Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Mittels Fluoreszenzmarkierungsmikroskopie können die Dynamiken verschiedener zytoskelettaler Proteine in lebenden Zellen untersucht werden. Bei korrekter Anwendung lassen sich quantitative Messungen der Geschwindigkeit und des Umsatzkinetik zytoskelettaler Proteine durchführen. Wir beginnen dieses Verfahren, indem wir eine kleine Menge fluoreszenzmarkiertes Aktin in lebende Zellen mikroinjizieren.

Anschließend bauen wir die Abbildungskammer zusammen, um die Auswirkungen der Photobleiche zu verringern. Zunächst werden zwei Streifen doppelseitiges Klebeband auf beiden Seiten des Objektträgers angebracht, auf dem unsere Deckglasplatte liegen wird. Danach wird das Bildgebungsmedium mit einer Pipette in die Kammer gegeben, indem man das Medium in die Nähe eines der offenen Schlitze abgibt.

Zuletzt werden alle vier Seiten mit Valet versiegelt. Hallo, mein Name ist James Lim vom Labor von Galden's Deucer in der Abteilung für Zellbiologie am Scripps Research Institute. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur fluoreszenten Fleckenmikroskopie zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die Aktindynamik in wandernden epithelialen Zellen zu untersuchen. Beginnen wir also. Eine Schlüsselkomponente für die Aufnahme guter Fluoreszenzmarkierungsmikroskopie-Aufnahmen ist die korrekte Markierung von Aktin. Mit dem Fluorophor Ihrer Wahl empfehlen wir die Verwendung von Fluorophoren der Alexa- und X-Rodin-Cin-Reihe, mittlere Esterderivate, die exponierte Lysinreste auf der Oberfläche von Aktin gezielt markieren.

Es ist wichtig, dass das Markierungsverhältnis hoch ist, etwa 0,3 bis 0,7 Farbstoffe pro Aktin-Monomer, um sicherzustellen, dass die Flecken vor der Langzeitlagerung hell und deutlich sichtbar erscheinen. Klären Sie die markierte Aktin-Lösung durch Zentrifugation bei 75.000 bis 80.000 × g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Das markierte Aktin sollte in G-Pufferlösung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Bereiten Sie Aliquote von zwei Mikrolitern vor, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden, da dies zu unlöslichen Aggregaten führen kann. Um eine Photobleiche der floralen Vierer zu vermeiden, setzen Sie die markierte Aktinlösung nicht über längere Zeiträume direktem Licht aus und verwenden Sie für die Langzeitlagerung opake Mikrozentrifugenröhrchen. Die Zellen für die Mikroinjektion auf saurem Wege gereinigten quadratischen Glasdeckeln.

Die Standardbeschichtung des Substrats kann auf das Deckglas aufgebracht werden und beeinträchtigt die Mikroinjektion nicht. Lagern Sie die Zellen bei 37 Grad, während das Aktin vorbereitet wird, um Zellen auszuwählen, die für die Mikroinjektion geeignet sind. Berücksichtigen Sie bei der FSM folgende Kriterien.

Die Zellen sollten groß sein, einen Durchmesser von mehr als 50 Mikrometern aufweisen, nach dem Ansäen flach auswachsen und von Natur aus an Substrate binden. Es ist außerdem hilfreich, wenn das Isolationsgebiet der Zelle eine größere Fläche als ihr Kern einnimmt. Zu geeigneten Zelllinien gehören PTK1, Lungenzellen von Molchen und AIA-Neuronen.

In dieser Demonstration injizieren wir PTK in epitheliale Zellen. Die richtige Auswahl der Mikroinjektionsnadeln hängt von der Größe der Öffnung an der Nadelspitze ab. Typischerweise können die Lochgrößen zwischen 0,5 Mikrometern und bis zu drei Mikrometern variieren.

Wir empfehlen eine optimale Öffnungsgröße zwischen 0,5 und einem Mikrometer. Für die Injektion können Mikroinjektionsnadeln entweder gekauft oder selbst hergestellt werden. Wenn ein handelsüblicher Nadelextraktor verfügbar ist, empfehlen wir für Anfänger, 10 bis 20 gezogene Nadeln vor Beginn des Injektionsverfahrens bereitzuhalten.

Der nächste Schritt besteht darin, das markierte Acton mit eiskaltem Injektionspuffer zu verdünnen. Halten Sie alle Arbeitslösungen auf Eis. Die ideale Injektionskonzentration, also die Endkonzentration des in die Nadel gefüllten Actons, liegt zwischen 0,5 und einem Mikrogramm pro Mikroliter.

Basierend auf einem Markierungsverhältnis von 40 % von D zu Aktin-Monomer beladen Sie 0,5 bis einen Mikroliter der verdünnten Aktinlösung auf. Geben Sie die Aktinlösung vorsichtig mit einer Mikrospritze ab. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.

Wenn Blasen vorhanden sind, können diese leicht entfernt werden, indem überschüssige Flüssigkeit um die Blase herum aufgenommen wird. Stellen Sie sicher, dass die Acton-Lösung vollständig an der Nadelspitze anliegt. Es sollte keine überschüssige Lösung entlang des Kapillarrandes der Nadel vorhanden sein, da dies den Injektionsfluss stören könnte.

Die beladene Nadel ist nun bereit, am Injektionshalter für die Mikroinjektion befestigt zu werden. Entnehmen Sie Ihre Zellen dem Inkubator und legen Sie den Deckgläser auf den Mikroskopständer. Um das Mikroinjektionsverfahren zu beginnen, bringen Sie die beladene Nadel zum Mikroskop.

Befestigen Sie die Nadel vorsichtig am Injektorhalter, wobei die Nadelspitze nicht berührt werden darf. Positionieren Sie den Halter so, dass die Nadel einen Winkel von 35 bis 50 Grad zur Basis des Mikroskopstages bildet. Senken Sie die Nadelspitze ab, bis sie gerade die Oberfläche des umgebenden Mediums durchbricht.

Positionieren Sie nun die Zellen so, dass die Nadelspitze direkt über dem Zentrum des Objektivs steht. Wenn die Nadelspitze mit dem Objektiv ausgerichtet ist, sollten Sie durch das Okular einen hellen Halo sehen. Dies ist das Ende der Nadelspitze.

Ein langsames Hin- und Herbewegen der Nadel kann helfen, den Halo besser zu lokalisieren. Achten Sie beim Navigieren darauf, dass sich die Nadelspitze deutlich über Ihren Zellen befindet. Um ein Abbrechen der Nadelspitze zu vermeiden, stellen Sie den Z-Fokus am Mikroskop so ein, dass Ihre Zellen deutlich sichtbar sind.

Senken Sie dann langsam die Nadelspitze ab, während Sie den Fokus kontrollieren, bis der Lichthof sich allmählich verengt und schließlich in der Nadelspitze zusammenläuft. Sie können auch nach dem Nadelschaft Ausschau halten, der lineare Schatten wirft. Durch das Absenken der Nadel wird der Nadelschaft nach und nach sichtbar.

Kleine Anpassungen des Phasenrings können erforderlich sein, um den Kontrast zu verbessern; sowohl die Nadelspitze als auch Ihre Zellen sollten nun deutlich sichtbar sein. Beim Auswählen der Zellen, die injiziert werden sollen, sollten Zellen mit freien Rändern der Nadelspitze zugewandt sein. Dadurch wird sichergestellt, dass die abfallende Zellkontur vom dicksten Punkt, an dem sich der Zellkern befindet, bis hin zum dünnsten Punkt der vorderen Kante auf die Nadelspitze trifft, anstatt parallel zu ihr zu verlaufen.

Stellen Sie den Nadel-Druck auf 0,3 bis 0,8 PSI ein. Der konstante Druck bewirkt einen gleichmäßigen Fluss der Aktin-Lösung. Sobald Sie sich für eine Zelle zur Injektion entschieden haben, positionieren Sie die Nadel so, dass die Spitze langsam neben dem Zellkern liegt, senken Sie sie ab und justieren Sie die Position der Nadel nach, bis die Spitze eindringt.

Die Membran schrittweise absenken, bis die Nadelspitze die Membran durchdrungen hat. Wenn die Nadel die Membran vollständig durchdrungen hat, erscheint die Zelle heller. Sobald Sie diese Veränderung sehen, heben Sie die Nadel an, bis sie die Zelle nicht mehr berührt.

Der eigentliche Einstich- und Injektionsvorgang dauert 0,5 bis zwei Sekunden. Bei korrekter Durchführung bleibt die Zellform unverändert. Um die Belastung der Zellen zu minimieren, sollte jede Mikroinjektionssitzung nicht länger als 20 bis 45 Minuten dauern.

Manchmal sind möglicherweise keine Veränderungen an der Zelle zu beobachten, wenn die Injektion durchgeführt wird, und die Zelle wird nicht heller. Dies deutet darauf hin, dass die Nadelspitze verstopft sein könnte. Sie können dies überprüfen, indem Sie gegebenenfalls die Reinigungstaste an Ihrem Trans-Injektor betätigen.

Wenn die Nadelspitze offen ist, erhöht sich der konstante Druckfluss erheblich, was sich in Form von Wellenmustern und der Streuung benachbarter Rückstände zeigt. Wenn die Nadelspitze geschlossen ist, können Sie entweder eine neue Mikroinjektionsnadel einsetzen oder versuchen, die Nadelspitze zu brechen, indem Sie die Nadel vorsichtig absenken, bis deren Spitze gegen die Glasdecke drückt, wodurch das äußerste Ende der Spitze abbricht.

Der Bruchbereich sollte nicht mehr als ein Fünftel der Fläche der Nadelspitze betragen, also des Teils der Nadel, der sich zur Spitze hin verjüngt, wenn die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Ersetzen Sie das Zellmedium in der Petrischale durch frisches, vorgewärmtes Medium, um etwaige fluoreszierende Rückstände zu entfernen. Nach dem Mediumwechsel lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang in einem 37-Grad-Inkubator regenerieren, bevor die Bildgebung erfolgt.

Dadurch kann das Aktin während der Regeneration der Zellen im Brutschrank in das vorhandene Zytoskelettnetzwerk integrieren, während gleichzeitig der Aufbau der Bildgebungsanordnung beginnt. Erwärmen Sie zunächst das Bildgebungsmedium in einem 37-Grad-Wasserbad vor. Danach tauen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot von Oxa-Erase bei Raumtemperatur auf.

Die Zugabe von RA zum Medium zu einem späteren Zeitpunkt verringert die Auswirkungen der Photobleiche stark. Wenn die Oxa-Lösung in Aluminiumfolie eingewickelt aufbewahrt wird, ist sichergestellt, dass die lichtempfindliche Verbindung vor Licht geschützt ist. Das VAP-Siegelmittel vorwärmen, indem es auf einem Heizpult bei niedriger Temperatur erhitzt wird; das VAP darf nicht überhitzen oder verbrennen, da es sonst seine Wirksamkeit als Siegelmittel verliert.

Reinigen Sie einen Mikroobjektträger, indem Sie ihn mit einem mit reinem Ethanol getränkten Kim-Tuch abwischen, um Schmutz und kleine Rückstände zu entfernen. Stapeln Sie zwei gleich große Stücke doppelseitiges Klebeband, jeweils 2,5 Zentimeter lang, auf einer sauberen, flachen Oberfläche wie einem weiteren Mikroobjektträger übereinander. Drücken Sie als Unterlage etwa eingeschlossene Luftblasen heraus, um eine vollständig ebene Fläche zu erzeugen.

Verwenden Sie anschließend ein Rasiermesser, um zwei gerade Streifen entlang der langen Achse des Klebebands zu schneiden, sodass jeder Streifen eine Breite von 0,5 Zentimetern aufweist. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette jeden Streifen entlang der langen Kanten Ihres Objektträgers, sodass die beiden Klebebandstreifen eine Lücke in der Mitte Ihres Objektträgers bilden. Drücken Sie vorsichtig auf das Klebeband, um eine gute Abdichtung mit dem Glas zu erzielen.

Diese Klebestreifen dienen als Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas. Überprüfen Sie das Ventil, um sicherzustellen, dass es vollständig verflüssigt ist. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, holen Sie Ihr vorgewärmtes Bildgebungsmedium ab.

Geben Sie 15 µL Oxy Rays pro 500 µL Medium hinzu. Falten Sie ein Chem-Tuch zu einem Dreieck, um drei scharfe Kanten zu erzeugen. Dies wird später zum Abwischen des Deckgläschens verwendet.

Holen Sie die Zellen mit einer Pinzette aus dem Inkubator. Greifen Sie schnell eine Ecke der Deckglasplatte. Legen Sie die Deckglasplatte auf ein Kim-Tuch mit der Zellseite nach oben, sodass diese die Gewebeoberfläche nicht berührt, und verwenden Sie das gefaltete Kim-Tuch, um zwei gegenüberliegende Seiten der Deckglasplatte abzuwischen, um eine halbtrockene Oberfläche zu erzeugen.

Nehmen Sie dann eine Ecke der Deckglas mit einer Pinzette auf und legen Sie das Deckglas auf den Objektträger, sodass die trockenen Flächen an den beiden Klebestreifen ausgerichtet sind. Beachten Sie, dass Sie nun zwei geschlossene Seiten und zwei offene Schlitze haben. Pipettieren Sie langsam 200 Mikroliter Ihrer Imaging-Medien-RA-Lösung nahe einer Öffnung.

Es ist wichtig, keine Luftblasen einzuführen. Die Lösung sollte durch Kapillarkräfte in die neu zusammengesetzte Kammer aufsteigen, sodass Ihre Zellen vollständig von der Lösung umgeben sind. Mit einem Wattestäbchen befestigen und stabilisieren Sie die vier Ecken Ihrer Deckglasabdeckung schnell, indem Sie sie mit geschmolzenem Vap bestreichen.

Sie werden feststellen, dass das VAP innerhalb von Sekunden bei Raumtemperatur trocknet. Tragen Sie dann, beginnend mit den geschlossenen Seiten, einen dünnen Streifen VAP mit dem Wattestäbchen auf, wobei Sie eine Pinselbewegung nachahmen. Wiederholen Sie den Vorgang für die offenen Seiten.

Bauen Sie die VAP-Schicht langsam auf und verstärken Sie die Abdichtung, indem Sie die Beschichtungsschritte wiederholen. Das VAP sollte auf die Ränder begrenzt werden, sodass die Mitte des Deckgläschens frei bleibt. Nachdem die Ränder des Deckgläschens versiegelt sind, reinigen Sie den mittleren Bereich des Deckgläschens vorsichtig mit einem Wattestäbchen und destilliertem H2O, um restliche Medien zu entfernen.

Seien Sie vorsichtig, um die Zellen nicht zu zerquetschen. Wiederholen Sie diesen Reinigungsschritt mit reinem Ethanol. Sie verfügen nun über eine vollständig geschlossene Abbildungskammer, die für die Fluoreszenzmarkierungsbildgebung optimiert ist.

Ein vollständig abgedichteter Behälter verhindert, dass Ihre fluoreszierenden Farbstoffe schnell ausbleichen. Die Zellen in der vollständig verschlossenen Kammer sind nun bereit für die Bildgebung. Wir verwenden ein invertiertes Weitfeldmikroskop mit einer Quecksilberlampe, Epibeobachtung, geeigneten Filtern und einem Ölimmersionsplanobjektiv.

Apochromatische Objektivbilder werden mit einer gekühlten CCD-Kamera mit 6,7-Mikrometer-Pixeln und einer Bildakquisitionssoftware aufgenommen. Heizen Sie den Mikroskoptisch auf 37 Grad vor. Platzieren Sie die Abbildungskammer und warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis sich die Temperatur vor der Bildaufnahme stabilisiert hat.

Sobald die Temperatur stabil ist, fokussieren Sie Ihre Zellen im Hellfeld und suchen Sie dann Ihre injizierten Zellen, indem Sie die entsprechenden fluoreszenten Einstellungen aktivieren. Versuchen Sie, die Belichtungszeit mit Fluoreszenzlicht so kurz wie möglich zu halten, um Photobleichen zu vermindern. Achten Sie auf injizierte Zellen mit gesunden, gekrümmten Vorderkanten.

Überinjizierte Zellen zeichnen sich durch zurückgezogene und gezackte Ränder aus, die zahlreichen Filopodien ähneln. Diese Zellen nicht abbilden. Die Aufnahmeeinstellungen hängen von der Zellart, der Qualität des markierten Aktins und der Mikroskopkomponenten ab.

Jedoch sollten die Belichtungseinstellungen nicht länger als zwei Sekunden sein, und das Zeitintervall zwischen den Einzelbildern sollte zwischen fünf und 10 Sekunden eingestellt werden. Die Verstärkung (Gain) der Kamera kann erhöht werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Ideale Bildfeldcharakteristika weisen auf, dass jeder Bildfeldpunkt etwa um zwei Bildfelddurchmesser vom nächsten benachbarten Bildfeldpunkt entfernt ist.

Für epitheliale Zellen erscheint das gesprenkelte Aktin-Netzwerk homogen mit gleichmäßig verteilten Sprenkeln. Die Belichtungseinstellungen sollten angepasst werden, um die besten gesprenkelten Bilder zu erhalten.

Der Schlüssel zur Erzielung guter Bildfelderfilme liegt in der Beibehaltung des Fokus. Dies ist besonders wichtig für die nachträgliche Analyse, die Messungen zur Bildfelddynamik und -erneuerung beinhaltet. Daher hängt die Qualität der quantitativen Analyse davon ab, den Fokus während der gesamten Zeitspanne stabil zu halten.

Verschiedene Strategien zur Aufrechterhaltung der Fokussierung sind im Text beschrieben; für diese Demonstration wird das Nikon Perfect-Focus-System verwendet. Hier sind verschiedene Beispiele von mikroinjizierten Zellen. Das linke Feld zeigt eine untermikroinjizierte Zelle mit einem Bild geringer Konzentrationssprengung.

Das mittlere Feld zeigt eine übermikroinjizierte Zelle mit einem zu hohen Konzentrations-Punktemuster, und das rechte Feld zeigt eine optimal injizierte Zelle. Für die FSM mit einem guten Punktemuster. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man fluoreszenzmarkiertes Aktin in epitheliale Zellen für die fluoreszenzmarkierte Punktemikroskopie mikroinjiziert.

Bei diesem Verfahren ist es äußerst wichtig, daran zu denken, dass die Qualität Ihres markierten Aktins sowie die Mikroinjektionstechnik die Gesamtqualität Ihrer Fleckenbilder bestimmen werden. Das war's – viel Erfolg bei Ihren Experimenten.