Name: Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenz-Speckle-Mikroskopie zur Untersuchung von F-Aktin-Dynamik in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht quantitative Analysen zytoskelettaler Proteinkinetik in Echtzeit.

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Die Entwicklung der qFSM wird durch die NIH U01 GM06230 finanziert.

Abschnitt 1: Beziehen Sie Ihre fluoreszenzmarkierten Aktin für FSM Benötigte Materialien: gereinigtem Aktin, Fluorophor (Alexa, X-Rhodamin empfohlen). G-Puffer, Ultrazentrifuge <ol><li> Eine wichtige Komponente für den Erwerb guter FSM Filme erfordert die korrekte Kennzeichnung von Aktin (oder andere Zytoskelettproteine) mit dem Fluorophor Ihrer Wahl. Wir empfehlen die Verwendung von Fluorophoren Alexa (488, 568 Wellenlängen) und X-Rhodamin Succinimidylester Derivate, die Lysinreste ausgesetzt Ziel auf der Oberfläche von Aktin. </li><li> Bei der Wahl Ihres Fluorophor und seiner entsprechenden Wellenlänge, sicherzustellen, dass Ihr Mikroskop Setup die entsprechenden Filter (Anregung und Emission) und Beleuchtungen hat (Quecksilberdampf-Lampe und / oder Laser), um Ihre Fluoreszenz-Tag unterbringen. Wir empfehlen die Auswahl Wellenlängen im orange bis roten Wellenlängen (560-630 nm), um die Auswirkungen der Auto-Fluoreszenz-und Foto-Schäden zu minimieren und auf ihre Vereinbarkeit mit GFP-Konjugate zu gewährleisten. </li><li> Reine Aktin aus Muskelgewebe Zugehörigkeit zu Rat oder Huhn extrahiert werden, sondern erfordert eine langwierige Extraktion von Muskel-Aceton-Pulver. Muscle Aceton-Pulver kann von Invitrogen erworben werden. Die Kennzeichnung Verfahren ist noch nicht in diesem Protokoll diskutiert, aber finden Sie hier [1] zu finden </li><li> Alternativ können Sie markierte Aktin-Proteinen aus mehreren Anbietern, darunter Zytoskelett Inc. und Invitrogen kaufen. Benutzerdefinierte Beschriftung Dienstleistungen werden auch von Invitrogen zur Verfügung. Gereinigtes, nicht-markierten Aktin (beide Muskel-und nonmuscle Aktin) kann von Zytoskelett Inc. erworben werden </li><li> Ob zum Kauf oder bereiten Sie Ihre eigenen markiertes Aktin entscheiden, wollen Sie sicherstellen, dass die Kennzeichnung Verhältnis irgendwo um 0,3 bis 0,7 Farbstoffe pro Monomer von Aktin. Eine zu hohe Markierungsverhältnis kann Auswirkungen auf die Umsatz-Kinetik (und die Bindung an assoziierten Proteinen) des Aktin-Filamenten, während eine zu niedrige Kennzeichnung Verhältnis zu arm aussehende Flecken (niedrige Signal-Rausch-) führen wird und kann Mikroinjektion Probleme (siehe unten) führen. Dies ist ein entscheidender Faktor, um gute Specklebilder. </li><li> Vor längerer Lagerung sollten die markierten Aktin-Lösung durch das Drehen mit 75.000 geklärt werden - 80.000 xg für 20 Minuten bei 4 Grad Celsius. Markiertes Aktin sollte in G-Puffer gespeichert und aufbewahrt -80 Grad Celsius. Herstellung von 2 uL Aliquots wird dringend empfohlen, die schädlichen Wirkungen von wiederholtes Einfrieren und Auftauen (führt zu unlöslichen Aggregaten) zu reduzieren. Refrain aus Freilegung der markierten Aktin-Lösung für direktes Licht (wird von Fluorophoren Bleichen). Wir empfehlen die Verwendung undurchsichtige Reaktionsgefäße für die langfristige Lagerung. </li></ol> § 2: Herstellung von Zellen und Mikroinjektion von markiertem Aktin Benötigte Materialien: Mikroinjektion Nadeln, Mikroliterspritze microloaders, vorgewärmt Zelle Medien, Injektionspuffer, Eimer mit Eis, Mikroskop (Phase Ring, Phasenkontrast Objektiv 40x, transjector-, Nadel-Abzieher, Mikromanipulator) <ol><li> Viele Zelltypen sind zugänglich für FSM, aber immer gute Specklebilder ist direkt abhängig von dem Erfolg der Mikroinjektion Verfahren. Bei der Auswahl der Zellen für die FSM, Zellen sollte groß (&gt; 50 um im Durchmesser), sollte verbreitet, wenn vernickelt, und natürlich Anhänger auf Substrate (oder Kunststoff Gewebekulturschalen). Es hilft auch, wenn die Zelle Cytosol nimmt eine Fläche größer als sein Kern. Die oben genannten Kriterien zu gewährleisten, dass die Zellen zugänglich Mikroinjektion werden. Erfolgreiche Kandidaten Zelllinien umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) PtK1 [2,3], newt Lungenzellen [4], und Aplysia [3]. </li><li> , Die mit Säure gewaschen haben; Cells sollten auf Platz Deckgläser (. Keine 1-1/2 22 x 22 mm) beschichtet werden. Standard-Substrat Beschichtung kann auf das Deckglas aufgetragen werden und wirken sich nicht auf die Mikroinjektion. </li><li> Die richtige Auswahl der Mikroinjektion Nadeln ist abhängig von der Größe der Spitze öffnen. In der Regel können Lochgrößen sehr in der Größe von 0,5 um bis so groß wie 3 um. Wir empfehlen jedoch, dass die Injektion von Aktin erfordert eine optimale Öffnung der Größe zwischen 0,5 bis 1 um. Wenn Verstopfung Probleme konsequent auftreten, können größere Loch Größen für die Lieferung von monomeren sowie unerwünschte polymerisiert Aktin-Filamenten unterzubringen. Mikroinjektion Nadeln können durch mehrere Anbieter wie Eppendorf Systeme, die femtotip Mikroinjektion Nadeln machen erworben werden. Alternativ, wenn eine kommerzielle Nadel Abzieher vorhanden ist, kann Glas Mikroinjektion Rohre von Sutter gekauft und zog nach Spezifikation. Für Anfänger empfehlen wir mit 10-20 gezogen Nadeln auf der Hand vor dem Beginn der Injektion. </li><li> Ideal &#39;Injektion Konzentration &quot;(Endkonzentration von Aktin in Ihre Nadel geladen) von Aktin liegt zwischen 0,5 bis 1,0 ug / ul auf Basis eines 40% Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer. Lower Kennzeichnung Verhältnis Ihrer Aktin kann durch die Injektion bei höheren Konzentrationen (1-3 ug / ul) kompensiert werden. Allerdings wird die Verstopfung Frequenz Ihrer Nadelerhöht werden. Dies kann teilweise durch Verwendung von Nadeln mit größeren Öffnungen gelindert werden. Lager-Konzentration von Aktin kann durch Zugabe von eiskaltem Injektion verdünnt werden. Eiskalte ddH2O kann auch verwendet werden, um schnelle Injektionen zu verdünnen. Zu diesem Zeitpunkt arbeiten alle Lösungen sollten auf Eis gehalten werden. </li><li> Last von 0,5 bis 1,0 uL Ihrer Aktin-Lösung mit einer Mikroliterspritze (Schmalspurbahn - Hamilton), oder alternativ mit einem Microloader Pipettenspitze. </li><li> Sorgfältig verzichten die Aktin-Lösung, durch leichtes Lösen der Lösung. Bubbles sollte vermieden werden, kann aber leicht durch die Aufnahme überschüssiger Flüssigkeit um die Blase entfernt werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Aktin-Lösung ist komplett Ruhe an der Nadelspitze. Überschüssige Lösung überall entlang der Kapillare der Nadel kann stören die Einspritzmenge. </li><li> Nun vorsichtig die Nadel legen, Vermeidung von Kontakt mit der Nadelspitze, um den Injektor Inhaber. Positionieren Sie die Halterung, so dass die Nadel macht 35-50 Grad-Winkel an der Basis des Mikroskoptisches. Lower Winkel sind bevorzugt. </li><li> Senken Sie die Spitze der Nadel, bis er bricht kaum die Oberfläche der Medien baden Ihre Zellen. </li><li> Jetzt Position der Nadelspitze (ohne Tieferlegung), so dass es direkt über dem Mittelpunkt des Ziels liegt. Wenn die Nadelspitze mit dem Ziel ausgerichtet ist, sollten Sie einen hellen Schein durch das Okular zu sehen. Dies ist das Ende der Nadelspitze. Langsam bewegt die Nadel hin und her (mit dem Manipulator) können besser helfen suchen Sie den Heiligenschein. </li><li> Stellen Sie die z-Fokus auf das Mikroskop, bis Ihre Zellen in klare Sicht sind. Nun, langsam wieder die Spitze, bis die Halo allmählich verengt, bis schließlich konvergieren in der Nadelspitze - Sie benötigen, um den Fokus (z-Position) gleichzeitig zu steuern. Ein zusätzliches Feature zu suchen ist die Welle der Nadel, die lineare Schatten werfen wird. Senken Sie die Nadel wird nach und nach Definition der Nadelschaft. Bei richtiger Ende der Nadel und Ihre Zellen getan werden sollte, sowohl in klar sehen zu können. Leichte Einstellung der Phase-Ring erforderlich, um den Kontrast zu verbessern. </li><li> Bei der Navigation, sicherzustellen, dass die Nadelspitze ist weit über Ihre Zellen zu verhindern Bruch der Nadelspitze. </li><li> Bei der Auswahl der Zellen zu injizieren, sollten die Zellen mit freien Kanten werden vor der Nadelspitze. Dadurch wird sichergestellt, sinkende Steigung der Zelle (aus dicksten Stelle, wo der Kern liegt, um die dünnste Stelle der Vorderkante) wird die Nadelspitze, anstatt parallel zu ihr gerecht zu werden. </li><li> Die Nadel Druck sollte bei 0,3 bis 0,8 bar eingestellt werden. Der konstante Druck wird in einem stetigen Fluss des Aktin-Lösung führen. </li><li> Nach der Entscheidung über eine Zelle zu injizieren, positionieren Sie Ihren Nadel so die Spitze befindet sich neben dem Kern (perinukleären Region, dickste Teil der Zelle, wo der Kern ist nicht direkt unten). </li><li> Langsam senken, und justieren die Position der Nadel, bis die Spitze ist deprimierend die Membran, nun schrittweise abzusenken, bis die Nadelspitze die Membran durchstochen hat. Wenn die Nadel vollständig die Membran durchstochen, wird die Zelle heller erscheinen, sobald Sie sehen diesen Unterschied Heben Sie die Nadel, bis es nicht mehr berührt die Zelle. Die eigentliche Piercing und Injizieren Vorgang dauert 0,5 bis 2 Sekunden. </li><li> Wenn es richtig gemacht, wird die Zelle Form erscheinen unverändert, während zu viel Injektion in schnelle Zurückziehen der Zelle Rand führen wird und in einigen Fällen werden Sie tatsächlich sehen, die Zelle explodiert. </li><li> Wenn Sie nicht sehen, Veränderungen in der Zelle, wenn Mikroinjektion (nicht heller), kann die Nadelspitze geschlossen werden. Sie können diese durch Drücken der &quot;sauberen&quot;-Taste, wenn auf Ihrem transjector testen. Wenn geöffnet ist, wird dies deutlich erhöhen den konstanten Druck Strömung, die durch die Okulare sehen kann - es erscheint wie Wellen und in der Nähe Trümmer zu sehen Dispergieren werden. </li><li> Wenn die Nadelspitze geschlossen ist, können Sie wählen, um eine neue Mikroinjektionsnadel oder versuchen, die Spitze der Nadel durch leichtes Absenken der Nadel, bis die Spitze der Nadel drückt gegen die Deckglas einfügen, wodurch die ganz am Ende der Spitze zu brechen. Der Bruch Bereich sollte nicht mehr als ein 1 / 5 th der Bereich der Nadelspitze (der Teil der Nadel, die an einem Punkt zusammenlaufen beginnt). </li><li> Fahren Sie mit der Injektion, nicht mehr als 20 bis 45 Minuten pro Sitzung Mikroinjektion (wird vom Zelltyp abhängig). In der Regel sind kürzere Sitzungen empfohlen, Stress auf die Zellen zu minimieren. </li><li> Nach Beendigung der Mikroinjektion, ändern Sie die Zelle Medien in der Schale durch Zugabe von frischem vorgewärmten Medien. Dann können Zellen für 30 Minuten in einem Inkubator vor Sicherung wiederherstellen. Dies ermöglicht auch für die Aktin-Zytoskelett in das bestehende Netzwerk zu integrieren. </li></ol> Abschnitt 3: Zusammenbau des Imaging Chamber Benötigte Materialien: Deckglas, doppelseitiges Klebeband, Q-Tips, Pinzetten, valap, kim wischen, Oxyrase, Bildmedien, Rasierklinge, p200 piPette, reines Ethanol <ol><li> Beginnen Sie mit dem Vorwärmen der Bildmedien und Auftauen von 15 uL Aliquot Oxyrase. Achten Sie auf die lichtempfindliche Oxyrase vor Licht zu schützen. Die Zugabe von Oxyrase wird erheblich reduziert die Auswirkungen von Ausbleichen. </li><li> Vorwärmen valap, indem die Temperatur der Heizplatte zu gering. Nicht überhitzen / brennen valap es seine Wirksamkeit als Dichtstoff wird verlieren. </li><li> Wischen Sie den Knopf A Deckglas mit einem Kimwipe mit reinem Ethanol übergossen zu reinigen und zu entfernen kleine Trümmer. </li><li> Stack zwei gleich große Längen (2,5 cm lang) von doppelseitigem Klebeband auf der jeweils anderen, mit einem sauberen, ebenen Untergrund als Plattform. Drücken Sie eventuell eingeschlossene Luftblasen zu einer völlig flachen Ebene zu schaffen. </li><li> Mit einer Rasierklinge geschnitten zwei geraden Streifen entlang der Längsachse, so dass jeder Streifen 0,5 cm in der Breite misst. </li><li> Mit einer Pinzette, statt jedes Streifens an die lange Kante des Deckglas, so dass die zwei Streifen Klebeband eine Lücke in der Mitte Ihres Deckglas schafft. Drücken Sie vorsichtig auf das Band zu einem schönen Siegel mit dem Glas zu machen. Der Klebestreifen wird als Abstandshalter zwischen den Deckglas und dem Deckglas zu handeln. </li><li> Sicherstellen, dass die valap vollständig verflüssigt, bevor Sie den nächsten Schritt zu beginnen. </li><li> Rufen Sie Ihre vorgewärmten Bildmedien, Zugabe von 15 ul Oxyrase um alle 500 uL der Medien. </li><li> Falten Sie Kimwipes in Dreiecke zu erstellen 3 harte Kanten. Dies wird verwendet, um eine trockene Oberfläche für die Band zu schaffen, um auf dem Stick werden. </li><li> Rufen Sie Ihre Zellen aus dem Inkubator. Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases. Schnell Ort das Deckglas auf einem Kimwipe (cell Seite nach oben zeigt, nicht das Gewebe zu berühren), und verwenden Sie das gefaltete Kimwipe auf zwei gegenüberliegenden Seiten des Deckglases wischen, um einen halbtrockenen Oberfläche zu erzeugen (auf der Oberfläche, wo Ihre Zellen rest). </li><li> Mit einer Pinzette, schnappen Sie sich einen Ecke des Deckglases und legen Sie es auf Ihrem Deckglas, so dass die trockenen Oberflächen, die beiden Klebestreifen ausgerichtet sind. Beachten Sie, jetzt haben Sie zwei geschlossene Seiten und zwei offene Schlitze. Langsam Pipette 200 ul Ihre Imaging-media-Oxyrase Lösung nahe einer Öffnung. Wichtig ist, dass keine Luftblasen eingeführt werden. Die Lösung sollte bis in den neu zusammengestellten Kammer durch Kapillarkräfte gesaugt werden, damit voll Eintauchen Ihre Zellen in Lösung. </li><li> Mit einem Q-Tip dab die vier Ecken des Deckglases mit zerlassener valap schnell anbringen und Stabilisierung des Deckglas. Sie werden bemerken, dass die valap trocknet sofort (innerhalb von Sekunden bei Raumtemperatur). </li><li> Nun beginnt mit den offenen Seiten (non-Band auf dieser Seite), lag ein dünner Streifen valap mit einem Q-Tip und imitiert ein Bürsten Schlaganfall. Wiederholen Sie dies für den geschlossenen Seiten. Langsam bauen den Mantel des valap, stärkt damit die Dichtung durch die Wiederholung der Beschichtung Schritte. Die valap sollte, um die Kanten zu beschränken, so dass die Mitte des Deckglases klar. </li><li> Reinigen Sie das Mittelteil des Deckglases mit einem Q-Tip mit ddH2O um restliche Medien zu entfernen, wobei darauf bedacht, nicht in die Zellen zu vernichten. Wiederholen Sie die Reinigung mit reinem Ethanol. </li><li> Sie haben jetzt ein vollständig geschlossenes Bildgebung Kammer für Speckle-Imaging optimiert. Mit einem vollständig geschlossenen Gehäuse wird Ihr Fluorophore aus schnell Ausbleichen zu verhindern. </li></ol> Abschnitt 4: Imaging-Zellen Benötigte Materialien: invertiert Weitfeld Mikroskop Mecury Lampe, entsprechende Filter, gekühlte CCD-Kamera mit 6,7 Mikron-Pixel, hohe numerische Apertur, Öl-Immersions-Plan-Apochromat Objektive (60x bis 100x, Phase oder DIC). Vibration Tisch. Imaging-Software. <ol><li> Vorwärmen des Mikroskoptisches bis 37 Grad. Zeigen Sie mit der neu abgeschlossenen Bildgebung Kammer, und warten Sie 10-15 Minuten für die Temperatur, bevor Bildgebung zu stabilisieren. </li><li> Beginnen Sie mit der Fokussierung Ihre Zellen in Hellfeld-, und dann finden Sie Ihre injizierten Zellen durch Umschalten der richtigen Fluoreszenz-Einstellungen. Versuchen Sie, die Zeit der Fluoreszenz Exposition zu verringern Ausbleichen zu minimieren. </li><li> Suchen Sie nach injizierten Zellen, die gesunde gekrümmte Kanten haben. Over-injizierten Zellen (explodierte Zellen) wird zurückgezogen und gezackte Ränder charakterisiert werden, ähnlich wie zahlreiche Filopodien - vermeiden Bildgebung dieser Zellen. </li><li> Acquisition Einstellungen werden auf dem Zelltyp, die Qualität der markierten Aktin-und Mikroskop-Komponenten ab. Allerdings sollten die Belichtungseinstellungen nicht größer als 2 Sekunden, und das Zeitintervall zwischen den Bildern sollte zwischen 5 und 10 Sekunden eingestellt werden. Typische Längen für eine Zeitreihe (pro abgebildet Zelle) kann irgendwo zwischen 10 bis 30 Minuten betragen und wird durch Bleichen Effekte begrenzt. Gain-Einstellungen an der Kamera kann bis eingeschaltet werden, um das Signal-Rausch zu steigern. </li><li> Ideal Speckle-Eigenschaften sollte Speckle-Durchmesser auf den nächsten benachbarten Speckle jeweils ~ 2 Speckle-Abstand. Dies wird gewährleistet eine optimale räumliche und zeitliche Abtasten der Aktin-Struktur. Für Epithelzellen, die gesprenkelten Aktin-Netzwerk homogen erscheinen, mit Flecken gleichmäßig auseinander. Zelllinien, die dichte Stress Fasern oder Lamellipodien Funktionwird unterscheidbar sein, sondern eine punktierte / gesprenkelte Aussehen haben. Exposure-Einstellungen sollten angepasst werden, um die besten gesprenkelt Bilder zu bekommen. </li><li> Over-mikroinjiziert Zellen müssen dicht gepackt Sprenkel, die nicht angezeigt werden diskret. Stress-Fasern und die Lamellipodien verliert seine gepunktete Aussehen. </li><li> Under-mikroinjiziert Zellen erscheint sehr dunkel durch das Okular, mit Sprenkeln, die weit voneinander entfernt sind (&gt; 10 Sprenkel auseinander) und erscheinen nach dem Zufallsprinzip verteilt. Stress-Fasern und die Lamellipodien in diesen Zellen werden ununterscheidbar. </li><li> Key zu erhalten, &quot;gut&quot; Speckle-Filmen ist die Aufrechterhaltung konzentrieren. Dies ist besonders wichtig für die post-Analyse mit Speckle-Flow und Umsatz-Messungen. Dadurch wird die Qualität der quantitativen Analyse wird zum Sperren in den Fokus für die Dauer der Zeitraffer-abhängig. Dies kann besonders anspruchsvoll, wenn die Bildebene ist ziemlich dünn. Andere Faktoren, auf die Stabilität des Mikroskop-System, insbesondere die Bühne Gehäuse und der bildgebenden Kammer ab. Kontrast-basierten Fokussierung kann verwendet werden, wenn Bild-Intervall Länge ausreicht, um diese Funktion unterbringen werden. Weitere Optionen sind den Kauf eines Nah-Infrarot-basierte Fokus-System, das zuverlässige Echtzeit-Fokuseinstellungen bietet. Sie können diese Angebote von Nikon, Olympus und ASI zu finden. </li></ol> Abschnitt 5: qFSM Analyse Dieser Abschnitt ist nicht im Detail diskutiert, aber die Informationen über die Analyse-Software finden Sie hier [5] zu finden. Software Download-Anfragen finden Sie auf unserer Website (lccb.scripps.edu) vorgenommen werden. Behandelte Themen: <ul><li> Lärm-Kalibrierung </li><li> Speckle-Erkennung </li><li> Tracking mit einem hybriden Ansatz der Bildkorrelation-basiertes Tracking der groben Bewegung Speckle-Gebiete und einzelne Partikel-Tracking der detaillierten Bewegung einzelner Flecken. </li><li> Die Berechnung der Polymer-und Abbau Preise aus dem Intensitätsschwankungen während Speckle Erscheinen und Verschwinden Veranstaltungen. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mehrere wichtige Faktoren sind entscheidend für die erfolgreiche Bilder Speckle erhalten, beginnen aber gute Speckles und enden mit der Qualität Ihrer fluoreszenzmarkierten Aktin. Ein hoher Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer, um 0,4 bis 0,7 eingestellt wird sichergestellt, dass Flecken erscheinen hell und diskret, während das markierte Protein selbst sollte löslich und frei von Aggregaten. Ebenso wichtig ist die Mikroinjektion Verfahren. Um normalen Zell-Homöostase (und Überleben), müssen Zellen mit einer geri...

Injektionspuffer (IB) 50 mM Kalium-Glutamat 0,5 M MgCl2 (Anlage 2a) Speichern Sie bis zu 2 Jahre bei -20 ° C &nbsp; G-Puffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (Anhang 2a) 0,2 mM CaCl2 (Anlage 2a) Fügen Sie unmittelbar vor dem Gebrauch: 0,2 mM ATP (siehe Rezept für 100 mM) 0,5 mM 2-Mercaptoethanol Speichern Sie bis zu 1 Tag bei 4 ° C

live cell imaging von f-aktin dynamics über fluorescent speckle microscopy (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1 Zellen zu erfassen. Ein einzigartiger Vorteil der FSM ist seine Fähigkeit, die Bewegung und Umsatz Kinetik (Montage / Demontage) der F-Aktin-Netzwerk innerhalb lebender Zellen zu erfassen. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Ermittlung quantitativer Messungen von F-Aktin-Dynamik, wenn sie mit Computer-Vision-Software (qFSM) gepaart. Wir beschreiben die Auswahl, die Mikroinjektion und Visualisierung von Fluoreszenz-Aktin-Sonden in lebenden Zellen. Wichtig ist, dass ähnliche Verfahren für die Visualisierung von anderen macomolecular Baugruppen. FSM hat für Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Haftung Komplexe nachgewiesen.

Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In diesem Protokoll beschreiben wir den Einsatz der Fluoreszenz-Speckle-Mikroskopie (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1-Zellen aufzunehmen. Ein einzigartiges ...

Mittels Fluoreszenzmarkierungsmikroskopie können die Dynamiken verschiedener zytoskelettaler Proteine in lebenden Zellen untersucht werden. Bei korrekter Anwendung lassen sich quantitative Messungen der Geschwindigkeit und des Umsatzkinetik zytoskelettaler Proteine durchführen. Wir beginnen dieses Verfahren, indem wir eine kleine Menge fluoreszenzmarkiertes Aktin in lebende Zellen mikroinjizieren.Anschließend bauen wir die Abbildungskammer zusammen, um die Auswirkungen der Photobleiche zu verringern. Zunächst werden zwei Streifen doppelseitiges Klebeband auf beiden Seiten des Objektträgers angebracht, auf dem unsere Deckglasplatte liegen wird. Danach wird das Bildgebungsmedium mit einer Pipette in die Kammer gegeben, indem man das Medium in die Nähe eines der offenen Schlitze abgibt.Zuletzt werden alle vier Seiten mit Valet versiegelt. Hallo, mein Name ist James Lim vom Labor von Galden's Deucer in der Abteilung für Zellbiologie am Scripps Research Institute. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur fluoreszenten Fleckenmikroskopie zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren, um die Aktindynamik in wandernden epithelialen Zellen zu untersuchen. Beginnen wir also. Eine Schlüsselkomponente für die Aufnahme guter Fluoreszenzmarkierungsmikroskopie-Aufnahmen ist die korrekte Markierung von Aktin. Mit dem Fluorophor Ihrer Wahl empfehlen wir die Verwendung von Fluorophoren der Alexa- und X-Rodin-Cin-Reihe, mittlere Esterderivate, die exponierte Lysinreste auf der Oberfläche von Aktin gezielt markieren.Es ist wichtig, dass das Markierungsverhältnis hoch ist, etwa 0,3 bis 0,7 Farbstoffe pro Aktin-Monomer, um sicherzustellen, dass die Flecken vor der Langzeitlagerung hell und deutlich sichtbar erscheinen. Klären Sie die markierte Aktin-Lösung durch Zentrifugation bei 75.000 bis 80.000 × g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Das markierte Aktin sollte in G-Pufferlösung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Bereiten Sie Aliquote von zwei Mikrolitern vor, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden, da dies zu unlöslichen Aggregaten führen kann. Um eine Photobleiche der floralen Vierer zu vermeiden, setzen Sie die markierte Aktinlösung nicht über längere Zeiträume direktem Licht aus und verwenden Sie für die Langzeitlagerung opake Mikrozentrifugenröhrchen. Die Zellen für die Mikroinjektion auf saurem Wege gereinigten quadratischen Glasdeckeln.Die Standardbeschichtung des Substrats kann auf das Deckglas aufgebracht werden und beeinträchtigt die Mikroinjektion nicht. Lagern Sie die Zellen bei 37 Grad, während das Aktin vorbereitet wird, um Zellen auszuwählen, die für die Mikroinjektion geeignet sind. Berücksichtigen Sie bei der FSM folgende Kriterien.Die Zellen sollten groß sein, einen Durchmesser von mehr als 50 Mikrometern aufweisen, nach dem Ansäen flach auswachsen und von Natur aus an Substrate binden. Es ist außerdem hilfreich, wenn das Isolationsgebiet der Zelle eine größere Fläche als ihr Kern einnimmt. Zu geeigneten Zelllinien gehören PTK1, Lungenzellen von Molchen und AIA-Neuronen.In dieser Demonstration injizieren wir PTK in epitheliale Zellen. Die richtige Auswahl der Mikroinjektionsnadeln hängt von der Größe der Öffnung an der Nadelspitze ab. Typischerweise können die Lochgrößen zwischen 0,5 Mikrometern und bis zu drei Mikrometern variieren.Wir empfehlen eine optimale Öffnungsgröße zwischen 0,5 und einem Mikrometer. Für die Injektion können Mikroinjektionsnadeln entweder gekauft oder selbst hergestellt werden. Wenn ein handelsüblicher Nadelextraktor verfügbar ist, empfehlen wir für Anfänger, 10 bis 20 gezogene Nadeln vor Beginn des Injektionsverfahrens bereitzuhalten.Der nächste Schritt besteht darin, das markierte Acton mit eiskaltem Injektionspuffer zu verdünnen. Halten Sie alle Arbeitslösungen auf Eis. Die ideale Injektionskonzentration, also die Endkonzentration des in die Nadel gefüllten Actons, liegt zwischen 0,5 und einem Mikrogramm pro Mikroliter.Basierend auf einem Markierungsverhältnis von 40 % von D zu Aktin-Monomer beladen Sie 0,5 bis einen Mikroliter der verdünnten Aktinlösung auf. Geben Sie die Aktinlösung vorsichtig mit einer Mikrospritze ab. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.Wenn Blasen vorhanden sind, können diese leicht entfernt werden, indem überschüssige Flüssigkeit um die Blase herum aufgenommen wird. Stellen Sie sicher, dass die Acton-Lösung vollständig an der Nadelspitze anliegt. Es sollte keine überschüssige Lösung entlang des Kapillarrandes der Nadel vorhanden sein, da dies den Injektionsfluss stören könnte.Die beladene Nadel ist nun bereit, am Injektionshalter für die Mikroinjektion befestigt zu werden. Entnehmen Sie Ihre Zellen dem Inkubator und legen Sie den Deckgläser auf den Mikroskopständer. Um das Mikroinjektionsverfahren zu beginnen, bringen Sie die beladene Nadel zum Mikroskop.Befestigen Sie die Nadel vorsichtig am Injektorhalter, wobei die Nadelspitze nicht berührt werden darf. Positionieren Sie den Halter so, dass die Nadel einen Winkel von 35 bis 50 Grad zur Basis des Mikroskopstages bildet. Senken Sie die Nadelspitze ab, bis sie gerade die Oberfläche des umgebenden Mediums durchbricht.Positionieren Sie nun die Zellen so, dass die Nadelspitze direkt über dem Zentrum des Objektivs steht. Wenn die Nadelspitze mit dem Objektiv ausgerichtet ist, sollten Sie durch das Okular einen hellen Halo sehen. Dies ist das Ende der Nadelspitze.Ein langsames Hin- und Herbewegen der Nadel kann helfen, den Halo besser zu lokalisieren. Achten Sie beim Navigieren darauf, dass sich die Nadelspitze deutlich über Ihren Zellen befindet. Um ein Abbrechen der Nadelspitze zu vermeiden, stellen Sie den Z-Fokus am Mikroskop so ein, dass Ihre Zellen deutlich sichtbar sind.Senken Sie dann langsam die Nadelspitze ab, während Sie den Fokus kontrollieren, bis der Lichthof sich allmählich verengt und schließlich in der Nadelspitze zusammenläuft. Sie können auch nach dem Nadelschaft Ausschau halten, der lineare Schatten wirft. Durch das Absenken der Nadel wird der Nadelschaft nach und nach sichtbar.Kleine Anpassungen des Phasenrings können erforderlich sein, um den Kontrast zu verbessern; sowohl die Nadelspitze als auch Ihre Zellen sollten nun deutlich sichtbar sein. Beim Auswählen der Zellen, die injiziert werden sollen, sollten Zellen mit freien Rändern der Nadelspitze zugewandt sein. Dadurch wird sichergestellt, dass die abfallende Zellkontur vom dicksten Punkt, an dem sich der Zellkern befindet, bis hin zum dünnsten Punkt der vorderen Kante auf die Nadelspitze trifft, anstatt parallel zu ihr zu verlaufen.Stellen Sie den Nadel-Druck auf 0,3 bis 0,8 PSI ein. Der konstante Druck bewirkt einen gleichmäßigen Fluss der Aktin-Lösung. Sobald Sie sich für eine Zelle zur Injektion entschieden haben, positionieren Sie die Nadel so, dass die Spitze langsam neben dem Zellkern liegt, senken Sie sie ab und justieren Sie die Position der Nadel nach, bis die Spitze eindringt.Die Membran schrittweise absenken, bis die Nadelspitze die Membran durchdrungen hat. Wenn die Nadel die Membran vollständig durchdrungen hat, erscheint die Zelle heller. Sobald Sie diese Veränderung sehen, heben Sie die Nadel an, bis sie die Zelle nicht mehr berührt.Der eigentliche Einstich- und Injektionsvorgang dauert 0,5 bis zwei Sekunden. Bei korrekter Durchführung bleibt die Zellform unverändert. Um die Belastung der Zellen zu minimieren, sollte jede Mikroinjektionssitzung nicht länger als 20 bis 45 Minuten dauern.Manchmal sind möglicherweise keine Veränderungen an der Zelle zu beobachten, wenn die Injektion durchgeführt wird, und die Zelle wird nicht heller. Dies deutet darauf hin, dass die Nadelspitze verstopft sein könnte. Sie können dies überprüfen, indem Sie gegebenenfalls die Reinigungstaste an Ihrem Trans-Injektor betätigen.Wenn die Nadelspitze offen ist, erhöht sich der konstante Druckfluss erheblich, was sich in Form von Wellenmustern und der Streuung benachbarter Rückstände zeigt. Wenn die Nadelspitze geschlossen ist, können Sie entweder eine neue Mikroinjektionsnadel einsetzen oder versuchen, die Nadelspitze zu brechen, indem Sie die Nadel vorsichtig absenken, bis deren Spitze gegen die Glasdecke drückt, wodurch das äußerste Ende der Spitze abbricht.Der Bruchbereich sollte nicht mehr als ein Fünftel der Fläche der Nadelspitze betragen, also des Teils der Nadel, der sich zur Spitze hin verjüngt, wenn die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Ersetzen Sie das Zellmedium in der Petrischale durch frisches, vorgewärmtes Medium, um etwaige fluoreszierende Rückstände zu entfernen. Nach dem Mediumwechsel lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang in einem 37-Grad-Inkubator regenerieren, bevor die Bildgebung erfolgt.Dadurch kann das Aktin während der Regeneration der Zellen im Brutschrank in das vorhandene Zytoskelettnetzwerk integrieren, während gleichzeitig der Aufbau der Bildgebungsanordnung beginnt. Erwärmen Sie zunächst das Bildgebungsmedium in einem 37-Grad-Wasserbad vor. Danach tauen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot von Oxa-Erase bei Raumtemperatur auf.Die Zugabe von RA zum Medium zu einem späteren Zeitpunkt verringert die Auswirkungen der Photobleiche stark. Wenn die Oxa-Lösung in Aluminiumfolie eingewickelt aufbewahrt wird, ist sichergestellt, dass die lichtempfindliche Verbindung vor Licht geschützt ist. Das VAP-Siegelmittel vorwärmen, indem es auf einem Heizpult bei niedriger Temperatur erhitzt wird; das VAP darf nicht überhitzen oder verbrennen, da es sonst seine Wirksamkeit als Siegelmittel verliert.Reinigen Sie einen Mikroobjektträger, indem Sie ihn mit einem mit reinem Ethanol getränkten Kim-Tuch abwischen, um Schmutz und kleine Rückstände zu entfernen. Stapeln Sie zwei gleich große Stücke doppelseitiges Klebeband, jeweils 2,5 Zentimeter lang, auf einer sauberen, flachen Oberfläche wie einem weiteren Mikroobjektträger übereinander. Drücken Sie als Unterlage etwa eingeschlossene Luftblasen heraus, um eine vollständig ebene Fläche zu erzeugen.Verwenden Sie anschließend ein Rasiermesser, um zwei gerade Streifen entlang der langen Achse des Klebebands zu schneiden, sodass jeder Streifen eine Breite von 0,5 Zentimetern aufweist. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette jeden Streifen entlang der langen Kanten Ihres Objektträgers, sodass die beiden Klebebandstreifen eine Lücke in der Mitte Ihres Objektträgers bilden. Drücken Sie vorsichtig auf das Klebeband, um eine gute Abdichtung mit dem Glas zu erzielen.Diese Klebestreifen dienen als Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas. Überprüfen Sie das Ventil, um sicherzustellen, dass es vollständig verflüssigt ist. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, holen Sie Ihr vorgewärmtes Bildgebungsmedium ab.Geben Sie 15 µL Oxy Rays pro 500 µL Medium hinzu. Falten Sie ein Chem-Tuch zu einem Dreieck, um drei scharfe Kanten zu erzeugen. Dies wird später zum Abwischen des Deckgläschens verwendet.Holen Sie die Zellen mit einer Pinzette aus dem Inkubator. Greifen Sie schnell eine Ecke der Deckglasplatte. Legen Sie die Deckglasplatte auf ein Kim-Tuch mit der Zellseite nach oben, sodass diese die Gewebeoberfläche nicht berührt, und verwenden Sie das gefaltete Kim-Tuch, um zwei gegenüberliegende Seiten der Deckglasplatte abzuwischen, um eine halbtrockene Oberfläche zu erzeugen.Nehmen Sie dann eine Ecke der Deckglas mit einer Pinzette auf und legen Sie das Deckglas auf den Objektträger, sodass die trockenen Flächen an den beiden Klebestreifen ausgerichtet sind. Beachten Sie, dass Sie nun zwei geschlossene Seiten und zwei offene Schlitze haben. Pipettieren Sie langsam 200 Mikroliter Ihrer Imaging-Medien-RA-Lösung nahe einer Öffnung.Es ist wichtig, keine Luftblasen einzuführen. Die Lösung sollte durch Kapillarkräfte in die neu zusammengesetzte Kammer aufsteigen, sodass Ihre Zellen vollständig von der Lösung umgeben sind. Mit einem Wattestäbchen befestigen und stabilisieren Sie die vier Ecken Ihrer Deckglasabdeckung schnell, indem Sie sie mit geschmolzenem Vap bestreichen.Sie werden feststellen, dass das VAP innerhalb von Sekunden bei Raumtemperatur trocknet. Tragen Sie dann, beginnend mit den geschlossenen Seiten, einen dünnen Streifen VAP mit dem Wattestäbchen auf, wobei Sie eine Pinselbewegung nachahmen. Wiederholen Sie den Vorgang für die offenen Seiten.Bauen Sie die VAP-Schicht langsam auf und verstärken Sie die Abdichtung, indem Sie die Beschichtungsschritte wiederholen. Das VAP sollte auf die Ränder begrenzt werden, sodass die Mitte des Deckgläschens frei bleibt. Nachdem die Ränder des Deckgläschens versiegelt sind, reinigen Sie den mittleren Bereich des Deckgläschens vorsichtig mit einem Wattestäbchen und destilliertem H2O, um restliche Medien zu entfernen.Seien Sie vorsichtig, um die Zellen nicht zu zerquetschen. Wiederholen Sie diesen Reinigungsschritt mit reinem Ethanol. Sie verfügen nun über eine vollständig geschlossene Abbildungskammer, die für die Fluoreszenzmarkierungsbildgebung optimiert ist.Ein vollständig abgedichteter Behälter verhindert, dass Ihre fluoreszierenden Farbstoffe schnell ausbleichen. Die Zellen in der vollständig verschlossenen Kammer sind nun bereit für die Bildgebung. Wir verwenden ein invertiertes Weitfeldmikroskop mit einer Quecksilberlampe, Epibeobachtung, geeigneten Filtern und einem Ölimmersionsplanobjektiv.Apochromatische Objektivbilder werden mit einer gekühlten CCD-Kamera mit 6,7-Mikrometer-Pixeln und einer Bildakquisitionssoftware aufgenommen. Heizen Sie den Mikroskoptisch auf 37 Grad vor. Platzieren Sie die Abbildungskammer und warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis sich die Temperatur vor der Bildaufnahme stabilisiert hat.Sobald die Temperatur stabil ist, fokussieren Sie Ihre Zellen im Hellfeld und suchen Sie dann Ihre injizierten Zellen, indem Sie die entsprechenden fluoreszenten Einstellungen aktivieren. Versuchen Sie, die Belichtungszeit mit Fluoreszenzlicht so kurz wie möglich zu halten, um Photobleichen zu vermindern. Achten Sie auf injizierte Zellen mit gesunden, gekrümmten Vorderkanten.Überinjizierte Zellen zeichnen sich durch zurückgezogene und gezackte Ränder aus, die zahlreichen Filopodien ähneln. Diese Zellen nicht abbilden. Die Aufnahmeeinstellungen hängen von der Zellart, der Qualität des markierten Aktins und der Mikroskopkomponenten ab.Jedoch sollten die Belichtungseinstellungen nicht länger als zwei Sekunden sein, und das Zeitintervall zwischen den Einzelbildern sollte zwischen fünf und 10 Sekunden eingestellt werden. Die Verstärkung (Gain) der Kamera kann erhöht werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Ideale Bildfeldcharakteristika weisen auf, dass jeder Bildfeldpunkt etwa um zwei Bildfelddurchmesser vom nächsten benachbarten Bildfeldpunkt entfernt ist.Für epitheliale Zellen erscheint das gesprenkelte Aktin-Netzwerk homogen mit gleichmäßig verteilten Sprenkeln. Die Belichtungseinstellungen sollten angepasst werden, um die besten gesprenkelten Bilder zu erhalten.Der Schlüssel zur Erzielung guter Bildfelderfilme liegt in der Beibehaltung des Fokus. Dies ist besonders wichtig für die nachträgliche Analyse, die Messungen zur Bildfelddynamik und -erneuerung beinhaltet. Daher hängt die Qualität der quantitativen Analyse davon ab, den Fokus während der gesamten Zeitspanne stabil zu halten.Verschiedene Strategien zur Aufrechterhaltung der Fokussierung sind im Text beschrieben; für diese Demonstration wird das Nikon Perfect-Focus-System verwendet. Hier sind verschiedene Beispiele von mikroinjizierten Zellen. Das linke Feld zeigt eine untermikroinjizierte Zelle mit einem Bild geringer Konzentrationssprengung.Das mittlere Feld zeigt eine übermikroinjizierte Zelle mit einem zu hohen Konzentrations-Punktemuster, und das rechte Feld zeigt eine optimal injizierte Zelle. Für die FSM mit einem guten Punktemuster. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man fluoreszenzmarkiertes Aktin in epitheliale Zellen für die fluoreszenzmarkierte Punktemikroskopie mikroinjiziert.Bei diesem Verfahren ist es äußerst wichtig, daran zu denken, dass die Qualität Ihres markierten Aktins sowie die Mikroinjektionstechnik die Gesamtqualität Ihrer Fleckenbilder bestimmen werden. Das war's – viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

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Biology

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