Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen

- Beginnen Sie mit gewaschenen pelletierten Würmern und fügen Sie Lysepuffer hinzu, der SDS, ein Detergens, und DTT, ein Reduktionsmittel, enthält. Dadurch wird die schützende Kutikula des Wurms abgebaut und der Körper ist der Zelldissoziation ausgesetzt. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber dem Lysepuffer, um die Zelllyse und den Zelltod zu minimieren.

Entfernen Sie anschließend die Lysereagenzien mit mehreren Waschgängen mit Kälteisolationspuffer. Es ist wichtig, dass dieser Puffer die richtige Osmolarität hat, um den Zelltod zu verhindern. Verwenden Sie ein Protease-Enzym, um Zell-zu-Zell-Verbindungen aufzubrechen. Unterstützen Sie den Homogenisierungsprozess zusammen mit mechanischer Energie, indem Sie die Mischung gegen die Tubenwand pipettieren.

Fügen Sie Medien hinzu, die Serum enthalten, um die Enzymreaktion zu stoppen, und Antibiotika, um eine Kontamination zu verhindern. Pelletieren und waschen Sie die Probe mehrmals, um den größten Teil des Schmutzes zu entfernen.

Legen Sie das Rohr schließlich auf Eis, um eine Schwerkraftsedimentation zu ermöglichen. Ablagerungen, einschließlich Reste der Kutikula oder Zellklumpen, setzen sich ab, während dissoziierte Zellen in der obersten Schicht des Mediums suspendiert bleiben. Diese Zellen können für die kurzfristige Kultivierung oder zur Isolierung spezifischer Zellpopulationen durch FACS oder Immunpräzipitation verwendet werden.

Im Beispielprotokoll werden wir transgene Würmer, die GFP exprimieren, in Neuronen von Interesse dissoziieren, um diese Zellen zu isolieren und zu analysieren.

- Nachdem Sie die Tiere eingesammelt haben, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1.600 g g. Entfernen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie die Würmer wieder in 1 Milliliter M9-Medien. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1.600 mal g, um die Würmer zu pelletieren. Fügen Sie dann 200 Mikroliter SDS-DDT-Puffer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Würmer sollten nun entlang des Körpers faltig erscheinen, wenn man sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet.

Fügen Sie dann 800 Mikroliter eiskalten Isolationspuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen leicht bewegen. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 13.000 g und bei 4 Grad Celsius, um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 1 Milliliter Isolationspuffer

Wiederholen Sie diesen Zentrifugations- und Waschvorgang insgesamt fünfmal und achten Sie darauf, den Isolationspuffer jedes Mal vorsichtig zu entfernen. Geben Sie danach 100 Mikroliter Proteasemischung aus Streptomyces griseus, gelöst in Isolationspuffer, in das Pellet

10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stellen Sie sicher, dass Sie einen mechanischen Aufschluss herstellen, indem Sie mit der 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze 60 bis 70 Mal auf und ab pipettieren. Um das Stadium des Aufschlusses zu bestimmen, entfernen Sie 1 bis 5 Mikroliter der Aufschlussmischung, lassen Sie sie auf einen Objektträger fallen und untersuchen Sie sie mit einem Gewebekulturmikroskop.

Nach fünf bis sieben Minuten sollten die Wurmfragmente eine sichtbar reduzierte Kutikula aufweisen und ein Zellschlamm ist gut sichtbar. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 900 Mikroliter des im Handel erhältlichen L15-Mediums von Leibovitz hinzufügen, das mit 10 % FBS und Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.

Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 10.000 g und 4 Grad Celsius, um isolierte Fragmente und Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die pelletierten Zellen noch zweimal mit kalten, mit L15 angereicherten Medien mit 1 Milliliter Medium pro Waschgang. Die pelletierten Zellen in 1 Milliliter L15-zugesetztem Medium erneut suspendieren und 30 Minuten auf Eis belassen.

Nehmen Sie dann die oberste Schicht, die etwa 700 bis 800 Mikroliter beträgt, und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zelldichte von 10 bis 25 Mikrolitern isolierter Zellen zu messen.