Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen C. elegans Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in vitro embryonale, elegante Meereszellen zu dissoziieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst große Mengen von Grabtieren gezüchtet werden. Als nächstes werden Eier von erwachsenen Erwachsenen isoliert.

Dann werden die Eier mit Chitinase behandelt, um die Eierschale aufzulösen. Schließlich werden die Zellen für die Kultivierung manuell dissoziiert und plattiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expression zellspezifischer Marker durch Immunfluoreszenz, Mikroskopie, Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebungsverfahren zeigen.

Demonstriert wird das Verfahren von rel ti, einem Postdoc-Labor. Nach der Kultivierung von mindestens vier Tellern Meereseleganz bis zum GR-Erwachsenenstadium und der Vorbereitung von Medien und Lösungen gemäß dem Textprotokoll. Beginnen Sie mit der Isolierung der Eizellen, indem Sie zuerst ein Röhrchen mit zuvor vorbereiteter Erdnusslektin-Stammlösung scheffeln.

Legen Sie die Autoklaven-Deckgläser in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte und geben Sie 200 Mikroliter Erdnusslektin in jedes Deckblatt, das mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wird. Saugen Sie anschließend die Lösung ab und verwenden Sie steriles Wasser, um die Vertiefungen zu waschen. Einmal alle Spuren von Erdnusslektin entfernen, um ein Verklumpen der Zellen zu verhindern.

Waschen Sie dann mit sterilem Autoklavenwasser die GR-Erwachsenen von den Agarplatten ab und sammeln Sie die Suspension in zwei sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen bis zu fünf Minuten lang auf Eis, damit sich die Würmer am Boden absetzen können. Entfernen Sie mit einer Transferpipette das Wasser und ersetzen Sie es durch eine frische, sterile Autoklav-Wasserzentrifuge. Die Würmer bei 200 g für 10 Minuten.

Nach der letzten Wäsche wiederbeleben, die Würmer in frischem sterilem Wasser suspendieren und in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen, bevor sie erneut 10 Minuten lang bei 200 g geschleudert werden. Wenn die Würmer nicht vollständig pelletiert sind, legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis. Sobald sich die Würmer vollständig abgesetzt haben, entfernen Sie das Wasser und fügen Sie fünf bis sechs Milliliter Lyselösung hinzu.

Schütteln Sie dann die Suspension vorsichtig für fünf bis 10 Minuten und alle zwei bis drei Minuten, geben Sie einen Tropfen Suspension auf ein Deckglas und prüfen Sie die Lyse unter einem Stereomikroskop. Wenn 72 80 % der Würmer lysiert sind, stoppen Sie die Lysereaktion, indem Sie neun Milliliter Eipuffer hinzufügen, bevor Sie von diesem Punkt an schleudern, zünden Sie einen Bunsenbrenner an und lassen Sie ihn eingeschaltet, um eine erneute Kontamination der Eier zu verhindern, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie das Pellet mit Eipuffer drei- bis viermal gründlich, bis die Lösung klar ist. Nachdem Sie den letzten Überstand entfernt haben, um die Eier von der Reanimation der Tierkadaver zu trennen, suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern sterilem Eipuffer und fügen Sie zwei Milliliter 60%ige Saccharose in den Eipuffer hinzu.

Die Eier gut in Lösung mischen, bevor sie 20 Minuten lang zentrifugieren. Bei 200 g die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge nehmen. Die Eier schwimmen oben in der Lösung.

Verwenden Sie daher eine Pipette und sterile Ein-Milliliter-Spitzen, um die Eier in ein frisches, steriles konisches 15-Liter-Röhrchen zu füllen. Verwenden Sie sterilen Eipuffer, um die Eier dreimal zu waschen, während Sie unter einer Laminar-Flow-Haube arbeiten. Um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden, reansieren Sie die pelletierten Eier, suspendieren Sie sie in einem Milliliter von zwei Milligramm pro Milliliterkinase und geben Sie sie in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Schütteln Sie das Röhrchen je nach Frische des Enzyms 10 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, wenn etwa 80 % der Eierschalen verdaut sind. Die Eier bei 900 g drei Minuten lang zentrifugieren. Nach vorsichtiger Entfernung des Überstands fügen Sie drei Milliliter L 15 Medium hinzu, geben Sie die Eier in eine Platte mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern und beginnen Sie mit der manuellen Dissoziation mit einer sterilen 10-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel.

Um den Grad der Dissoziation zu überwachen, geben Sie einen Tropfen Suspension in eine frische Petrischale und betrachten Sie sie unter einem Mikroskop. Fahren Sie fort, bis etwa 80 % der Zellen dissoziiert sind. Um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpfte Larven zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension vorsichtig durch einen Fünf-Mikron-Filter und lassen Sie weitere vier bis fünf Milliliter L 15-Medium durch den Filter laufen, um die Zellen für die Kultivierung der Zellen zurückzugewinnen.

Nach dem Zentrifugieren des Filtrats bei 900 g für drei Minuten werden die Zellen in vollständigem L 15-Medium, das einen Milliliter pro Vertiefung abgespielt wird, erneut suspendiert und die Platten in einer feuchten, verschlossenen Kammer bei 20 Grad Celsius an der Umgebungsluft gelagert. Um isolierte embryonale Eleganzellen zu unterscheiden, müssen sie an einem Substrat haften. Der Differenzierungsprozess beginnt etwa zwei bis drei Stunden nach dem Plattieren und dauert etwa 24 Stunden.

Die morphologischen Merkmale in vitro sind denen in vivo bemerkenswert ähnlich. Wie hier gezeigt, entwickeln beispielsweise ein LM- und ein PLM-Berührungsneuron nur zwei neuronale Prozesse, von denen einer länger ist als der andere, wie dies in vivo der Fall ist. Dies deutet darauf hin, dass zumindest einige der molekularen Mechanismen, die die Differenzierung in Eleganzellen antreiben, zellautonom sind und daher rekapituliert werden können.

In vitro können auch Proteinmarker und posttranslationale Modifikationen, die zellspezifisch sind, in vitro beobachtet werden. Zum Beispiel ist Alpha-Tubulin ein gesättigtes nur in Berührungsneuronen in Meer-Elgan, wie hier in vitro gezeigt, Prozesse von Berührungsneuronen färben sich mit einem Antikörper, der gegen ein gesättigtes Alpha-Tubulin erhoben wird. Und darüber hinaus, wie in diesem Panel zu sehen ist, exprimieren kultivierte Berührungsneuronen den toxischen Mutantenkanal MEC vier D, der in vivo tatsächlich zum Tod von Berührungsneuronen führt.

GFP-exprimierende Neuronen, die aus einem MEC four DPE 4G FP-Stamm hergestellt wurden, sind zunächst in Kultur vorhanden, degenerieren dann aber. Genau wie in vivo können die Zellen jedoch durch eine Behandlung mit einem IDE und Dantrolen, wie hier gezeigt, vor dem Tod gerettet werden. Patch-Clamp-Techniken werden verwendet, um Kaliumonik, onische, nicht-selektive und Dopamintransporter-abhängige Kanäle in meereskultivierten Zellen zu untersuchen.

Aufgrund der geringen Größe der Zelle müssen Glaspipetten eine kleine Spitze und dann einen breiten Kegel haben, um den erhöhten Eingangswiderstand auszugleichen. Darüber hinaus wird ein größerer Erfolg erzielt, wenn ein Hochspannungsimpuls an das Membranpflaster unter der Spitze der Pipette angelegt wird, anstatt durch Sog Zugang zur gesamten Zelle zu erhalten, der die Zelle beschädigen kann. Um die Rolle der spannungsgesteuerten Kalziumkanäle zu untersuchen, wird ION vier in dieser Abbildung verwendet, um die Membran zu permieren und Berührungsneuronen zu kalibrieren, die das Chamäleon YC zwei Punkt 12 für die Kalziumbildgebung in Abwesenheit oder Anwesenheit von Kalzium exprimieren.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Konzentration an freiem Kalzium in Berührungsneuronen 200 nanomolare Molare beträgt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man vitro isoliert und kultiviert. Seht die Eleganz, die embryonalen Zellen.