalschwankungen verursachten Fehler zu beheben, standardisierten wir das Experiment mit Standard-8-Oxo-dG-Proben, um die Konsistenz der Ergebnisse zu gewährleisten.

Was die Einschränkungen der experimentellen Methode betrifft, so kann der ELISA, obwohl er einen Hochdurchsatzansatz bietet, immer noch durch die spezifische Antikörperabdeckung und die unvermeidliche Substratkreuzreaktivität eingeschränkt sein³². Daher können bei komplexen Proben zusätzliche Probenaufreinigungs- oder Vorverarbeitungsschritte erforderlich sein. Darüber hinaus kann der Nachweis von Proben mit niedrigeren Konzentrationen eine weitere Optimierung der Antikörperaktivität erforderlich machen, um den Forschungsanforderungen gerecht zu werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die ELISA-Nachweismethode für 8-Oxo-dG wichtige Implikationen für spezifische Forschungsbereiche hat. Es hat einen potenziellen Anwendungswert in der Umweltüberwachung, der Risikobewertung von Krankheiten und der Früherkennung und bietet einen neuen Nachweisansatz für 8-Oxo-dG in der Landwirtschaft, bei der Lebensmittelsicherheit und beim Arzneimittelscreening³³. So kann beispielsweise im Umwelt-Biomonitoring der Nachweis von DNA-oxidativem Schädigungsstress, der durch Umweltgifte in Organismen verursacht wird, dazu beitragen, potenzielle Risiken rechtzeitig zu erkennen³⁴. In Zukunft wird erwartet, dass diese Methode mit der weiteren Optimierung der Detektionstechnologie und ihrer Anwendung in mehreren Disziplinen eine wichtigere Rolle in der lebenswissenschaftlichen Forschung spielen wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin-EDTA(1x)	Gibco	25200-072
Zellzählkit-8	Dojindo	CK04
Zellzählplatte	QiuJing	XB-K-25
CO2 Inkubator	Thermo	51032872
DMEM basic(1X)	Gibco	C11995500BT
FBS	PAN	ST30-3302
GraphPad Prism X9	GraphPad Software		Software Software für statistische Analysen
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Thermo	9AQ2861
Humanes 8-Oxo-dG-ELISA-Kit	Zcibio	ZC-55410
L-1000XLS+ Pipetten	Rainin	17014382
L-20XLS+ Pipetten	Rainin	17014392
Flüssigstickstofftank	Mvecryoge	YDS-175-216
MCF-7 CELL	BNCC	BNCC100137
Multiskan FC Mikrotiterplatten-Photometer	Thermo	1410101
PBS	Solarbio	P1020
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X	Beyotime	C0222
Trinokulares Lebendzellmikroskop	Motic	1.1001E+12
Ultratiefkühlschrank	Haire	V118574