C. elegans Blastomer-Dissektion: Eine Methode zur Entfernung der Eierschale und zur Dissoziation embryonaler Zellen

- Verwenden Sie für diese Dissektion zwei Mikropipetten: eine mit einer Öffnung, die etwa so breit wie eine Eizelle ist, und eine mit einer doppelt so breiten Öffnung, und eine Reihe von Lösungen, die in Vertiefungen angeordnet sind, um einen schnellen Transfer zwischen ihnen zu ermöglichen.

Zuerst legen Sie adulte Hermaphroditen in eine Eisalzlösung, die osmotisch ausgeglichen ist, um ein Platzen der Embryonen zu verhindern. Schneiden Sie die Würmer in zwei Hälften, um die sich entwickelnden Embryonen freizusetzen.

Identifizieren Sie dann Embryonen im Zweizellstadium. Diese Zellen sind die Blastomere, die durch die Teilung der befruchteten Eizelle gebildet werden. Verwenden Sie die Mikropipette mit der größeren Öffnung, um einen Embryo in eine Hypochloritlösung, Bleichmittel, zu übertragen, die beginnt, die schützende Eierschale aufzubrechen.

Nach nur 40 bis 55 Sekunden übertragen Sie den Embryo auf das Wachstumsmedium von Shelton (SGM). Waschen Sie jeden Embryo kurz in zwei Vertiefungen SGM, um alle Spuren des Bleichmittels zu entfernen, bevor Sie ihn in eine dritte Vertiefung legen.

Verwenden Sie nun die kleinere Mikropipette, um den Embryo wiederholt zu pipettieren und die mechanische Kraft zum Entfernen der Eischale und zum Freilegen der Blastomere bereitzustellen. Fahren Sie vorsichtig mit dem Pipettieren des Embryos fort, um die einzelnen Blastomerzellen zu trennen. Im folgenden Protokoll werden wir diese Technik in Aktion sehen.

- Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare mit der rechten und linken Hand auf ein Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern. Ziehen Sie die Mikrokapillare zu beiden Enden, um Spannung auszuüben, und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu bilden.

Schneiden Sie unter dem Präpariermikroskop die Spitzen der von Hand gezogenen Kapillaren mit einer Pinzette ab. Machen Sie die beiden Spitzenöffnungsgrößen ungefähr das Zweifache bzw. das Einfache der kurzen Achsenlänge von C. elegans-Embryonen für den Embryotransfer bzw. die Entfernung der Eierschale.

Befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät. Pipettieren Sie 45 Mikroliter Eisalzlösung in eine Vertiefung eines Multi-Well-Objektträgers.

5 bis 10 adulte C. elegans auf die Vertiefung setzen. Um frühe C. elegans-Embryonen zu erhalten, schneiden Sie adulte Embryonen in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links vom Körper von C. elegans positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben.

Pipettieren Sie 45 Mikroliter Hypochloritlösung in eine Vertiefung neben der Vertiefung mit der Eisalzlösung und pipettieren Sie 45 Mikroliter des Shelton-Wachstumsmediums in die folgenden drei Vertiefungen. Embryonen im Einzelzellstadium und im frühen Zweizellstadium mit der Mundpipette mit größerer Öffnung in die Hypochoritlösung geben und 40 bis 55 Sekunden warten.

Waschen Sie die Embryonen, indem Sie sie mit Sheltons Wachstumsmedium jeweils 1 bis 2 Sekunden in die nächsten drei Vertiefungen übertragen. Wiederholen Sie mit der handgezogenen Kapillare mit einer kleineren Öffnung vorsichtig das Pipettieren des Embryos, um die Eierschale zu entfernen.

Danach kontinuierlich mit der handgezogenen Kapillare pipettieren, um die embryonalen Blastomere im Zweizellstadium zu trennen.

- Minimieren Sie nach der Entfernung der Eierschale die Kraft beim Auf- und Abpipettieren der Embryonen, um ein Platzen zu verhindern.